Studii imunologice în urologie

Prescrierea unei imunograme unui pacient urologic înseamnă că medicul curant suspectează prezența unor tulburări ale sistemului imunitar. Infecțiile bacteriene, virale, fungice recurente, manifestările alergice, bolile sistemice pot fi semne ale acestor tulburări, care se caracterizează printr-o serie de sindroame (infecțios, oncologic, alergic, autoimun, limfoproliferativ). Un pacient poate avea mai multe sindroame. De exemplu, bolile infecțioase cronice (sindromul infecțios) pot provoca imunodeficiență, iar imunodeficiența se poate manifesta ca o predispoziție la boli infecțioase și oncologice (sindromul oncologic). Predispoziția la infecții poate apărea pe fondul imunodeficienței secundare, care s-a dezvoltat ca urmare a unei boli limfoproliferative, cum ar fi leucemia. Există trei grupe principale de modificări patologice ale sistemului imunitar:

• deficiență cantitativă sau funcțională a uneia sau altei verigi a sistemului imunitar, care duce la dezvoltarea unei stări de imunodeficiență;
• o tulburare în recunoașterea antigenelor de către sistemul imunitar, care duce la dezvoltarea proceselor autoimune;
• un răspuns imun hiperreactiv sau „pervertit”, manifestat prin dezvoltarea unor boli alergice.

Există metode de imunodiagnostic de screening (teste de nivel 1) și de clarificare (teste de nivel 2). Primele există pentru a înregistra tulburările sistemului imunitar, cele din urmă - pentru a stabili mecanismele implicate în implementarea lor în scopul unei imunocorecții ulterioare.

Imunitatea celulelor B

Metode de screening

• Determinarea numărului relativ și absolut de limfocite B utilizând imunofluorescență sau citofluorometrie în flux cu anticorpi monoclonali împotriva antigenelor celulelor B (CD19, CD20, unde CD reprezintă clustere de diferențiere). Conținutul normal de limfocite B la adulți este de 8-19% din numărul total de leucocite sau 190-380 celule/μl. O creștere a conținutului de limfocite B apare în infecțiile bacteriene și fungice acute și cronice, bolile hepatice cronice, bolile țesutului conjunctiv sistemic, leucemia limfocitară cronică și mielom.
• Determinarea concentrației imunoglobulinelor nespecifice (F, M, G, E) prin imunodifuzie radială simplă, nefelometrie sau turbometrie, radioimunotest sau imunotest enzimatic (ELISA). Norme pentru adulți: imunoglobulină (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 0,3-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. O creștere a concentrației de imunoglobuline apare în aceleași condiții patologice în care apare o creștere a conținutului de limfocite B. O scădere a concentrației de imunoglobuline apare în hipogamaglobulinemia congenitală, neoplasmele sistemului imunitar, îndepărtarea splinei, pierderea de proteine, bolile renale sau intestinale, tratamentul cu citostatice și imunosupresoare.

Metode de clarificare

• Determinarea complexelor imune circulante în sânge prin precipitare selectivă în polietilen glicol, urmată de testarea densității spectrofotometrice (normal 80-20 U). O creștere a complexelor imune circulante este tipică pentru infecțiile acute bacteriene, fungice, virale, bolile autoimune, bolile cu complexe imune, boala serului, reacțiile alergice de tip 3;
• Determinarea imunoglobulinelor specifice din sânge în raport cu antigenele bacteriene și virale, acidul dezoxiribonucleic (ADN) în bolile autoimune, detectarea anticorpilor antispermatici (infertilitate autoimună) și antirenali (pielonefrită și glomerulonefrită) prin imunodifuzie radială sau metoda ELISA.
• Determinarea anticorpilor antispermatici în spermatozoizi [test MAR (reacție mixtă antiglobulinică)], rezultat normal - negativ.
• Determinarea concentrației de imunoglobuline în urină în scopul diagnosticului diferențial între pielonefrită și glomerulonefrită (selectivitatea proteinuriei).
• Determinarea conținutului de IgE în sucul prostatic în scopul diagnosticării prostatitei alergice utilizând metoda imunodifuziei radiale sau ELISA.
• Studiul răspunsului în reacția de transformare blastică a limfocitelor B la mitogenul celulelor B (mitogen din Caryophyllaceae pentru stimularea reacției de transformare blastică a limfocitelor B în prezența limfocitelor T), a cărui valoare normativă este de 95-100%.

Legătura imunității cu celulele T

Metode de screening

• Determinarea numărului relativ și absolut de limfocite T CD3 mature prin reacție de imunofluorescență sau citofluorometrie în flux utilizând anticorpi monoclonali anti-CD3. Norma pentru adulți este de 58-76% sau 1100-1700 celule/μl. O scădere a numărului de limfocite T este un indicator al insuficienței legăturii celulare a imunității. Acest lucru este tipic pentru unele imunodeficiențe secundare și primare (infecții bacteriene și virale cronice: tuberculoză, sindromul imunodeficienței dobândite, tumori maligne, insuficiență renală cronică, leziuni, stres, îmbătrânire, malnutriție, tratament cu citostatice, expunere la radiații ionizante). O creștere a numărului de limfocite T apare pe fondul hiperactivității imune sau în bolile limfoproliferative. În cazul inflamației, numărul de limfocite T crește mai întâi și apoi scade. Absența unei scăderi a limfocitelor T indică un proces inflamator cronic.
• Evaluarea subpopulațiilor de limfocite.
  • Determinarea numărului de celule T-helpere (anticorpi anti-CD4). În mod normal 36-55% sau 400-1100 celule/mcl. O creștere a numărului acestor celule apare în bolile autoimune, boala Waldenstrom, activarea imunității antitransplant; o scădere a numărului de celule T-helpere apare în infecțiile cronice bacteriene, virale, protozoare, tuberculoză, sindromul imunodeficienței dobândite, tumori maligne, arsuri, leziuni, malnutriție, îmbătrânire, tratament cu citostatice, expunere la radiații ionizante.
  • Determinarea numărului de T-supresori (anticorpi anti-CD4). În mod normal 17-37% sau 300-700 celule/μl. O creștere a numărului de T-supresori are loc în aceleași condiții în care numărul de T-helperi scade, iar scăderea acestora are loc în aceleași condiții în care conținutul de T-helperi crește.
  • Indicele imunoreglator CD4/CD8, în mod normal 1,5-2,5. Hiperactivitate cu valori peste 2,5 (boli alergice și autoimune); hipoactivitate - sub 1,0 (predispoziție la infecții cronice). La începutul procesului inflamator, indicele imunoreglator crește, iar când acesta scade, se normalizează.

Metode de clarificare

• Determinarea numărului de celule killer naturale (celule NK) - anticorpi anti-CD16 și anti-CD56. Norma pentru limfocitele CD 16 este de 6-26%, CD56 - 9-19%. O creștere a numărului de celule NK apare în timpul respingerii transplantului, o scădere - în cazul infecțiilor virale, cancerului, imunodeficiențelor primare și secundare, arsurilor, leziunilor și stresului, tratamentului cu citostatice și expunerii la radiații ionizante.
• Determinarea numărului de limfocite T cu receptor pentru interleukina-2 (marker de activare) - anticorpi anti-CD25. Norma este de 10-15%. O creștere a numărului acestora se observă în bolile alergice, respingerea transplantului, răspunsul la antigenele dependente de timus în perioada acută a infecției primare, o scădere - în aceleași boli în care există o scădere a numărului de celule NK.
• Studiul expresiei markerului de activare - molecula de histocompatibilitate de clasa II HLA-DR. Expresia crescută apare în procesele inflamatorii, la pacienții cu hepatită C, boală celiacă, sifilis, boli respiratorii acute.
• Evaluarea apoptozei limfocitelor. O idee aproximativă despre gradul de pregătire a limfocitelor pentru apoptoză poate fi determinată prin exprimarea receptorului Fas (CD95) pe suprafața lor și a proto-oncogenei bd-2 din mitocondrii. Apoptoza limfocitelor este evaluată prin tratarea acestora cu doi coloranți fluorescenți: iodură de propidiu, care se leagă de fragmente de ADN, și anexina Y, care se leagă de fosfatidilserină, care apare pe membrana celulară la debutul apoptozei. Rezultatele sunt evaluate folosind un citofluorometru de flux. Rezultatele sunt calculate pe baza raportului dintre celulele colorate cu diferiți coloranți. Celulele necolorate sunt viabile, celulele legate doar de anexina Y sunt manifestări precoce ale apoptozei, cele legate doar de iodură de propidiu și anexina Y sunt manifestări tardive ale apoptozei, iar colorarea doar cu iodură de propidiu indică necroză.
• Evaluarea proliferării limfocitelor T in vitro.
  • Modificări în blastogeneza celulară - reacția de transformare a blaștilor limfocitari. Leucocitele sunt incubate cu orice mitogen de origine vegetală (lectine). Fitohemaglutinina este cel mai adesea utilizată timp de 72 de ore, apoi se prelevează un frotiu, se colorează și se numără numărul de blaști! Indicele de stimulare este raportul dintre procentul de celule transformate din experiment (cultură cu fitohemaglutinină) și procentul de celule transformate din control (cultură fără fitohemaglutinină). Reacția de transformare a blaștilor limfocitari poate fi evaluată prin includerea unui marker radioactiv (ZN-timan) în celulele cultivate, deoarece sinteza ADN-ului crește în timpul diviziunii celulare. Tulburări ale răspunsului proliferativ apar atât în imunodeficiențele primare, cât și în cele secundare asociate cu infecții, cancer, insuficiență renală și intervenții chirurgicale.
  • În aceste studii, se evaluează expresia markerilor de activare (CD25, receptorul transferinei - CD71) și a moleculei complexului major de histocompatibilitate clasa II HLA-DR, care sunt practic absente pe limfocitele T în repaus. Limfocitele T sunt stimulate cu fitohemaglutinină, iar după 3 zile expresia markerilor de activare este analizată prin metoda reacției de imunofluorescență directă sau indirectă, citofluorometrie în flux, utilizând anticorpi monoclonali împotriva receptorilor izolați.
  • Măsurarea cantității de mediatori sintetizați de limfocitele T activate [interleukină (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon etc.] utilizând radioimunotest sau ELISA. De o importanță deosebită este evaluarea concentrației de γ-interferon și IL-4 ca markeri ai Th1 și Th2 în supernatantul culturilor activate și în interiorul celulei. Dacă este posibil, este util să se determine expresia genelor pentru citokina corespunzătoare prin nivelul acidului ribonucleic matriceal din celula producătoare și intensitatea expresiei receptorilor pentru citokinele corespunzătoare.
    
• Reacția de inhibare a migrării limfocitelor. Limfocitele T sensibilizate, în reacție cu antigenul, secretă limfokine, inclusiv factori care inhibă migrarea limfocitelor. Fenomenul de inhibare se observă atunci când mitogenii sunt introduși în cultura celulară. Evaluarea gradului de inhibare ne permite să apreciem capacitatea limfocitelor de a secreta citokine. În mod normal, frecvența migrării, în funcție de mitogenul specific, este de 20-80%.
• Evaluarea citotoxicității celulelor NK. Se determină capacitatea celulelor natural killer de a ucide celulele țintă din linia eritromieloidă K-562. Dacă se evaluează citotoxicitatea dependentă de anticorpi, se utilizează celule țintă acoperite cu anticorpi IgG. Celulele țintă sunt marcate cu 3H-uridină și incubate cu celule efectoare. Moartea celulelor țintă se evaluează prin eliberarea markerului radioactiv în soluție. O scădere a citotoxicității apare în neoplasmele maligne. În unele cazuri, când este necesar să se prezică eficacitatea tratamentului cu interleukine, citotoxicitatea celulelor NK se evaluează în timpul incubării cu anumite citokine.

Studiul funcției fagocitelor

Metode de screening

Studiul intensității absorbției celulelor microbiene de către fagocite (fagocitoza particulelor de latex, cultura test de stafilococ, E. coli sau microorganisme izolate de la pacient). Prin centrifugare a sângelui heparinizat, se izolează o suspensie de leucocite, se adaugă ser de grupă sanguină IV pentru opsonizare (opsoninele sunt proteine care amplifică fagocitoza). Suspensia microbiană este diluată, amestecată cu leucocite și incubată timp de 120 de minute, prelevându-se probe pentru analiză la 30, 90 și 120 de minute după începerea incubării. Din suspensia de leucocite colectată se fac frotiuri. Se determină următorii indicatori de fagocitoză:

• indicele fagocitar - procentul de celule care au intrat în fagocitoză în decurs de 30 de minute și 120 de minute de incubare; valoarea standard a indicelui fagocitar (30) este de 94%, indicele fagocitar (120) este de 92%;
• numărul fagocitar - numărul mediu de bacterii situate intracelular; valoarea standard a numărului fagocitar (30) este de 11%, numărul fagocitar (120) este de 9,8%;
• coeficientul numărului fagocitar - raportul dintre numărul fagocitar (30) și numărul fagocitar (120); în mod normal 1,16;
• Indicele bactericid al neutrofilelor - raportul dintre numărul de microbi uciși în interiorul fagocitelor și numărul total de microbi absorbiți; în mod normal 66%.

Metode de clarificare

• Studiul capacității bactericide a fagocitelor în testul cu nitroalbastru de tetrazoliu (NBT) - testul NBT. Leucocitelor li se adaugă colorant galben nitroalbastru de tetrazoliu. Când un neutrofil absoarbe colorantul, are loc un proces de reducere sub influența radicalilor liberi de oxigen, rezultând o colorație albastră. Reacția se efectuează pe o placă cu fund plat cu 96 de godeuri. Soluția Hanks (NBT spontan) se adaugă în primele trei godeuri cu un amestec de NBT și leucocite, iar în al doilea se adaugă particule de latex; amestecul se incubează la 37°C timp de 25 de minute. Rezultatele se citesc la 540 nm pe un cititor și se exprimă în unități arbitrare. Se calculează coeficientul de stimulare (Kst ₎, egal cu raportul dintre densitatea optică din godeurile stimulate și densitatea optică medie din godeurile fără stimulare. La persoanele sănătoase, NBT _spontan = 90 ± 45 CU, NBT _stimulat = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78±0,36.
• Studiul moleculelor de adeziune. Citofluorometria în flux este utilizată pentru a determina expresia antigenelor de suprafață CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Imunodeficiențele cu aderență afectată se manifestă prin infecții recurente, vindecare lentă a rănilor și absența puroiului în focarele de infecție.

Studiul sistemului complementului

Metode de screening

Determinarea activității hemolitice a complementului este un studiu al căii clasice de activare a complementului. Diferite diluții de ser de la o persoană bolnavă și sănătoasă sunt adăugate la eritrocite de berbec acoperite cu anticorpi. Unitatea de activitate hemolitică este reciprocul diluției de ser la care 50% din eritrocite sunt distruse. Gradul de hemoliză este estimat fotometric prin eliberarea hemoglobinei în soluție. O scădere a activității hemolitice a complementului se observă în lupusul eritematos sistemic cu afectare renală, glomerulonefrita acută, imunodeficiențe combinate, miastenie, hepatită virală, limfoame, o creștere - în icter obstructiv, tiroidita Hashimoto, reumatism, artrită reumatoidă, periarterita nodulară, dermatomiozită, infarct miocardic, colită ulcerativă, sindrom Reiter, gută.

Metode de clarificare

• Determinarea componentelor complementului. Determinarea cantitativă se efectuează prin imunodifuzie radială și nefelometrie.
  Studiul nu este informativ decât dacă proprietățile antigenice ale componentelor complementului sunt modificate.
• S-a stabilit că componenta Clq a complementului amplifică fagocitoza și mediază citotoxicitatea celulară. Scăderea acesteia apare în bolile complexelor imune, lupusul eritematos sistemic, infecțiile purulente și tumorile.
• Componenta C3 este implicată în activarea căilor clasice și alternative ale complementului. O scădere a concentrației sale este asociată cu infecții bacteriene și fungice cronice, prezența complexelor imune circulante sau tisulare.
• Componenta C4 este implicată în activarea căii clasice. O scădere a concentrației sale este asociată cu activarea prelungită a complementului prin complexe imune și o scădere a concentrației inhibitorului C1, care controlează activarea căii clasice a complementului. Deficiența de C4 apare în lupusul eritematos sistemic, o creștere a C4 apare în bolile renale, respingerea transplantului, inflamația acută și bolile gastrointestinale.
• C5a este un mic fragment al moleculei C5, care este desprins din aceasta ca urmare a activării sistemului complement. Concentrația sa crește în timpul inflamației, sepsisului, bolilor atopice și alergice.
• Inhibitorul de Cl este un factor multifuncțional. Acesta controlează activarea componentei C1 a complementului, inhibă activitatea kalicreinei, plasminei și factorului Hageman activat, proteazelor Cls și Or. Deficiența inhibitorului de C1 duce la angioedem.
• studii funcționale ale complementului. Serul testat este adăugat la un ser standard, căruia îi lipsește orice componentă a complementului, și se determină activitatea hemolitică a acestuia. Dacă activitatea hemolitică nu este restabilită la normal, se consideră că activitatea acestei componente a complementului în serul testat este redusă.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]