Cercetări imunologice în urologie

Alocarea unei imunograme unui pacient urologic înseamnă că medicul curant acceptă prezența tulburărilor sistemului imunitar. Duplicate infecții bacteriene, virale, fungice, reacții alergice, boli sistemice pot fi simptome ale acestor tulburări, care sunt caracterizate printr-un număr de sindroame (infectie, cancer, alergice, autoimune, limfoproliferative). Un pacient poate avea mai multe sindroame. De exemplu, bolile infecțioase cronice (sindromul infectios) poate provoca deficit imun și deficit imun se poate manifesta predispozitie la bolile infectioase si cancerul (sindromul cancerului). Predispoziția la infecții poate apărea pe fundalul unei imunodeficiențe secundare, care sa dezvoltat ca urmare a unei boli limfoproliferative, de exemplu leucemie. Există trei grupuri principale de modificări patologice în sistemul imunitar:

• insuficiența cantitativă sau funcțională a uneia sau a altei legături de imunitate, care conduce la dezvoltarea unei stări de imunodeficiență;
• o încălcare a recunoașterii antigenului de către sistemul imunitar, conducând la dezvoltarea proceselor autoimune;
• hiperreactiv sau "pervertit", răspuns imun, manifestat prin dezvoltarea bolilor alergice.

Există screening-ul (teste de nivelul 1) și metode de calificare (teste ale celor două niveluri) ale imunodiagnosticilor. Primul există pentru a repara încălcările în sistemul imunitar, acesta din urmă - pentru a stabili mecanismele implicate în punerea lor în aplicare în scopul imunocorectării ulterioare.

Legătura B-celulară a imunității

Metode de screening

• Determinarea numărului relativ și absolut de limfocite B prin imunofluorescență sau debit citometric folosind anticorpi monoclonali la antigeni ai celulei B (CD19, CD20, în care CD - mănunchi de diferențiere). Conținutul limfocitelor B este normal la adulți: 8-19% din numărul total de leucocite sau 190-380 celule / μl. Creșterea conținutului de limfocite B apare în infecții bacteriene și fungice acute si cronice, boli hepatice cronice, boli ale țesutului conjunctiv sistemice, leucemie limfocitară cronică, mielom multiplu.
• Determinarea concentrației de imunoglobuline nespespetsificheskih (F, M, G, E) prin imunodifuzia unică radială sau nefelometrie turbometrii, radioimunoanaliza sau imunoenzimatice (EIA). Norme pentru adulți: imunoglobulină (Ig) A 0,9-4,5 g / l. IgM 03-3,7 g / l. IgG 8,0-17 g / l. O creștere a concentrației de imunoglobuline are loc în aceleași condiții patologice în care are loc o creștere a conținutului de limfocite B. Reducerea concentrației de imunoglobuline este în hipogamaglobulinemie congenitale, tumori ale sistemului imunitar, îndepărtarea splinei, pierderea de proteine, în boli ale rinichilor sau intestine, tratamentul cu citostatice și immunodepreesantami.

Specificarea metodelor

• Determinarea complexelor imune circulante din sânge prin precipitare selectivă în polizilen glicol urmată de testarea densității spectrofotometrice (normală 80-20 UE). Creșterea complexelor imune circulante este caracteristică infecțiilor acute bacteriene, fungice, virale, autoimune, imunocomplex, boală serică, reacții alergice de tip 3;
• Determinarea imunoglobulinelor specifice în sânge în legătură cu antigene bacteriene și virale, acidul dezoxiribonucleic (ADN), în bolile autoimune, identificarea spermei (infertilitate autoimună) și anticorpi protivopochechnyh (pielonefrite și glomerulonefrita) prin imunodifuzia radiale sau ELISA.
• Determinarea anticorpilor antispermici în spermatozoizi [testul MAR (reacție antiglobulină mixtă]], norma este negativă.
• Determinarea concentrației imunoglobulinelor în urină în scopul diagnosticului diferențial între pielonefrită și glomerulonefrită (selectivitatea proteinuriei).
• Determinarea IgE în sucul de prostată pentru diagnosticarea prostatitei alergice prin imunodifuzie radială sau ELISA. 
• Cercetarea ca răspuns reacție blasttransformation limfocitelor B pe un mitogen cu celule B (pokeweed mitogen pentru stimularea reacției blasttransformation de către limfocitele B, în prezența limfocitelor T), în care valoarea standard a 95-100%.

Legătura cu celule T a imunității

Metode de screening

• Determinarea numărului relativ și absolută a reacției de limfocite mature CD3 T prin imunofluorescență sau flux fluorocitometrie folosind anti-SDZ anticorpi monoclonali. Norma pentru adulți este de 58-76% sau de 1100-1700 celule / μl. Scăderea numărului de limfocite T este un indicator al insuficienței legăturii celulare a imunității. Aceasta este o caracteristică a multor imunodeficientelor primară și secundară (infecții bacteriene și virale cronice: tuberculoza, sindromul deficienței imune dobândite, cancer, insuficiență renală cronică, traumatisme, stres, imbatranire, malnutriție, tratamentul cu medicamente citotoxice, radiații ionizante). O creștere a numărului de limfocite T apare pe fondul hiperactivității imunității sau al bolilor limfoproliferative. Cu inflamație, numărul de limfocite T crește mai întâi și apoi scade. Absența unei scăderi a limfocitelor T sugerează cronicarea procesului inflamator.
• Evaluarea subpopulațiilor limfocitelor.
  • Determinarea numărului de ajutoare T (anticorp anti-CD4). În mod normal, 36-55% sau 400-1100 celule / μl. O creștere a numărului acestor celule apare în bolile autoimune, boala Waldenstrom, activarea implantării antigrafie; reducere a numărului de celule T-helper apare in infectiile cronice bacteriene, virale, protozoare, tuberculoza, sindromul imunodeficienței dobândite, neoplazii, arsuri, traumatisme, malnutriția, imbatranire, tratament citostatice, radiatii ionizante.
  • Determinarea numărului de supresoare T (anticorp anti-CD4). În mod normal, 17-37% sau 300-700 celule / μl. O creștere a numărului de supresoare T are loc în aceleași condiții în care numărul de ajutoare T scade, iar scăderea lor în aceleași condiții, atunci când crește conținutul ajutorului T.
  • Indicele imunoregulator CD4 / CD8, în norma 1,5-2,5. Hiperactivitate la rate mai mari de 2,5 (boli alergice și autoimune); hipoactivitate - mai puțin de 1,0 (predispoziție la infecții cronice). La debutul procesului inflamator, indicele de imunoreglare crește, iar atunci când acesta scade, acesta se normalizează.

Specificarea metodelor

• Determinarea numărului de kilograme naturale (celule NK) - anticorpi anti-CD16 și anti-CD56. Norma pentru CD 16-limfocite este de 6-26%, CD56 - 9-19%. Creșterea numărului de celule NK are loc în respingerea grefei, scad - în infecții virale, cancer, imunodeficiență primare si secundare, arsuri, traumatisme și stres, tratamentul cu citostatice și radiații ionizante. 
• Determinarea numărului de limfocite T cu receptorul pentru interleukina-2 (marker de activare) - anticorpi anti-CD25. Norma este de 10-15%. O creștere a numărului lor a fost observată în bolile alergice, respingerea transplantului, ca răspuns la antigenii dependenți de timus în timpul infecției primare acute, reducerea - în aceleași boli care implică reducerea numărului de celule NK.
• Examinarea expresiei markerului de activare - molecula de histocompatibilitate a clasei II HLA-DR. Creșterea expresiei apare în procesele inflamatorii, la pacienții cu hepatită C, boala celiacă, sifilis, infecții respiratorii acute.
• Evaluarea apoptozei limfocitelor. O indicație privind disponibilitatea apoptozei de limfocite poate fi identificat prin expresia lor de suprafață Fas-receptor (CD95) în mitocondrii și bd-2 protooncogene. Apoptoza a fost evaluată prin procesarea de limfocite două vopsele fluorescente: iodură de propidiu, care se leagă la fragmentele de ADN și annexin Y, legarea la fosfatidilserină la membrana celulelor care apare in apoptoza timpurie. Evaluarea rezultatelor se efectuează pe un citrofluorimetru de flux. Calculul rezultatelor se bazează pe raportul dintre celulele colorate cu coloranți diferiți. Celulele necolorate sunt celule viabile, asociate numai cu annexin Y, - semnele timpurii ale apoptozei, cu iodură de propidiu și annexin I - manifestări tardive ale apoptozei colorația numai iodură de propidiu indică necroza.
• Evaluarea proliferării limfocitelor T in vitro.
  • Schimbarea în blastogeneza celulară este o reacție a transformării blast-limfocite. Leucocitele sunt incubate cu orice mitogen de origine vegetală (lectine). Fitohemaglutinina mai frecvent utilizată timp de 72 de ore, apoi faceți o frotiu, pătați-o și numărați numărul de blasturi! Indicele de stimulare este raportul dintre procentul celulelor transformate în experiment (cultura cu fitohemaglutinină) și procentul celulelor transformate în martor (cultura fără fitoemaglutinină). Reacția de transformare blastică a limfocitelor poate fi evaluată prin includerea unei etichete radioactive (ZN-thymdin) în celulele cultivate, deoarece sinteza ADN crește atunci când se divid celulele. Tulburările în răspunsul proliferativ apar atât în imunodeficiențele primare cât și cele secundare asociate cu infecțiile, bolile oncologice, insuficiența renală și intervențiile chirurgicale.
  • Evaluarea acestor studii, expresia markerilor de activare (CD25, receptor transferinei la - CD71) și molecule MHC clasa II HLA-DR, care sunt substanțial absente pe limfocitele T în repaus. Limfocitele T stimulate cu fitohemaglutinină după 3 zile de expresie markerilor de activare au fost analizate prin imunofluorescență directă sau indirectă, fluxul citometric folosind anticorpi monoclonali receptori secretați.
  • Măsurarea cantității de mediatori sintetizați de limfocitele T activate [interleukina (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, gamma-interferon, etc.], prin radioimunoanaliză sau ELISA. Este deosebit de importantă evaluarea concentrației de y-interferon și IL-4 ca markeri ai TH și Th2 în supernatantul culturilor activate și în interiorul celulei. Dacă este posibil, este util să se determine expresia genei pentru citokină corespunzătoare prin nivelul acidului ribonucleic matrice în celula producătoare și intensitatea expresiei receptorilor pentru citokinele corespunzătoare.
    
• Reacția de inhibare a migrării limfocitelor. T limfocite T sensibilizate în reacția cu limfokinele de eliberare a antigenului, inclusiv factorii. Inhibând migrarea limfocitelor. Fenomenul de inhibare este observat când mitogenii sunt introduși în cultura celulelor. Evaluarea gradului de inhibare face posibilă judecarea capacității limfocitelor de a elibera citokinele. În mod normal, frecvența migrării, în funcție de mitogenul specific, este de 20-80%.
• Evaluarea citotoxicității celulelor NK. Determina capacitatea celulelor ucigase naturale de a ucide celulele țintă ale liniei eritromeloide K-562. Dacă se evaluează citotoxicitatea dependentă de anticorpi, se utilizează celule țintă acoperite cu anticorpi IgG. Celulele țintă sunt marcate cu 3H-uridină și incubate cu celule efectoare. Moartea celulelor țintă este estimată prin eliberarea etichetei radioactive în soluție. Reducerea citotoxicității apare la neoplasmele maligne. În unele cazuri, atunci când este necesar un prognostic al eficacității tratamentului cu interleukine, citotoxicitatea celulelor NK este evaluată atunci când este incubată cu anumite citokine.

Investigarea funcției fagocitelor

Metode de screening

Absorbtie fagocite intensitate Studiul celulelor microbiene (fagocitoza particulelor de latex, cultura aureus testare, Escherichia coli sau microorganisme izolate de la pacient). Prin centrifugarea leucocitelor din sânge heparinizate recuperat suspensie s-a adăugat ser IV de sânge pentru opsonizare (opsonins - proteine care imbunatatesc fagocitoza). Suspensia microbiană este diluată, amestecată cu leucocite și incubată timp de 120 min, prelevată pentru analiză după 30.90.120 min după începerea incubării. Din suspensiile selectate de leucocite se fac frotiuri. Determinați următorii indicatori de fagocitoză:

• indicele fagocitar - procentul de celule care au intrat în fagocitoză în 30 min și 120 min incubare; valoarea normativă a indicelui fagocitar (30) 94% din indicele fagocitar (120) - 92%;
• numărul fagocitar - numărul mediu de bacterii care sunt intracelulare; valoarea normativă a numărului fagocitar (30) 11%, numărul fagocitar (120) - 9,8%;  
• coeficientul numărului fagocitar - raportul dintre numărul fagocitar (30) și numărul fagocitar (120); normal 1,16;
• indicele bactericid al neutrofilelor este raportul dintre numărul de microbi uciși în interiorul fagocitelor și numărul total de microbi absorbiți; în norma de 66%.

Specificarea metodelor

• Investigarea activității bactericide a fagocitelor în testul cu nitrosin tetrazoliu (NST) este testul NST. La leucocite se adaugă colorant galben de tetrazoliu de azot. Când colorantul este absorbit de neutrofile, procesul de reducere are loc sub acțiunea radicalilor liberi de oxigen, rezultând o colorare albastră. Reacția se efectuează pe o placă cu fund plat cu 96 de godeuri. În primele trei godeuri cu un amestec de HCT și leucocite, se adaugă soluția Hanks (HCT spontan), în cele din urmă - particule de latex; se incubează la 37 ° C timp de 25 minute. Rezultatele sunt citite la cititorul de 540 nm și sunt exprimate în unități convenționale. Calculați factorul de stimulare (K _st ), egal cu raportul dintre densitatea optică în godeurile stimulate și densitatea optică medie în godeurile fără stimulare. La persoanele sănătoase, _{spontul HCT} = 90 ± 45 UE, NST _Stim = 140 ± 60 UE. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Investigarea moleculelor de adeziune. Cu ajutorul citofluorimetriei de flux se determină expresia antigenelor de suprafață CD11a / CD18, CD11b / CD18, CD11c / CD18. Imunodeficiențele cu încălcarea adeziunii se manifestă prin recidivele infecțiilor, vindecarea lentă a rănilor și absența puroiului în focarele de infecție.

Investigarea sistemului complementar

Metode de screening

Determinarea activității hemolitice a complementului - un studiu al căii clasice de activare a complementului. Diferitele diluții ale serului pacientului și ale unei persoane sănătoase sunt adăugate la eritrocitele unui berbec acoperit cu anticorpi. O unitate de activitate hemolitică este considerată inversă a diluției serului, în care 50% din eritrocite sunt distruse. Gradul de hemoliză este evaluat fotometric prin randamentul hemoglobinei în soluție. Reducerea activității hemolitice a complementului se observă la lupusul eritematos sistemic cu afectare renală, glomerulonefrită acută. Imunodeficiențe combinate, miastenia gravis, hepatită virală, limfoame, creștere - cu icter obstructiv, tiroidită Hashimoto. Reumatismul, artrita reumatoidă, periaritrita nodulară. Dermatomiozita, infarct miocardic, colită ulcerativă, sindromul Reiter, guta.

Specificarea metodelor

• Determinarea componentelor complementului. Determinarea cantitativă se realizează prin metoda imunodifuziei radiale și nefelometriei.
  Studiul nu este informativ, cu excepția cazului în care se modifică proprietățile antigenice ale componentelor complementului.
• S-a constatat că componenta Clq a complementului sporește fagocitoza și mediază citotoxicitatea celulară. Descreșterea sa are loc în bolile complexelor imune, lupusul eritematos sistemic, infecțiile purulente și tumorile.
• Componenta C3 participă la activarea căii complementare clasice și alternative. Reducerea concentrației sale este asociată cu infecții bacteriene și fungice cronice, prezența complexelor imune circulante sau tisulare.
• Componenta C4 participă la activarea căii clasice. O scădere a concentrației sale este asociată cu o activare prelungită a complementului cu complexe imune și o scădere a concentrației inhibitorului C1, care controlează activarea căii complementului clasic. Deficitul de C4 apare la lupusul eritematos sistemic, o creștere a nivelului de C4 apare în cazul bolii renale, al respingerii transplantului, al inflamației acute și al bolilor tractului gastro-intestinal.
• C5a este un mic fragment din molecula C5, separat de acesta ca urmare a activării sistemului complementar. Creșterea concentrației sale survine prin inflamație, sepsis, boli atopice și alergice.
• Inhibitorul Cl este un factor multifuncțional. Controlează activarea componentei C1 a complementului, inhibă activitatea kallikreinei, plasminului și factorului activ Hageman, proteazelor Cls și Or. Deficitul de inhibitor C1 duce la angioedem.
• studii complementare. La serul standard lipsit de orice component de complement, se adaugă serul de test și se determină activitatea hemolitică a complementului. Dacă activitatea hemolitică nu este restabilită la normal, se crede că activitatea acestei componente de complement în serul de test este redusă.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]