Metode de genetică moleculară pentru diagnosticarea bolilor ereditare

Metodele tehnologiei ADN sunt utilizate pentru a determina localizarea unei gene mutante într-un anumit cromozom, responsabilă de originea anumitor forme de patologie ereditară. Întrucât o genă este o secțiune de ADN, iar o mutație genetică reprezintă o deteriorare a structurii primare a ADN-ului (mutația este înțeleasă ca toate modificările secvenței ADN, indiferent de localizarea și impactul lor asupra viabilității unui individ), atunci, prin sondarea preparatelor de cromozomi în metafază ale unui pacient cu o boală ereditară, este posibil să se stabilească localizarea genei patologice. Metodele genetice moleculare creează oportunități pentru diagnosticarea bolilor la nivelul structurii ADN alterate, permițându-ne să determinăm localizarea tulburărilor ereditare. Metodele genetice moleculare pot identifica mutații asociate chiar și cu înlocuirea unei singure baze.

Cea mai importantă etapă a identificării genelor este izolarea acestora. ADN-ul poate fi izolat din orice tip de țesut și celule care conțin nuclei. Etapele izolării ADN-ului includ: liza rapidă a celulelor, îndepărtarea fragmentelor de organite celulare și membrane prin centrifugare, distrugerea enzimatică a proteinelor și extracția acestora din soluție folosind fenol și cloroform, concentrarea moleculelor de ADN prin precipitare în etanol.

În laboratoarele genetice, ADN-ul este cel mai adesea izolat din leucocitele din sânge, pentru care se prelevează 5-20 ml de sânge venos de la pacient într-o eprubetă sterilă cu o soluție anticoagulantă (heparină). Apoi, leucocitele sunt separate și procesate conform etapelor de mai sus.

Următoarea etapă de pregătire a materialului pentru cercetare este „tăierea” ADN-ului în fragmente în zone cu o secvență de baze strict specifică, care se realizează folosind enzime bacteriene - endonucleaze de restricție (enzime de restricție). Enzimele de restricție recunosc secvențe specifice de 4-6, mai rar 8-12 nucleotide într-o moleculă de ADN bicatenar și o împart în fragmente în locațiile acestor secvențe, numite situsuri de restricție. Numărul de fragmente de restricție de ADN rezultate este determinat de frecvența apariției situsurilor de restricție, iar dimensiunea fragmentelor este determinată de natura distribuției acestor situsuri de-a lungul lungimii moleculei de ADN originale. Cu cât situsurile de restricție sunt localizate mai des, cu atât fragmentele de ADN sunt mai scurte după restricție. În prezent, sunt cunoscute peste 500 de tipuri diferite de enzime de restricție de origine bacteriană, iar fiecare dintre aceste enzime își recunoaște propria secvență de nucleotide specifică. În viitor, situsurile de restricție pot fi utilizate ca markeri genetici ai ADN-ului. Fragmentele de ADN formate ca urmare a restricției pot fi ordonate după lungime prin electroforeză într-un gel de agaroză sau poliacrilamidă și, astfel, se poate determina greutatea lor moleculară. De obicei, ADN-ul dintr-un gel este identificat prin colorare specifică (de obicei bromură de etidiu) și prin vizualizarea gelului în lumină ultravioletă transmisă. Locurile de localizare a ADN-ului sunt colorate în roșu. Cu toate acestea, la om, atunci când ADN-ul este procesat de mai multe enzime de restricție, se formează atât de multe fragmente de lungimi diferite încât acestea nu pot fi separate prin electroforeză, adică nu este posibilă identificarea vizuală a fragmentelor individuale de ADN pe electroforeză (se obține o colorare uniformă pe întreaga lungime a gelului). Prin urmare, pentru a identifica fragmentele de ADN dorite într-un astfel de gel, se utilizează metoda de hibridizare cu sonde de ADN marcate.

Orice segment monocatenar de ADN sau ARN este capabil să se lege (hibridizeze) cu o catenă complementară, guanina legându-se întotdeauna de citozină, iar adenina de timină. Așa se formează o moleculă bicatenară. Dacă o copie monocatenară a unei gene clonate este marcată cu un marker radioactiv, se obține o sondă. Sonda este capabilă să găsească un segment complementar de ADN, care este apoi ușor de identificat folosind autoradiografia. O sondă radioactivă adăugată la un preparat de cromozomi întinși permite localizarea genei pe un cromozom specific: folosind o sondă de ADN, se pot identifica zone specifice în timpul Southern blotting. Hibridizarea are loc dacă secțiunea de ADN testată conține o genă normală. În cazul în care este prezentă o secvență nucleotidică anormală, adică structurile cromozomiale corespunzătoare conțin o genă mutantă, hibridizarea nu va avea loc, ceea ce permite determinarea localizării genei patologice.

Pentru obținerea sondelor de ADN se utilizează metoda clonării genelor. Esența metodei constă în introducerea unui fragment de ADN corespunzător unei gene sau unei secțiuni a unei gene într-o particulă de clonare, de obicei o plasmidă bacteriană (ADN extracromozomial inelar prezent în celulele bacteriene și purtător de gene de rezistență la antibiotice), iar apoi se înmulțesc bacteriile cu plasmida în care a fost inserată gena umană. Datorită proceselor de sinteză din plasmidă, se pot obține miliarde de copii ale genei umane sau ale secțiunii acesteia.

Copiile de ADN rezultate, marcate cu un marker radioactiv sau cu fluorocromi, sunt apoi utilizate ca sonde pentru a căuta secvențe complementare în cadrul setului de molecule de ADN studiat.

În prezent, există multe tipuri diferite de metode care utilizează sonde ADN pentru a diagnostica mutațiile genetice.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]