Celule stem neurale

Dovezile experimentale ale posibilității regenerării celulelor SNC au fost obținute mult mai devreme decât descoperirea celulelor stem embrionare în studii care au arătat prezența celulelor în neocortexul, hipocampul și bulbii olfactivi ai creierului șobolanilor adulți care captează 3H-timidina, adică sunt capabile de sinteză și diviziune proteică. Încă din anii '60 ai secolului trecut, se presupunea că aceste celule sunt precursoare ale neuronilor și sunt direct implicate în procesele de învățare și memorie. Puțin mai târziu, a fost dezvăluită prezența sinapselor pe neuronii formați de novo și au apărut primele lucrări privind utilizarea celulelor stem embrionare în scopul inducerii neurogenezei in vitro. La sfârșitul secolului XX, experimentele cu diferențierea dirijată a celulelor stem embrionare în celule progenitoare neuronale, neuroni dopaminergici și serotoninergici au condus la o revizuire a ideilor clasice despre capacitatea celulelor nervoase ale mamiferelor de a se regenera. Rezultatele numeroaselor studii au dovedit în mod convingător atât realitatea restructurării rețelelor neuronale, cât și prezența neurogenezei pe întreaga perioadă a vieții postnatale a organismului mamiferelor.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Surse de celule stem neuronale

Celulele stem neuronale umane sunt izolate în timpul operațiilor efectuate pe regiunea subventriculară a ventriculilor laterali și pe girusul dentat al hipocampului, ale căror celule formează neurosfere (sfere neuronale) în cultură, iar după dispersarea și preformarea acestora din urmă - toate tipurile principale de celule ale sistemului nervos central sau, într-un mediu special, microsfere noi. În culturile în suspensie de țesut disociat izolat din regiunile periventriculare ale creierului embrionar, apar și neurosfere.

Markerii celulelor cerebrale imature includ nestina, beta-tubulina III (marker de linie neuronală), vimentina, GFAP și NCAM, care sunt identificate imunocitochimic folosind anticorpi monoclonali. Nestina (proteină neurofilamentară intermediară de tip IV) este exprimată de celulele neuroectodermale multipotente. Această proteină este utilizată pentru a identifica și izola celulele progenitoare neuroepiteliale multipotente din SNC folosind anticorpi monoclonali Rat-401, care pot detecta până la 95% din celulele tubului neural la embrionii de șobolan în a unsprezecea zi de gestație. Nestina nu este exprimată pe descendenții diferențiați ai celulelor stem neuronale, dar este prezentă în celulele progenitoare neuronale timpurii, neuronii postmitotici și neuroblastele timpurii. Acest marker a fost utilizat pentru a identifica celulele progenitoare neuroepiteliale și pentru a dovedi existența celulelor stem în SNC. Vimentina (proteină neurofilamentară intermediară de tip III) este exprimată de celulele progenitoare neuronale și gliale, precum și de neuroni, fibroblaste și celule musculare netede. Prin urmare, ambii markeri imunocitochimici nu au specificitatea necesară pentru a identifica separat celulele stem neuronale și cele progenitoare. Beta-tubulina III stabilește direcția neuronală a diferențierii celulelor stem, în timp ce astrocitele de tip I sunt identificate prin expresia GFAP, iar oligodendrocitele exprimă în mod specific galactocerebrozidă (Ga!C).

FGF2 și EGF servesc ca mitogeni pentru celulele progenitoare neuronale, susținând proliferarea celulelor progenitoare nediferențiate în cultură cu formarea de neurosfere. Rata de diviziune a celulelor stem neuronale crește semnificativ sub influența FGF2, precum și cu utilizarea unei combinații de FGF2 + EGF. Efectele proliferative ale FGF2 sunt mediate de receptorii FGF2-R1. Heparina crește afinitatea de legare a receptorului FGF2 și amplifică dramatic efectul său mitogenic asupra celulelor neuroepiteliale. În stadiile incipiente ale embriogenezei, receptorii FGF2 sunt exprimați în telencefalul de șobolan, în timp ce în stadiile ulterioare localizarea lor este limitată la zona ventriculară. Vârful expresiei FGF2-R1 de către celulele postmitotice se observă la finalizarea perioadei de neurogeneză timpurie. Perioada inițială de dezvoltare a telencefalului este caracterizată de un nivel scăzut al expresiei receptorului EGF, în principal în celulele regiunii ventrale. În stadiile ulterioare ale embriogenezei, expresia EGF-R crește în direcția dorsală. În creierul rozătoarelor, EGF are o afinitate mare pentru receptorul beta al factorului de creștere transformant (TGF-beta-R), de care se leagă preferențial. Dovezi indirecte ale rolului funcțional al EGF-R sunt furnizate de datele privind disgeneza corticală a prozencefalului care apare în perioada târzie a embriogenezei și ontogenezei postnatale, scăderea funcției prozencefalului, moartea celulelor corticale și ectopia hipocampică la șoarecii cu gena knockout a receptorului EGF. În plus, prezența TGF-a în mediul nutritiv este absolut necesară pentru formarea neurosferelor. După îndepărtarea factorilor de creștere din mediul condiționat, celulele se opresc din diviziune și suferă o diferențiere spontană cu formarea de neuroni, astrocite și oligodendroblaste.

Având în vedere acest lucru, reagregarea celulelor stem disociate și cultivarea neurosferelor se efectuează în medii nutritive care conțin EGF și FGF bazic sau FGF2, dar fără adăugarea de ser. S-a demonstrat că EGF induce proliferarea celulelor stem din zona subependimală a ventriculilor laterali, iar FGF bazic promovează proliferarea celulelor stem din striat, hipocamp, neocortex și nerv optic al creierului matur. Combinația dintre EGF și FGF bazic este absolut necesară pentru proliferarea activă a celulelor stem izolate din ependimul ventriculului al treilea și al patrulea al prozencefalului, precum și din canalul spinal al măduvei spinării toracice și lombare.

După disociere, suspensia de celule stem neuronale este cultivată în vase de plastic sau plăci cu mai multe godeuri fără substrat adeziv pentru a crește dimensiunea noilor neurosfere formate, ceea ce durează de obicei aproximativ 3 săptămâni. Metoda de dispersie multiplă și reproducere a neurosferelor permite obținerea unui număr suficient de clone liniare de celule stem multipotente pentru transplant intracerebral. Acest principiu stă la baza creării unei bănci de celule stem izolate din creierul embrionar uman. Clonarea lor pe termen lung (pe parcursul mai multor ani) face posibilă obținerea de linii stabile de celule stem neuronale, din care se formează neuroni catecolaminergici în timpul diferențierii induse.

Dacă neurosferele nu sunt dispersate și cultivate pe substraturi adezive în medii lipsite de factori de creștere, celulele stem proliferative încep să se diferențieze spontan pentru a forma celule precursoare neuronale și gliale care exprimă markeri ai tuturor tipurilor de celule nervoase: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulină III (neuroni), GFAP (astrocite) și CalC, 04 (oligodendrocite). Spre deosebire de celulele de șoarece și șobolan, neuronii reprezintă peste 40% din totalul celulelor diferențiate din culturile de celule stem neuronale umane (de la 1 la 5% la rozătoare), dar se formează semnificativ mai puține oligodendrocite, ceea ce este foarte important din punctul de vedere al terapiei celulare a bolilor demielinizante. Problema este rezolvată prin adăugarea mediului de cultură B104, care stimulează formarea celulelor producătoare de mielină.

La cultivarea celulelor progenitoare neuronale din creierul embrionilor umani într-un mediu care conține EGF, FGF bazic și LIF, numărul de celule precursoare din linia neuronală crește de 10 milioane de ori. Celulele extinse in vitro își păstrează capacitatea de a migra și de a se diferenția în elemente neuronale și gliale după transplantul în creierul șobolanilor maturi. Cu toate acestea, in vivo, numărul de diviziuni ale celulelor precursoare multipotente este limitat. S-a observat în repetate rânduri că limita Hayflick pentru o celulă stem neuronală „adultă” (aproximativ 50 de mitoze) este încă imposibil de atins chiar și într-un experiment - celulele sub formă de neurosfere își păstrează proprietățile doar 7 luni și numai după 8 pasaje. Se crede că acest lucru se datorează particularităților metodelor lor de dispersie în timpul pasajelor (tripsinizare sau acțiune mecanică), ceea ce reduce drastic activitatea proliferativă a celulelor din cauza perturbării contactelor intercelulare. Într-adevăr, dacă în loc de dispersie se utilizează metoda de împărțire a neurosferelor în 4 părți, viabilitatea celulelor în timpul pasajelor crește semnificativ. Această metodă permite cultivarea celulelor stem neuronale umane timp de 300 de zile. Totuși, după această perioadă, celulele își pierd activitatea mitotică și suferă degenerare sau intră în stadiul de diferențiere spontană cu formarea de neuroni și astrocite. Pe această bază, autorul consideră că 30 de mitoze reprezintă numărul maxim de diviziuni pentru celulele stem neuronale cultivate.

Când celulele stem neuronale umane sunt cultivate in vitro, se formează predominant neuroni GABAergici. Fără condiții speciale, celulele progenitoare neuronale dau naștere la neuroni dopaminergici (necesari pentru terapia celulară a bolii Parkinson) doar în primele pasaje, după care toți neuronii din cultură constau exclusiv din celule GABAergice. La rozătoare, IL-1 și IL-11, precum și fragmente de membrane ale celulelor nervoase, LIF și GDNF, determină inducerea neuronilor dopaminergici in vitro. Cu toate acestea, această abordare metodologică s-a dovedit a fi nereușită la om. Cu toate acestea, atunci când neuronii GABAergici sunt transplantați intracerebral in vivo, sub influența factorilor de micromediu, apar celule nervoase cu fenotipuri de mediatori diferite.

Căutarea combinațiilor de factori neurotrofici a arătat că FGF2 și IL-1 induc formarea de neuroblaste dopaminergice, care, totuși, nu sunt capabile să producă neuroni dopaminergici. Diferențierea celulelor stem hipocampice în neuroni glutamatergici excitatori și neuroni GABA-ergici inhibitori are loc sub influența neurotrofinelor, iar EGF și IGF1 induc formarea de neuroni glutamatergici și GABA-ergici din celulele progenitoare neuronale ale embrionilor umani. Adăugarea secvențială de acid retinoic și neurotrofină 3 (NT3) la cultură crește semnificativ diferențierea celulelor stem hipocampice mature din creier în neuroni cu diverse naturi mediatoare, în timp ce o combinație de factor neurotrofic derivat din creier (BNDF), NT3 și GDNF poate produce neuroni piramidali în culturi hipocampice și neocorticale.

Astfel, rezultatele numeroaselor studii indică faptul că, în primul rând, celulele stem din diferite structuri cerebrale, sub influența factorilor tisulari specifici locali, sunt capabile să se diferențieze in vivo în fenotipuri neuronale inerente acestor structuri. În al doilea rând, diferențierea indusă țintită a celulelor stem neuronale in vitro folosind clonarea celulelor progenitoare face posibilă obținerea de celule nervoase și gliale cu caracteristici fenotipice specificate pentru transplant intracerebral în diverse forme de patologie cerebrală.

Nu există nicio îndoială că celulele stem pluripotente izolate din embrioni sau din SNC adult pot fi considerate o sursă de neuroni noi și utilizate în clinică pentru tratamentul patologiei neurologice. Cu toate acestea, principalul obstacol în calea dezvoltării neurotransplantului celular practic este faptul că majoritatea celulelor stem neuronale nu se diferențiază în neuroni după implantarea în zone non-neurogene ale SNC matur. Pentru a ocoli acest obstacol, se propune o metodă inovatoare foarte originală, care permite obținerea in vitro a unei populații pure de neuroni din celule stem neuronale fetale umane după transplantul în SNC al unui șobolan matur. Autorii demonstrează că diferențierea celulelor implantate prin această metodă se încheie cu formarea de neuroni cu fenotip colinergic, care se datorează influenței factorilor micromediului înconjurător. Tehnologia propusă prezintă interes din punctul de vedere al dezvoltării de noi tipuri de terapie bazată pe celule stem și al înlocuirii neuronilor deteriorați din cauza leziunilor sau bolilor neurodegenerative, deoarece neuronii colinergici joacă un rol principal în dezvoltarea funcțiilor motorii, de memorie și de învățare. În special, neuronii colinergici izolați din celulele stem umane pot fi utilizați pentru a înlocui neuronii motori pierduți în scleroza laterală amiotrofică sau în leziunile măduvei spinării. În prezent, nu există informații despre metodele de producere a unui număr semnificativ de neuroni colinergici dintr-o populație de celule stem preformate cu mitogen. Autorii propun o metodă destul de simplă, dar eficientă, pentru stimularea celulelor stem neuronale embrionare umane primare preformate cu mitogen pentru a se dezvolta în neuroni practic puri după implantare atât în zonele non-neurogene, cât și în cele neurogene ale SNC ale unui șobolan matur. Cel mai important rezultat al muncii lor este conversia unui număr suficient de mare de celule transplantate în neuroni colinergici atunci când sunt implantate în membrana medie și măduva spinării.

În plus, pentru preformarea celulelor stem neurale din cortexul cerebral embrionar uman de 8 săptămâni în neuroni colinergici in vitro, se propune utilizarea diferitelor combinații ale următorilor factori trofici și elemente chimice: FGF bazic recombinant, EGF, LIF, peptidă sonoră amino-terminală de șoarece (Shh-N), acid trans-retinoic, NGF, BDNF, NT3, NT4, laminină naturală și heparină de șoarece. Linia originală de celule stem neurale umane (K048) a fost menținută in vitro timp de doi ani și a rezistat la 85 de pasaje fără modificări ale proprietăților proliferative și de diferențiere, menținând în același timp un cariotip diploid normal. Neurosferele nedispersate din pasajele 19-55 (săptămânile 38-52) au fost placate pe poli-d-lizină și laminină și apoi tratate cu factorii menționați mai sus în diferite concentrații, combinații și secvențe. Combinația de FGF bazic, heparină și laminină (prescurtată FHL) a dat un efect unic. După o zi de cultivare a celulelor stem neuronale embrionare în mediu FHL cu sau fără Shh-N (combinația dintre Shh-N + FHL în abrevierea SFHL), s-a observat o proliferare rapidă a celulelor planare mari. Toate celelalte protocoale de o zi (cum ar fi FGF bazic + laminină), dimpotrivă, au condus la o răspândire radială limitată a celulelor fusiforme, iar aceste celule nu au părăsit nucleul neurosferelor. După 6 zile de activare și următoarele 10 zile de diferențiere în mediu care conține B27, celule mari multipolare de tip neuron au fost detectate la marginea sferelor activate de FHL. În alte grupuri de protocoale, majoritatea celulelor de tip neuron au rămas mici și bipolare sau unipolare. Analiza imunocitochimică a arătat că celulele bipolare sau unipolare mici (< 20 μm) erau fie GABAergice, fie glutamatergice, în timp ce majoritatea celulelor multipolare mari localizate la marginea neurosferelor activate de FHL erau colinergice, exprimând markeri caracteristici neuronilor colinergici (Islet-1 și ChAT). Unii dintre acești neuroni au exprimat simultan sinapsina 1. În urma a cinci serii de experimente independente, autorii au descoperit că populația totală de celule din zonele cu un singur strat s-a diferențiat în neuroni TuJ1+ cu 45,5%, în timp ce neuronii colinergici (ChAT^) au constituit doar 27,8% din celulele aceleiași populații. După 10 zile de diferențiere suplimentară in vitro, pe lângă neuronii colinergici, în neurosferele activate de FHL s-a găsit un număr semnificativ de neuroni mici - glutamatergici (6,3%), GABA-ergici (11,3%), precum și astrocite (35,2%) și celule nestin-pozitive (18,9%). Când s-au utilizat alte combinații de factori de creștere, neuronii colinergici au fost absenți, iar celulele marginale ale neurosferelor au format fie astrocite, fie neuroni mici glutamatergici și GABA-ergici. Monitorizarea potențialelor de rezervă și active utilizând tehnica de clampare cu celule întregi a arătat că, după șapte zile de activare FHL, majoritatea celulelor polipolare mari au avut un potențial de repaus de -29,0 ± 2,0 mV în absența potențialului de acțiune. După 2 săptămâni, potențialul de repaus a crescut la -63.6±3,0 mV, iar potențialele de acțiune au fost observate în momentul inducerii curenților depolarizanți și au fost blocate de tetrodotoxină 1 M, indicând activitatea funcțională a neuronilor imaturi colinergici.

Autorii au stabilit, de asemenea, că activarea FHL sau SFHL in vitro per se nu are ca rezultat formarea de neuroni maturi și au încercat să stabilească dacă celulele stem preformate cu FHL sau SFHL sunt capabile să se diferențieze în neuroni colinergici atunci când sunt transplantate în SNC la șobolani maturi. În acest scop, celulele activate au fost injectate în zona neurogenă (hipocampus) și în mai multe zone non-neurogene, inclusiv cortexul prefrontal, membrana medie și măduva spinării la șobolani adulți. Celulele implantate au fost urmărite folosind vectorul CAO-^^p. Se știe că OCP marchează atât ultrastructura celulară, cât și procesele celulare (nivel molecular) fără scurgeri și poate fi vizualizată direct. În plus, celulele stem neuronale marcate cu OCP mențin un profil de diferențiere neuronală și glială identic cu cel al celulelor stem netransformate din creierul embrionar.

La una până la două săptămâni după implantarea a 5 x 10⁴ ^celule stem neuronale activate și marcate, acestea au fost găsite în măduva spinării sau creierul șobolanilor, celulele OCD+ fiind localizate în principal în apropierea locului de injectare. Procesele de migrare și integrare au fost observate încă de la o lună după transplant. Limitele de migrare au variat în funcție de locul injectării: atunci când au fost injectate în cortexul prefrontal, celulele OCD+ au fost localizate la 0,4-2 mm de locul injectării, în timp ce în cazul implantării în membrana medie, hipocampus sau măduva spinării, celulele au migrat pe distanțe mult mai mari - până la 1-2 cm. Celulele transplantate au fost localizate în structuri ale SNC extrem de organizate, inclusiv cortexul frontal, membrana medie, hipocampusul și măduva spinării. Elementele neuronale marcate cu OCD au fost vizibile încă din prima săptămână după transplant, numărul lor crescând semnificativ la o lună după operație. Analiza stereologică a arătat o rată de supraviețuire mai mare a celulelor implantate în diverse structuri ale creierului, comparativ cu măduva spinării.

Se știe că în majoritatea țesuturilor organismului mamiferelor adulte se păstrează o populație de celule stem regionale, a căror transformare în celule mature este reglată de factori tisulari specifici. Proliferarea celulelor stem, diferențierea celulelor progenitoare și formarea fenotipurilor neuronale specifice unei anumite structuri cerebrale in vivo sunt exprimate într-o măsură mult mai mare în creierul embrionar, ceea ce este determinat de prezența unor concentrații mari de factori morfogenetici ai micromediului local - neurotrofinele BDNF, NGF, NT3, NT4/5 și factorii de creștere FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Unde sunt localizate celulele stem neuronale?

S-a stabilit că celulele stem neuronale exprimă proteina fibrilară acidă glială, care, printre celulele mature ale liniei neuronale, este reținută doar pe astrocite. Prin urmare, celulele astrocitare pot reprezenta rezerva stem în SNC matur. Într-adevăr, neuronii proveniți din precursori GFAP-pozitivi au fost identificați în bulbii olfactivi și în girusul dentat, ceea ce contrazice ideile tradiționale despre rolul progenitor al gliei radiale, care nu exprimă GFAP în girusul dentat la vârsta adultă. Este posibil să existe două populații de celule stem în SNC.

Problema localizării celulelor stem în zona subventriculară rămâne, de asemenea, neclară. Conform unor autori, celulele ependimale formează clone sferice în cultură, care nu sunt neurosfere adevărate (cum ar fi clonele celulelor subependimale), deoarece sunt capabile să se diferențieze doar în astrocite. Pe de altă parte, după marcarea fluorescentă sau virală a celulelor ependimale, markerul este detectat în celulele stratului subependimar și în bulbii olfactivi. Astfel de celule marcate in vitro formează neurosfere și se diferențiază în neuroni, astrocite și oligodendrocite. În plus, s-a demonstrat că aproximativ 5% din celulele din ependim exprimă markeri stem - nestină, Notch-1 și Mussashi-1. Se presupune că mecanismul mitozei asimetrice este asociat cu distribuția inegală a receptorului membranar Notch-1, drept urmare acesta din urmă rămâne pe membrana celulei fiice localizat în zona ependimară, în timp ce celula mamă care migrează în stratul subependimar este lipsită de acest receptor. Din acest punct de vedere, zona subependimară poate fi considerată un colector de precursori progenitori ai neuronilor și gliei formați din celulele stem ale stratului ependimar. Conform altor autori, în părțile caudale ale zonei subventriculare se formează doar celule gliale, iar sursa neurogenezei sunt celulele părții rostral-laterale. În a treia variantă, părților anterioare și posterioare ale zonei subventriculare a ventriculilor laterali li se atribuie un potențial neurogenic echivalent.

A patra variantă de organizare a rezervei stem în sistemul nervos central pare preferabilă, conform căreia în zona subventriculară se disting trei tipuri principale de celule progenitoare neuronale - A, B și C. Celulele A exprimă markeri neuronali timpurii (PSA-NCAM, TuJl) și sunt înconjurate de celule B, care sunt identificate ca astrocite prin exprimarea antigenelor. Celulele C, neavând caracteristici antigenice de neuroni sau glie, au o activitate proliferativă ridicată. Autorul a demonstrat convingător că celulele B sunt precursori ai celulelor A și ai neuronilor de novo ai bulbilor olfactivi. În timpul migrării, celulele A sunt înconjurate de catene de celule progenitoare neuronale, ceea ce diferă semnificativ de mecanismul de migrare al neuroblastelor postmitotice de-a lungul gliei radiale din creierul embrionar. Migrarea se încheie în bulbii olfactivi cu diviziunea mitotică atât a celulelor A, cât și a celor B, ale căror derivate sunt încorporate în straturile celulare granulare și în stratul glomerular al zonei olfactive a creierului.

Creierul embrionar în curs de dezvoltare nu are celule ependimale diferențiate, iar pereții ventriculari conțin celule stem proliferative din zonele germinale și subventriculare ventriculare, unde migrează neuroblastele și glioblastele primare. Pe baza acestui fapt, unii autori consideră că regiunea subependimală a creierului matur conține țesut neural germinal embrionar redus, format din astrocite, neuroblaste și celule neidentificate. Celulele stem neuronale adevărate constituie mai puțin de 1% din celulele din zona germinală a peretelui ventricular lateral. Parțial din acest motiv, și, de asemenea, în legătură cu datele conform cărora astrocitele din zona subependimale sunt precursori ai celulelor stem neuronale, nu este exclusă posibilitatea transdiferențierii elementelor gliale astrocitare cu dobândirea caracteristicilor fenotipice neuronale.

Principalul obstacol în calea unei soluții finale la problema localizării celulelor stem neurale in vivo este lipsa markerilor specifici pentru aceste celule. Cu toate acestea, foarte interesante din punct de vedere practic sunt rapoartele conform cărora celulele stem neurale au fost izolate din regiuni ale SNC care nu conțin zone subependimale - ventriculul al treilea și al patrulea al prozencefalului, canalul spinal al regiunilor toracică și lombară ale măduvei spinării. De o importanță deosebită este faptul că leziunea măduvei spinării crește proliferarea celulelor stem ependimale ale canalului central cu formarea de celule progenitoare care migrează și se diferențiază în astrocite ale cicatricei gliomezodermale. În plus, celule precursoare ale astro- și oligodendrocitelor au fost găsite și în măduva spinării nelezate a șobolanilor adulți.

Astfel, datele din literatură demonstrează convingător prezența în SNC al mamiferelor adulte, inclusiv al oamenilor, a unei rezerve regionale de tulpină, a cărei capacitate regenerativ-plastică, din păcate, este capabilă să asigure doar procesele de regenerare fiziologică cu formarea de noi rețele neuronale, dar nu satisface nevoile regenerării reparative. Aceasta pune sarcina căutării oportunităților de creștere a resurselor de tulpină ale SNC prin mijloace exogene, ceea ce este imposibil de rezolvat fără o înțelegere clară a mecanismelor de formare a SNC în perioada embrionară.

Astăzi știm că în timpul dezvoltării embrionare, celulele stem din tubul neural sunt sursa a trei tipuri de celule - neuroni, astrocite și oligodendrocite, adică neuronii și neuroglia provin dintr-o singură celulă precursoare. Diferențierea ectodermului în grupuri de celule progenitoare neuronale începe sub influența produselor genelor proneurale ale familiei bHLH și este blocată de exprimarea derivaților proteici transmembranari ai receptorilor din genele familiei Notch, care limitează determinarea și diferențierea timpurie a celulelor precursoare neuronale. La rândul lor, liganzii receptorilor Notch sunt proteinele Delta transmembranare ale celulelor vecine, datorită domeniului extracelular al cărora se realizează contacte intercelulare directe cu interacțiune inductivă între celulele stem.

Implementarea ulterioară a programului de neurogeneză embrionară nu este mai puțin complexă și, se pare, ar trebui să fie specifică speciei. Cu toate acestea, rezultatele studiilor de neuroxenotransplantare indică faptul că celulele stem au un conservatorism evolutiv pronunțat, datorită căruia celulele stem neuronale umane sunt capabile să migreze și să se dezvolte atunci când sunt transplantate în creierul de șobolan.

Se știe că SNC-ul mamiferelor are o capacitate extrem de scăzută de regenerare reparativă, caracterizată prin absența oricăror semne de apariție a unor noi elemente celulare în creierul matur pentru a înlocui neuronii care au murit în urma leziunilor. Cu toate acestea, în cazul transplantului de neuroblaste, acestea din urmă nu numai că se grefează, proliferează și se diferențiază, dar sunt capabile și să se integreze în structurile cerebrale și să înlocuiască funcțional neuronii pierduți. La transplantul de celule progenitoare neuronale angajate, efectul terapeutic a fost semnificativ mai slab. Astfel de celule s-au dovedit a avea o capacitate scăzută de migrare. În plus, celulele progenitoare neuronale nu reproduc arhitectura rețelelor neuronale și nu sunt integrate funcțional în creierul receptorului. În acest sens, se studiază activ problemele regenerării reparativ-plastice în timpul transplantului de celule stem neuronale multipotente nepreformate.

În studiul realizat de M. Aleksandrova și colab. (2001), în prima versiune a experimentelor, receptorii au fost șobolani femele maturi sexual, iar donatorii au fost embrioni în vârstă de 15 zile. O secțiune din cortexul occipital al creierului a fost prelevată de la receptori, iar în cavitate a fost transplantat țesut suspendat mecanic din cortexul embrionar prezumtiv, care conținea celule stem multipotente din regiunile ventriculare și subventriculare. În a doua versiune a experimentelor, celulele stem neuronale ale unui embrion uman de 9 săptămâni au fost transplantate în creierul unor șobolani maturi sexual. Autorii au izolat bucăți de țesut din regiunea periventriculară a creierului embrionar, le-au plasat într-un mediu nutritiv F-12 și au obținut o suspensie celulară prin pipetare repetată, apoi le-au cultivat într-un mediu special NPBM cu adăugarea de factori de creștere - FGF, EGF și NGF. Celulele au fost cultivate într-o cultură în suspensie până la formarea neurosferelor, care au fost dispersate și din nou plantate în cultură. După 4 pasaje cu o perioadă totală de cultivare de 12-16 zile, celulele au fost utilizate pentru transplant. Receptorii au fost pui de șobolan în vârstă de zece zile și șobolani Wistar în vârstă de două luni, maturi sexual, cărora li s-au injectat 4 μl de suspensie de celule stem neuronale umane în ventriculul lateral al creierului, fără imunosupresie. Rezultatele lucrării au arătat că celulele disociate din zona ventriculară și subventriculară a structurăi embrionare a cortexului cerebral de șobolan și-au continuat dezvoltarea în timpul alotransplantării în creierul matur, adică factorii micromediului creierului receptor diferențiat nu au blocat creșterea și diferențierea celulelor stem neuronale ale embrionului. În stadiile incipiente după transplant, celulele multipotente au continuat diviziunea mitotică și au migrat activ din zona de transplant în țesutul cerebral al receptorului. Celulele embrionare transplantate cu un potențial imens de migrare au fost găsite în aproape toate straturile cortexului cerebral al receptorului de-a lungul traseului de transplant și în substanța albă. Lungimea tractului de migrare al celulelor nervoase a fost întotdeauna semnificativ mai scurtă (până la 680 μm) decât cea a elementelor gliale (până la 3 mm). Vasele de sânge și structurile fibroase ale creierului au servit drept vectori structurali pentru migrarea astrocitelor, lucru observat și în alte studii.

Anterior, se credea că acumularea de astrocite marcate în zona deteriorării cortexului cerebral al receptorului ar putea fi asociată cu formarea unei bariere gliale între țesuturile transplantului și receptor. Cu toate acestea, un studiu al structurii transplanturilor de celule localizate compact a arătat că citoarhitectura lor este caracterizată de haos, fără nicio distribuție stratificată a celulelor transplantate. Gradul de ordine al neuronilor transplantați se apropia de cel al celulelor cortexului cerebral normal doar în absența unei bariere gliale între țesuturile donatorului și receptor. În rest, structura celulelor transplantate era atipică, iar neuronii înșiși erau supuși hipertrofiei. Folosind tipizarea neuroimunochimică a celulelor transplantate, s-au găsit neuroni GABA-ergici inhibitori în transplanturi și s-a detectat expresia proteinelor PARV, CALB și NPY. În consecință, creierul matur păstrează factori de micromediu capabili să susțină proliferarea, migrarea și diferențierea specifică a celulelor neuronale multipotente.

În cultura celulelor stem umane izolate din regiunea periventriculară a creierului embrionilor de 9 săptămâni, M. Aleksandrova și colab. (2001) au descoperit un număr mare de celule multipotente nestin-pozitive în al patrulea pasaj, unele dintre ele suferiseră deja o diferențiere in vitro și se dezvoltau în funcție de tipul neuronal, ceea ce corespundea rezultatelor studiilor altor autori. După transplantul în creierul șobolanilor adulți, celulele stem umane cultivate s-au divizat mitotic și au migrat în țesutul creierului receptor xenogen. În transplanturile de celule, autorii au observat două populații de celule - mici și mari. Acestea din urmă au migrat atât în parenchim, cât și de-a lungul structurilor fibroase ale creierului receptor pe distanțe nesemnificative - în limita a 300 μm. Cea mai mare extindere a căii de migrare (până la 3 mm) a fost caracteristică celulelor mici, unele dintre ele diferențiate în astrocite, ceea ce a fost stabilit folosind anticorpi monoclonali împotriva GFAP. Ambele tipuri de celule au fost găsite în peretele ventriculului lateral, indicând faptul că celulele transplantate au intrat în tractul de migrare rostral. Derivatele astrocitare ale celulelor stem neuronale, atât de la oameni, cât și de la șobolani, au migrat predominant prin capilarele sanguine și structurile fibroase ale creierului receptor, ceea ce coincide cu datele altor autori.

Analiza diferențierii celulelor stem umane in vivo utilizând anticorpi monoclonali anti-GFAP, CALB și VIM a relevat formarea atât a astrocitelor, cât și a neuronilor. Spre deosebire de celulele din transplanturile de șobolan, multe celule stem umane au fost vimentin-pozitive. Prin urmare, unele dintre celulele multipotente umane nu au suferit diferențiere. Aceiași autori au arătat ulterior că celulele stem neuronale umane transplantate fără imunosupresie supraviețuiesc în creierul de șobolan timp de 20 de zile după transplant, fără semne de agresiune imună din partea elementelor gliale ale creierului matur.

S-a stabilit că până și celulele stem neuronale ale speciei Drosophila se grefează și se diferențiază în creierul unui taxon atât de îndepărtat de insecte precum șobolanul. Corectitudinea experimentului autorilor este fără îndoială: liniile transgenice Drosophila conțineau gene pentru factorii neurotrofici umani NGF, GDNF, BDNF, inserate în vectorul CaSper sub promotorul de șoc termic Drosophila, astfel încât temperatura corpului mamiferelor le-a provocat automat expresia. Autorii au identificat celulele Drosophila prin produsul genei galactozidazei bacteriene folosind colorarea histochimică X-Gal. În plus, s-a constatat că celulele stem neuronale Drosophila răspund în mod specific la factorii neurotrofici codificați de genele umane: la xenotransplantarea celulelor unei linii transgenice Drosophila care conține gena gdnf, sinteza tirozin hidroxilazei în celulele stem neuronale diferențiate a crescut brusc, iar celulele cu gena ngf au produs activ acetilcolinesterază. Xenotransplantul a indus reacții similare dependente de gene în alotransplantul de țesut neuronal embrionar transplantat împreună cu acesta.

Înseamnă acest lucru că diferențierea specifică a celulelor stem neuronale este indusă de factori neurotrofici nespecifici speciei? Conform rezultatelor autorilor, factorii neurotrofici producători de xenogrefe au avut un efect specific asupra soartei alogrefelor, care în acest caz s-au dezvoltat mai intens și au fost de 2-3 ori mai mari ca dimensiune decât alogrefele introduse în creier fără adăugarea de xenogrefe. În consecință, celulele xenogrefe care conțin gene de neurotrofină, în special gena care codifică factorul neurotrofic derivat din celulele gliale umane (GDNF), au un efect nespecific speciei asupra dezvoltării alogrefelor, similar cu acțiunea neurotrofinei corespunzătoare. Se știe că GDNF crește supraviețuirea neuronilor dopaminergici în mezencefalul embrionar de șobolan și sporește metabolismul dopaminei de către aceste celule și induce diferențierea celulelor tirozin hidroxilază-pozitive, sporind creșterea axonilor și mărind dimensiunea corpului celular neuronal. Efecte similare sunt observate și în neuronii dopaminergici cultivați din mezencefalul de șobolan.

Migrarea activă a celulelor stem neuronale umane este observată după xenotransplantarea în creierul șobolanilor maturi. Se știe că procesul de migrare și diferențiere a celulelor stem neuronale este controlat de un set de gene speciale. Semnalul de inițiere a migrării către celula precursoare pentru a începe diferențierea este dat de produsul proteic al protooncogenei c-ret împreună cu GDNF. Următorul semnal provine de la gena mash-1, care controlează alegerea căii de dezvoltare celulară. În plus, reacția specifică a celulelor de diferențiere depinde și de receptorul α al factorului neurotrofic ciliar. Astfel, având în vedere constituția genetică complet diferită a celulelor stem neuronale umane xenogene și a celulelor cerebrale de șobolan receptoare, este necesar să recunoaștem nu numai nespecificitatea de specie a factorilor neurotrofici, ci și cel mai înalt conservatorism evolutiv al genelor responsabile de diferențierea specifică a elementelor stem neuronale.

Viitorul va arăta dacă xenotransplantarea neuromaterialului embrionar va fi posibilă în practica neurochirurgicală de tratare a proceselor patologice neurodegenerative cauzate de perturbarea sintezei mielinei de către oligodendrocite. Între timp, problemele cel mai intens abordate ale neurotransplantului sunt cele legate de obținerea de celule stem neuronale alogene din creierul embrionar sau matur în cultură, cu diferențierea lor ulterioară direcționată în neuroblaste sau neuroni specializați.

Transplantul de celule stem neuronale

Pentru a stimula proliferarea și diferențierea celulelor stem neuronale ale unui organism adult, se poate transplanta țesut nervos embrionar. Este posibil ca celulele stem ale țesutului nervos embrionar aduse prin alogrefă să poată suferi ele însele proliferare și diferențiere. Se știe că, după o leziune a coloanei vertebrale, regenerarea conductorilor nervoși are loc prin alungirea axonilor deteriorați și germinarea colaterală a axonilor proceselor nedeteriorate ale neuronilor motori. Principalii factori care împiedică regenerarea măduvei spinării sunt formarea unei cicatrici de țesut conjunctiv în zona leziunii, modificările distrofice și degenerative ale neuronilor centrali, deficitul de NGF și prezența produșilor de descompunere a mielinei în zona leziunii. S-a demonstrat că transplantul de diferite tipuri de celule în măduva spinării deteriorată - fragmente din nervul sciatic al animalelor adulte, cortexul occipital embrionar, hipocampul, măduva spinării, celule Schwann, astrocite, microglie, macrofage, fibroblaste - promovează regenerarea axonilor deteriorați prin germinare și permite axonilor nou formați să crească prin zona leziunii măduvei spinării. S-a demonstrat experimental că transplantul de țesut nervos embrionar în zona lezată a măduvei spinării, prin acțiunea factorilor neurotrofici, accelerează creșterea axonilor afectați, previne formarea cicatricilor gliale și dezvoltarea proceselor distrofice și degenerative în neuronii centrali, în timp ce celulele țesutului nervos embrionar transplantat supraviețuiesc în măduva spinării, se integrează cu țesuturile adiacente și promovează creșterea axonilor prin zona lezată cu formarea de sinapse dendritice pe neuronii spinali.

Acest domeniu al medicinei regenerativ-plastice a cunoscut cea mai mare dezvoltare în Ucraina datorită muncii echipei științifice conduse de VI Tsymbalyuk. În primul rând, acestea sunt studii experimentale privind eficacitatea transplantului de țesut nervos embrionar în leziunile măduvei spinării. În timpul autotransplantării nervului periferic, autorii au observat cele mai pronunțate modificări distructive în zona suturii distale, unde în a 30-a zi după operație acestea au fost combinate cu procese reparative. În timpul alotransplantării, starea morfofuncțională a nervului implantat în a 30-a zi a fost caracterizată printr-o distrugere pronunțată cu degenerare grasă și amiloidoză pe fondul infiltrării focale a celulelor limfoide inflamatorii cu atrofie predominantă a celulelor Schwann. Transplantarea țesutului nervos embrionar a contribuit într-o măsură mai mare la restabilirea conductivității măduvei spinării, în special la animalele care au fost supuse intervențiilor chirurgicale în primele 24 de ore după leziune: pe fondul scăderii intensității proceselor inflamatorii și distructive, s-au observat hipertrofie și hiperplazie a elementelor ultrastructurale sintetizatoare de proteine și producătoare de energie ale neuronilor spinali, hipertrofie și hiperplazie a oligodendrocitelor, amplitudinea potențialului de acțiune musculară a fost restabilită cu 50%, iar viteza conducerii impulsului cu 90%. La evaluarea eficacității transplantului de țesut nervos embrionar în funcție de zona de transplant, s-a constatat că cele mai bune rezultate au fost observate atunci când grefa a fost introdusă direct în zona leziunii măduvei spinării. Cu transecția completă a măduvei spinării, transplantul de țesut nervos embrionar a fost ineficient. Studiile dinamice au arătat că momentul optim pentru efectuarea transplantului de țesut nervos embrionar este în primele 24 de ore după leziunea măduvei spinării, în timp ce efectuarea intervenției chirurgicale în perioada modificărilor ischemice-inflamatorii secundare pronunțate care apar în a 2-a-9-a zi după leziune trebuie considerată inadecvată.

Se știe că traumatismele cerebrale severe provoacă o activare puternică și prelungită a peroxidării lipidice în stadiile inițiale și intermediare ale perioadei posttraumatice, atât în țesutul cerebral lezat, cât și în organism în ansamblu, și, de asemenea, perturbă procesele metabolismului energetic în creierul lezat. În aceste condiții, transplantul de țesut nervos embrionar în zona leziunii traumatice promovează stabilizarea proceselor de peroxidare lipidică și crește potențialul sistemului antioxidant al creierului și al organismului în ansamblu, sporind protecția antiradicală în ziua 35-60 a perioadei posttraumatice. În aceeași perioadă după transplantul de țesut nervos embrionar, metabolismul energetic și procesele de fosforilare oxidativă din creier sunt normalizate. În plus, s-a demonstrat că în prima zi după traumatismul cerebral experimental, impedanța țesutului emisferei lezate scade cu 30-37%, cea contralaterală - cu 20%, ceea ce indică dezvoltarea edemului cerebral generalizat. La animalele care au suferit un transplant de țesut nervos embrionar, involuția edemului a avut loc semnificativ mai rapid - deja în a șaptea zi, valoarea medie a impedanței țesuturilor emisferei lezate a atins 97,8% din nivelul de control. Mai mult, restaurarea completă a valorilor impedanței în a 30-a zi a fost observată doar la animalele care au primit un transplant de țesut nervos embrionar.

Moartea unor neuroni din creier după o leziune craniocerebrală severă este una dintre principalele cauze ale complicațiilor posttraumatice. Neuronii sistemelor dopaminergice și noradrenergice integratoare ale mezencefalului și rahidianului sunt deosebit de sensibili la leziuni. O scădere a nivelului de dopamină în complexul striopallidal și cortexul cerebral crește semnificativ riscul de a dezvolta tulburări motorii și tulburări mentale, stări epileptiforme, iar o scădere a producției de dopamină în hipotalamus poate fi cauza a numeroase tulburări vegetative și somatice observate în perioada posttraumatică târzie. Rezultatele studiilor efectuate în leziuni craniocerebrale experimentale indică faptul că transplantul de țesut nervos embrionar ajută la restabilirea nivelurilor de dopamină în emisfera cerebrală lezată, a dopaminei și norepinefrinei în hipotalamus și la creșterea nivelurilor de norepinefrină și dopamină în mezencefal și rahidian. În plus, ca urmare a transplantului de țesut nervos embrionar în emisfera cerebrală lezată a animalelor experimentale, raportul procentual al fosfolipidelor este normalizat și conținutul de acizi grași crește (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Aceste date confirmă stimularea proceselor regenerativ-plastice de către țesutul nervos embrionar transplantat și indică efectul reparativ-trofic al transplantului asupra creierului receptorului în ansamblu.

Experiența clinică a personalului Institutului de Neurochirurgie AP Romodanov al Academiei de Științe Medicale din Ucraina în transplantul de țesut nervos embrionar în paralizia cerebrală, o patologie extrem de complexă cu disfuncție motorie severă, merită o atenție deosebită. Formele clinice de paralizie cerebrală depind de nivelul de afectare a structurilor integrale responsabile de reglarea tonusului muscular și formarea stereotipurilor motorii. În prezent, există suficiente dovezi care să susțină faptul că modificările patologice ale sistemului de control motor striopallidal-talamocortical joacă un rol important în funcția motorie și tulburările tonusului muscular. Legătura striopallidală a acestui sistem îndeplinește funcția de control prin producția nigrostriatală de dopamină. Calea directă pentru implementarea controlului talamocortical începe de la neuronii putamenului, este mediată de acidul gama-aminobutiric (GABA) și substanța P și este proiectată direct în zona motorie a segmentului intern al globului palid și a substanței negre. Calea indirectă, al cărei efect se realizează cu participarea GABA și enkefalinei, provine din neuronii putamenului și afectează nucleii ganglionilor bazali printr-o secvență de conexiuni care includ segmentul extern al globului palid și nucleul subtalamic. Tulburările de conductivitate ale căii directe provoacă hipokinezie, în timp ce o scădere a conductivității structurilor căii indirecte duce la hiperkinezie cu modificări corespunzătoare ale tonusului muscular. Integritatea căilor de conducere GABAergice la diferite niveluri în sistemul de control motor și integrarea conexiunilor dopaminergice la nivelul putamenului sunt esențiale pentru reglarea interacțiunilor talamocorticale. Cea mai frecventă manifestare a patologiei motorii în diferite forme de paralizie cerebrală este o încălcare a tonusului muscular și o modificare strâns legată de aceasta a activității musculare reflexe.

Transplantarea țesutului nervos embrionar în paralizia cerebrală necesită o analiză amănunțită a naturii afectării structurilor cerebrale. Pe baza determinării nivelurilor de dopamină și GABA în lichidul cefalorahidian subarahnoidian, autorii au detaliat nivelul de perturbare a integrării structurilor cerebrale funcționale, ceea ce a permis obiectivarea rezultatelor intervenției chirurgicale și corectarea neurotransplantărilor repetate. Țesutul nervos embrionar (material de avort al unui embrion de 9 săptămâni) a fost transplantat în parenchimul cortexului circumvoluțiilor precentrale ale emisferelor cerebrale, în funcție de severitatea modificărilor atrofice. Nu s-au observat complicații sau deteriorare a stării pacienților în perioada postoperatorie. Dinamica pozitivă a fost observată la 63% dintre pacienții cu forme spastice, la 82% dintre copiii cu formă atonică-estetică și doar la 24% dintre pacienții cu formă mixtă a bolii. S-a stabilit un efect negativ al unui nivel ridicat de neurosensibilizare cu prezența autoanticorpilor la proteine neurospecifice asupra rezultatelor operației. Transplantul de țesut nervos embrionar s-a dovedit a fi ineficient la pacienții cu vârsta cuprinsă între 8 și 10 ani și peste, precum și în cazurile de sindrom hiperkinetic sever și epilepsie. Clinic, eficacitatea transplantului de țesut nervos embrionar la pacienții cu forme spastice de paralizie cerebrală s-a manifestat prin formarea de noi abilități statomotorii și mișcări voluntare cu corectarea stereotipului motor patologic și o scădere a gradului de spasticitate, a posturilor și atitudinilor patologice. Autorii consideră că efectul pozitiv al transplantului de țesut nervos embrionar este rezultatul efectului de normalizare asupra activității funcționale a structurilor supraspinale implicate în reglarea tonusului postural și a mișcărilor voluntare. În același timp, efectele clinice pozitive ale transplantului de țesut nervos embrionar sunt însoțite de o scădere a conținutului de neurotransmițători din lichidul cefalorahidian subarahnoidian, ceea ce indică restabilirea interacțiunilor integrale ale structurilor cerebrale afectate.

Există o altă formă severă de patologie neurologică - sindromul apalic, a cărui problemă de tratament, din păcate, este departe de a fi rezolvată. Sindromul apalic este o afecțiune polietiologică subacută sau cronică care apare ca urmare a unor leziuni organice severe ale sistemului nervos central (în principal cortexul cerebral) și se caracterizează prin dezvoltarea panapraxiei și panagnoziei cu funcție relativ conservată a secțiunilor segmentare-tulpină și a formațiunilor complexului limbico-reticular al creierului. Studiile ulterioare (de la 1 an la 3 ani) au arătat că sindromul apalic nu este un diagnostic final al afectării persistente a sistemului nervos la copii, ci se transformă fie în demență organică, fie într-o stare vegetativă cronică. În Departamentul de Neurochirurgie Restaurativă al Institutului de Neurochirurgie AP Romodanov al Academiei de Științe Medicale din Ucraina, 21 de pacienți cu consecințele sindromului apalic au fost supuși unui transplant de țesut nervos embrionar. Sub anestezie generală, s-a folosit o freză coronală pentru a realiza un orificiu peste zona cu cele mai pronunțate modificări atrofice relevate prin tomografie computerizată sau imagistică prin rezonanță magnetică, iar în prezența atrofiei difuze a substanței cenușii sau albe, transplantul a fost introdus în girusurile precentrale și centrale ale creierului. După deschiderea durei mater, bucăți de țesut din cortexul senzoriomotor al embrionilor de 8-9 săptămâni au fost implantate intracortical folosind un dispozitiv special. Numărul de probe de țesut implantate a variat de la 4 la 10, acesta fiind determinat de dimensiunea orificiului și de dimensiunea modificărilor locale ale materiei cerebrale. Spre deosebire de alte tipuri de patologie, în sindromul apalic autorii au căutat să implanteze cât mai mult țesut embrionar posibil în cele mai accesibile zone ale creierului. Dura mater a fost suturată și s-a efectuat o intervenție chirurgicală plastică a defectului cranian. În timpul operației, toți pacienții au prezentat modificări semnificative atât la nivelul cortexului (atrofie, absența circumvoluțiilor, modificarea culorii și pulsației materiei cerebrale), cât și la nivelul meningelui (îngroșarea durei mater, îngroșarea semnificativă a membranei arahnoide cu prezența propriilor vase de sânge, fuziunea membranelor cu materia cerebrală subiacentă). Aceste modificări au fost mai pronunțate la pacienții cu antecedente de leziuni cerebrale inflamatorii. La pacienții care au suferit hipoxie la nivelul SNC, au predominat modificările atrofice difuze la nivelul materiei cerebrale, în special la nivelul cortexului, cu o creștere a spațiului subarahnoidian, fără modificări semnificative la nivelul meningelui. Jumătate dintre pacienți au prezentat sângerări crescute ale țesuturilor moi, oaselor și materiei cerebrale. După operație, în decurs de șase luni până la trei ani, starea s-a îmbunătățit la 16 pacienți și a rămas neschimbată la cinci pacienți. Dinamica pozitivă a fost observată atât în sfera motorie, cât și în cea mentală. Tonusul muscular a scăzut la zece pacienți. La 11 pacienți, activitatea motorie a crescut (pareza a scăzut,...(coordonarea mișcărilor s-a îmbunătățit), la cinci copii, capacitatea de manipulare a membrelor superioare a crescut semnificativ. La patru pacienți, frecvența și severitatea crizelor epileptice au scăzut, iar la un copil nu au existat deloc crize pe întreaga perioadă de observație după operație. Agresivitatea a scăzut la doi copii, la doi pacienți cu tulburări bulbare severe, actul deglutiției s-a îmbunătățit, doi copii au fost capabili să mestece independent deja la 2 săptămâni după operație. S-a observat o scădere a severității tulburărilor mintale, nouă copii au devenit mai calmi după operație, somnul și atenția s-au îmbunătățit la șapte pacienți. Trei pacienți cu consecințele sindromului apalic au început să-și recunoască părinții, unul - să urmeze instrucțiunile, doi - să pronunțe cuvinte, la trei, gradul de dizartrie a scăzut. Autorii notează că o îmbunătățire vizibilă a stării pacienților începe la 2 luni după operație, atinge un maxim la 5-6 luni, apoi ritmul de ameliorare încetinește și până la sfârșitul anului procesul se stabilizează la 50% dintre pacienți. Efectul pozitiv al neurotransplantului a servit drept bază pentru o operație repetată la șase pacienți cu consecințele sindromului apalic, dar pe cealaltă emisferă a creierului. Tehnica și metodele celui de-al doilea transplant au fost identice cu cele din prima operație, dar efectul clinic al celei de-a doua operații a fost mai mic, deși nu au apărut complicații grave după prima sau a doua intervenție chirurgicală. Potrivit autorilor, mecanismul efectului terapeutic al neurotransplantului este asociat cu efectul neurotrofic al țesutului nervos embrionar transplantat, care conține un număr mare de substanțe de creștere, hormonale și alte substanțe biologic active care stimulează repararea neuronilor deteriorați și reorganizarea plastică a țesutului cerebral al receptorului. Este posibil și un efect de activare asupra activității celulelor nervoase care anterior erau conservate morfologic, dar și-au pierdut activitatea funcțională din cauza bolii. Efectul neurotrofic rapid poate explica îmbunătățirea funcțiilor bulbare la unii copii deja la sfârșitul primei sau a doua săptămâni după operație. Se presupune că, pe lângă aceasta, până în a treia sau a patra lună, se stabilesc conexiuni morfofuncționale între transplant și creierul gazdă, prin care neurotransplantul înlocuiește funcțiile celulelor cerebrale moarte, acesta fiind substratul pentru îmbunătățirea atât a funcțiilor motorii, cât și a celor mentale ale pacienților. Doi copii au fost capabili să mestece independent deja la 2 săptămâni după operație. S-a observat o scădere a severității tulburărilor mintale, nouă copii au devenit mai calmi după operație, somnul și atenția s-au îmbunătățit la șapte pacienți. Trei pacienți cu consecințele sindromului apalic au început să-și recunoască părinții, unul - să urmeze instrucțiunile, doi - să pronunțe cuvinte.În trei cazuri, gradul de dizartrie a scăzut. Autorii notează că o îmbunătățire vizibilă a stării pacienților începe la 2 luni după operație, atinge un maxim la 5-6 luni, apoi rata de ameliorare încetinește și până la sfârșitul anului procesul se stabilizează la 50% dintre pacienți. Efectul pozitiv al neurotransplantului a servit drept bază pentru o operație repetată la șase pacienți cu consecințele sindromului apalic, dar pe cealaltă emisferă a creierului. Tehnica și metoda celui de-al doilea transplant au fost identice cu cele din prima operație, dar efectul clinic al celei de-a doua operații a fost mai mic, deși nu au existat complicații grave după prima sau a doua intervenție chirurgicală. Potrivit autorilor, mecanismul efectului terapeutic al neurotransplantului este asociat cu efectul neurotrofic al țesutului nervos embrionar transplantat, care conține un număr mare de substanțe de creștere, hormonale și alte substanțe biologic active care stimulează repararea neuronilor deteriorați și reorganizarea plastică a țesutului cerebral al receptorului. Este posibil și un efect activator asupra activității celulelor nervoase care anterior erau conservate morfologic, dar și-au pierdut activitatea funcțională din cauza bolii. Tocmai efectul neurotrofic rapid poate explica îmbunătățirea funcțiilor bulbare la unii copii deja la sfârșitul primei sau a doua săptămâni după operație. Se presupune că, odată cu aceasta, până în a treia sau a patra lună, se stabilesc conexiuni morfofuncționale între transplant și creierul gazdă, prin care neurotransplantul înlocuiește funcțiile celulelor cerebrale moarte, acesta fiind substratul pentru îmbunătățirea atât a funcțiilor motorii, cât și a celor mentale ale pacienților. Doi copii au fost capabili să mestece independent deja la 2 săptămâni după operație. S-a observat o scădere a severității tulburărilor mintale, nouă copii au devenit mai calmi după operație, somnul și atenția s-au îmbunătățit la șapte pacienți. Trei pacienți cu consecințele sindromului apalic au început să-și recunoască părinții, unul - să urmeze instrucțiunile, doi - să pronunțe cuvinte, la trei gradul de dizartrie a scăzut. Autorii notează că o îmbunătățire vizibilă a stării pacienților începe la 2 luni după operație, atinge un maxim la 5-6 luni, apoi ritmul de îmbunătățire încetinește și până la sfârșitul anului procesul se stabilizează la 50% dintre pacienți. Efectul pozitiv al neurotransplantului a servit drept bază pentru o operație repetată la șase pacienți cu consecințele sindromului apalic, dar pe cealaltă emisferă a creierului. Tehnica și metoda celui de-al doilea transplant au fost identice cu cele din prima operație, dar efectul clinic al celei de-a doua operații a fost mai mic, deși nu au existat complicații grave nici după prima, nici după a doua intervenție chirurgicală. Potrivit autorilor,Mecanismul efectului terapeutic al neurotransplantului este asociat cu efectul neurotrofic al țesutului nervos embrionar transplantat, care conține un număr mare de substanțe de creștere, hormonale și alte substanțe biologic active care stimulează repararea neuronilor deteriorați și reorganizarea plastică a țesutului cerebral al receptorului. Este posibil și un efect de activare asupra activității celulelor nervoase care anterior erau conservate morfologic, dar și-au pierdut activitatea funcțională din cauza bolii. Tocmai efectul neurotrofic rapid poate explica îmbunătățirea funcțiilor bulbare la unii copii deja la sfârșitul primei sau a doua săptămâni după operație. Se presupune că, odată cu aceasta, până în a treia sau a patra lună, se stabilesc conexiuni morfofuncționale între transplant și creierul gazdă, prin care neurotransplantul înlocuiește funcțiile celulelor cerebrale moarte, acesta fiind substratul pentru îmbunătățirea atât a funcțiilor motorii, cât și a celor mentale ale pacienților, deși nu au apărut complicații grave după prima, nici a doua intervenție chirurgicală. Conform autorilor, mecanismul efectului terapeutic al neurotransplantului este asociat cu efectul neurotrofic al țesutului nervos embrionar transplantat, care conține un număr mare de substanțe de creștere, hormonale și alte substanțe biologic active, care stimulează repararea neuronilor deteriorați și reorganizarea plastică a țesutului cerebral al receptorului. Este posibil și un efect activator asupra activității celulelor nervoase care anterior erau conservate morfologic, dar și-au pierdut activitatea funcțională din cauza bolii. Tocmai efectul neurotrofic rapid poate explica îmbunătățirea funcțiilor bulbare la unii copii deja la sfârșitul primei sau a doua săptămâni după operație. Se presupune că, odată cu aceasta, până în a treia sau a patra lună, se stabilesc conexiuni morfofuncționale între transplant și creierul gazdă, prin care neurotransplantul înlocuiește funcțiile celulelor cerebrale moarte, acesta fiind substratul pentru îmbunătățirea atât a funcțiilor motorii, cât și a celor mentale ale pacienților, deși nu au apărut complicații grave după prima, nici a doua intervenție chirurgicală. Conform autorilor, mecanismul efectului terapeutic al neurotransplantului este asociat cu efectul neurotrofic al țesutului nervos embrionar transplantat, care conține un număr mare de substanțe de creștere, hormonale și alte substanțe biologic active, care stimulează repararea neuronilor deteriorați și reorganizarea plastică a țesutului cerebral al receptorului. Este posibil și un efect de activare asupra activității celulelor nervoase care anterior erau conservate morfologic, dar și-au pierdut activitatea funcțională din cauza bolii.Tocmai efectul neurotrofic rapid poate explica îmbunătățirea funcțiilor bulbare la unii copii deja la sfârșitul primei sau a doua săptămâni după operație. Se presupune că, odată cu aceasta, până în a treia sau a patra lună, se stabilesc conexiuni morfofuncționale între transplant și creierul gazdă, prin care neurotransplantul înlocuiește funcțiile celulelor cerebrale moarte, acesta fiind substratul pentru îmbunătățirea atât a funcțiilor motorii, cât și a celor mentale ale pacienților.

Efectul transplantului de țesut nervos embrionar asupra reorganizării interconexiunilor interneuronale a fost studiat experimental. Autorii au studiat modelele de restaurare a conexiunilor axonale intermodulare în zona deteriorării mecanice a cortexului cerebral la șobolani albi cu și fără transplant de țesut nervos embrionar utilizând marcajul lipofil fluorescent DIL (1,1-dioctadecil-3,3,33'-tetrametilindocarbocianină perclorat) și scanare laser confocală. S-a constatat că introducerea țesutului nervos embrionar în zona afectată asigură creșterea axonilor, care, după trecerea prin transplant, se conectează cu țesutul cerebral adiacent, în timp ce fără transplant de țesut nervos embrionar, zona afectată reprezintă un obstacol insurmontabil pentru creșterea axonilor. În această lucrare, s-a efectuat transplantul de neocortex embrionar (ziua 15-17 de gestație). Rezultatele obținute de autori reprezintă o dovadă suplimentară în favoarea influenței active a transplantului de țesut nervos embrionar asupra reorganizării post-traumatice a relațiilor interneuronale ale modulelor structurale și funcționale vecine ale cortexului cerebral. Transplantul de țesut nervos embrionar asigură restaurarea parțială a conexiunilor dintre zonele afectate ale cortexului cerebral prin crearea unor condiții favorabile pentru creșterea axonilor în zona de acțiune a factorilor neurotrofici ai transplantului. Existența unui astfel de efect a fost dovedită experimental și este discutată în literatura de specialitate ca dovadă a capacităților plastice ridicate ale creierului deteriorat al animalelor mature sexual. În acest sens, transplantul de celule este considerat în prezent o strategie terapeutică optimă pentru restabilirea funcției SNC uman afectat.

Datele obținute de autori privind eficiența utilizării țesutului nervos embrionar al creierului ca mediu de transplant exogen pentru creșterea axonilor confirmă perspectivele creării unor legături de comunicare țintite între zonele adiacente intacte ale creierului. Lucrările privind studierea efectului transplantului de țesut nervos asupra dinamicii parametrilor funcționali ai sistemului nervos central par relevante. Sarcina lucrării a fost de a investiga efectul transplantului de locus coeruleus (LC) embrionar asupra indicilor morfofuncționali ai neuronilor LC și a activității locomotorii a receptorilor. Receptorii au fost șobolani Wistar femele, iar donatorii au fost embrioni de șobolani din aceeași linie, în vârstă de 18 zile. Transplantarea de LC embrionar a fost efectuată în cavitatea celui de-al treilea ventricul al creierului. Histologic, grefa a fost detectată la 75% dintre animalele receptor. În cazurile de grefare, grefa a fost adiacentă peretelui ventricular, umplând 1/5-2/5 din lumenul său și a fost viabilă. La 1 și 6 luni după operație, țesutul nervos transplantat, conform caracteristicilor sale morfologice, reprezenta structuri care ar fi apărut în timpul dezvoltării lor ontogenetice normale, adică structuri LC. Datele obținute de autori indică faptul că la animalele cărora li s-a transplantat anlage-ul LC embrionar, activitatea dinamică se modifică, iar activitatea matriceală a cromatinei nucleilor celulelor LC crește. În consecință, activitatea neuronilor din LC propriu se intensifică, dar transplantul grefat este, de asemenea, activ funcțional. Se știe că așa-numita regiune locomotorie a mezencefalului coincide practic cu localizarea LC. Autorii consideră că baza modificării activității motorii a șobolanilor receptori este activarea celulelor LC, atât proprii, cât și a transplantului, cu eliberarea unei cantități mari de norepinefrină, inclusiv în segmentele măduvei spinării. Astfel, se presupune că creșterea activității motorii în condițiile transplantului LC în creierul intact al animalelor se datorează prezenței unui transplant funcțional activ, integrat cu creierul receptorului și care contribuie la activarea activității locomotorii la șobolani.

În plus, s-a demonstrat că celulele neuroepiteliale transplantate ale rudimentelor embrionare ale neocortexului și măduvei spinării supraviețuiesc și se diferențiază în neuroblaste, neuroni tineri și maturi în decurs de 1-2 luni de la transplantul lor în nervul sciatic deteriorat al șobolanilor maturi. Studiind dinamica dezvoltării neuronilor NADPH-pozitivi ai rudimentelor embrionare ale neocortexului și măduvei spinării la șobolani în alogrefe heterotopice (embrion de șobolan de 15 zile), s-a evidențiat grefarea a 70 până la 80% din neurogrefe pe secțiuni longitudinale prin nervii sciatici ai șobolanilor receptori, în funcție de perioada de observație. Neuroblastele uni- și bipolare cu nuclei rotunzi și ușori și unul sau doi nucleoli au început să se formeze în grefe la o săptămână după operație, care a fost însoțită de formarea de clustere. Autorii nu au reușit să detecteze celule care conțin NADPH diaforază (NADPH-d) printre neuroblaste. După 7 zile, doar elementele celulare ale vaselor de sânge erau NADPH-pozitive - celulele endoteliale capilare din grosimea transplantului, precum și celulele endoteliale și musculare netede ale vaselor nervului sciatic al receptorului. Deoarece în celulele musculare netede vasculare inducerea NO sintazei (NOS) are loc sub influența IL-1, autorii asociază apariția celulelor musculare netede NADPH-pozitive în vasele de sânge ale nervului sciatic cu prezența IL-1 sintetizată în trunchiurile nervoase deteriorate. Se știe că neurogeneza în condiții de transplant de rudimente cerebrale embrionare are loc sincron cu dezvoltarea neuronilor in situ. Rezultatele studiilor morfologice indică faptul că diferențierea unor elemente neuronale ale transplanturilor la șapte zile după transplant corespunde cu diferențierea celulelor din părți similare ale creierului șobolanilor nou-născuți. Astfel, în condiții de transplant heterotopic în nervul periferic, celulele nervoase embrionare transplantate prezintă capacitatea de a sintetiza NADPH-d. În acest caz, în transplanturile de măduvă spinării se găsesc mai mulți neuroni care conțin NADPH-d decât în transplanturile de neocortex, dar sinteza oxidului nitric începe în neuronii transplantați mai târziu decât în timpul dezvoltării in situ. În SNC-ul vertebratelor, celulele NOS-pozitive apar deja în perioada prenatală. Se crede că NO promovează formarea conexiunilor sinaptice în creierul în curs de dezvoltare, iar prezența fibrelor nervoase aferente NOS-pozitive care asigură sinteza NO în neuroblastele cerebeloase stimulează migrarea și diferențierea neuronilor, datorită cărora se formează citoarhitectura cerebrală normală. Un rol important al NO în sinapsogeneză a fost stabilit în tectum - doar acei neuroni care aveau conexiuni sinaptice cu celulele retiniene s-au dovedit a fi NOS-pozitivi.

Se știe că oxidul nitric este unul dintre regulatorii activității cerebrale, unde se formează din arginină sub influența NO sintazei, care are activitate diaforazică. În sistemul nervos central, NO este sintetizat în celulele endoteliale ale vaselor de sânge, microgliei, astrocitelor și neuronilor din diferite părți ale creierului. După leziuni cerebrale traumatice, precum și în timpul hipoxiei și ischemiei, se observă o creștere a numărului de neuroni care conțin NO, acesta fiind unul dintre regulatorii fluxului sanguin cerebral. Având în vedere capacitatea NO de a induce sinapsogeneza, studiul formării celulelor care conțin NO în condiții de neurotransplantare pe fondul leziunilor traumatice ale țesutului nervos al receptorului prezintă un interes deosebit.

Nu mai puțin important este studiul efectului neurotransplantului asupra stereotipului reflex condiționat al comportamentului. În experimentele privind studiul efectului transplantului intracerebral și la distanță (între CII și CIII) de țesut embrionar locus coeruleus (17-19 zile de gestație) asupra proceselor de memorie și conținutului de catecolamine la șobolani cu distrugerea neocortexului frontotemporal, s-a demonstrat că deteriorarea electrolitică a cortexului frontotemporal al creierului perturbă stereotipul reacției emoționale reflexe condiționate de evitare (memorie), slăbește activitatea fiziologică, reduce conținutul de norepinefrină în zona neocortexului coagulat, dar crește nivelul acesteia în hipotalamus, unde se observă o scădere a concentrației de adrenalină, deși cantitatea acesteia în sânge și glandele suprarenale crește.

Ca urmare a transplantului intracerebral de țesut embrionar locus coeruleus, stereotipul reacției reflexe condiționate de evitare emoțională, perturbat de deteriorarea electrolitică a regiunilor frontotemporale ale cortexului cerebral, este restabilit la 81,4% dintre animale, conținutul de adrenalină în formațiunea reticulară a mezencefalului, hipotalamusului și neocortexului este normalizat, iar nivelul acesteia în hipocampus chiar crește, ceea ce este combinat cu o scădere a concentrației de adrenalină în sânge.

Transplantul la distanță de țesut embrionar de locus coeruleus nu numai că restabilește stereotipul perturbat al reacției reflexe condiționate de evitare emoțională la șobolanii cu leziuni electrolitice ale cortexului frontotemporal, dar crește și conținutul de norepinefrină și adrenalină, în principal în hipotalamus, sânge, glandele suprarenale și inimă. Se presupune că acest lucru se datorează vascularizării transplantului, pătrunderii neurotransmițătorilor în fluxul sanguin, trecerii lor prin bariera hematoencefalică și activării mecanismelor de recaptare a adrenalinei și norepinefrinei prin tipurile de recaptare 1, 2, 3. Autorii consideră că stabilizarea pe termen lung a nivelului de norepinefrină în condiții de grefare și funcționare a transplantului poate fi considerată un fenomen al eliberării sale progresive în doze minime de către neuronii locus coeruleus.

Efectele clinice pozitive ale transplantului de țesut nervos embrionar se pot datora și capacității acestuia din urmă de a influența procesele neoplasmului vascular, în reglarea cărora participă direct factorii de creștere și citokinele. Vasculogeneza este activată de factorii de creștere angiogenici - factorul de creștere endotelial vascular (VEGF), FGF, PDGF și TGF, care sunt sintetizați în timpul ischemiei, care acționează ca moment inițiator al angiogenezei. S-a dovedit că epuizarea potențialului de creștere vasculară are loc în timpul procesului de îmbătrânire a organismului, care joacă un rol semnificativ în patogeneza unor boli precum boala coronariană și ateroscleroza obliterantă a extremităților inferioare. Ischemia tisulară se dezvoltă și în multe alte boli. Introducerea factorilor angiogenici în zonele ischemice (angiogeneza terapeutică) stimulează creșterea vaselor de sânge în țesuturile ischemice și îmbunătățește microcirculația datorită dezvoltării circulației colaterale, care, la rândul său, crește activitatea funcțională a organului afectat.

VEGF și FGF sunt considerate cele mai promițătoare pentru utilizarea clinică. Rezultatele primelor studii randomizate au fost încurajatoare, mai ales dacă dozele optime și metodele de administrare a factorilor angiogenici au fost alese corect. În acest sens, s-a efectuat o evaluare experimentală a activității angiogenetice a unui extract izolat din țesutul cerebral embrionar uman. În lucrare s-a utilizat material avortat obținut în a douăzecea săptămână de sarcină și procesat conform metodei lui I. Maciog și colab. (1979), modificată de IC ANRF. Acest medicament este un analog al „Suplimentului pentru creșterea celulelor endoteliale” („Sigma”) și este un amestec natural de factori angiogenici umani, care include VEGF și FGF. Experimentele au fost efectuate pe șobolani cu modele de ischemie a membrelor posterioare și a țesutului miocardic. Pe baza studiului activității fosfatazei alcaline la animalele experimentale cărora li s-a administrat extractul de țesut nervos embrionar, s-a constatat o creștere a numărului de capilare pe unitatea de suprafață a miocardului - atât în secțiunile longitudinale, cât și în cele transversale ale inimii. Activitatea angiogenică a preparatului s-a manifestat prin administrare directă în zona ischemică, precum și în cazul administrării sistemice (intramusculare), ceea ce a dus la o scădere a suprafeței medii a cicatricei post-infarct.

În orice variantă de transplant de țesut nervos embrionar, este extrem de importantă selectarea corectă a vârstei gestaționale a materialului embrionar transplantat. Analiza comparativă a eficienței preparatelor celulare din mezencefalul ventral embrionar al embrionilor de șobolan de 8, 14 și 16-17 zile, la trei luni după neurotransplantarea intrastriatală la șobolani maturi cu parkinsonism, în testul automat de asimetrie motorie indusă de apomorfină, a relevat o eficiență semnificativ mai mare a preparatelor celulare ale SNC din embrioni de 8 zile și cea mai mică eficiență din țesutul nervos embrionar de 16-17 zile. Datele obținute s-au corelat cu rezultatele analizei histomorfologice, în special cu dimensiunea transplanturilor, severitatea reacției gliale și numărul de neuroni dopaminergici din aceștia.

Diferențele în efectul terapeutic al celulelor țesutului nervos embrionar pot fi asociate atât cu gradul de imaturitate și angajament al celulelor în sine, cât și cu răspunsurile lor diferite la factorii de creștere eliberați în zona de deteriorare indusă neuronilor dopaminergici. În special, efectul EGF și FGF2 asupra dezvoltării celulelor stem neuronale telencefalice in vivo apare în diferite stadii ale embriogenezei. Celulele neuroepiteliale ale embrionilor de șoarece în vârstă de 8,5 zile, atunci când sunt cultivate in vitro într-un mediu fără ser, proliferează în prezența FGF2, dar nu și a EGF, la care răspund doar populațiile de celule stem izolate din creierul embrionilor aflați în stadii ulterioare de dezvoltare. În același timp, celulele stem neuronale proliferează ca răspuns la fiecare dintre acești mitogeni și amplifică aditiv creșterea în cazul adăugării EGF și FGF2 la o cultură cu o densitate scăzută de însămânțare celulară. Celulele stem neuronale reactive la EGF din zonele germinale ale embrionilor de șoarece în vârstă de 14,5 zile sunt considerate a fi descendenți liniari ai celulelor stem neuronale reactive la FGF, care apar pentru prima dată după 8,5 zile de gestație. Fenotipul potențial al celulelor stem neuronale și progenitoare depinde de efectul complex al micromediului lor. Imunofenotiparea celulelor neuronale din zonele periventriculare și hipocampice ale embrionilor umani cu vârsta de 8-12 și 17-20 de săptămâni prin citofluorometrie în flux a relevat o variabilitate semnificativă asociată atât cu vârsta gestațională, cât și cu caracteristicile constituționale individuale ale biomaterialului donator. Atunci când aceste celule progenitoare neuronale sunt cultivate într-un mediu selectiv fără ser cu EGF, FGF2 și NGF, neurosferele se formează într-un ritm care depinde semnificativ de vârsta gestațională. Celulele din diferite părți ale creierului unor embrioni umani cu vârsta cuprinsă între 5 și 13 săptămâni, cultivate pe scurt cu FGF2 în monostrat pe un substrat de laminină în prezența unor urme de factori de creștere, își mențin proliferarea timp de 6 săptămâni cu un procent ridicat de celule nestin-pozitive pe fondul formării spontane de celule cu markeri ai tuturor celor trei linii de diferențiere neuronală. Celulele izolate din mezencefalul unui embrion uman la o perioadă de gestație care depășește 13 săptămâni proliferează sub influența EGF și formează, de asemenea, neurosfere. Un efect sinergic a fost obținut prin utilizarea unei combinații de EGF și FGF2. Cea mai intensă proliferare a celulelor stem neuronale cu formarea de neurosfere se observă la cultivarea țesutului cortexului cerebral al unor embrioni umani cu vârsta cuprinsă între 6 și 8 săptămâni în prezența EGF2, IGF1 și 5% ser de cal pe un substrat cu fibronectină.

Trebuie menționat că întrebările referitoare la vârsta gestațională și secțiunea SNC embrionar, al cărui țesut este preferabil să fie utilizat în scopul neurotransplantului, rămân deschise. Răspunsurile la acestea ar trebui căutate în neurogeneza creierului în curs de dezvoltare, care continuă pe tot parcursul perioadei prenatale - într-un moment în care epiteliul tubului neural formează o structură multistrat. Se crede că sursa celulelor stem și a noilor neuroni este glia radială, constând din celule alungite cu procese lungi direcționate radial față de peretele veziculelor cerebrale și care intră în contact cu suprafața interioară a ventriculelor și cu suprafața pială externă a peretelui cerebral. Anterior, glia radială era înzestrată doar cu funcția unui tract neuronal de-a lungul căruia neuroblastele migrează din regiunea ventrală către secțiunile superficiale și i se atribuia, de asemenea, un rol scheletic în procesul de formare a organizării laminare corecte a cortexului. Astăzi s-a stabilit că, pe măsură ce dezvoltarea avansează, glia radială se transdiferențiază în astrocite. O parte semnificativă a acesteia la mamifere este redusă imediat după naștere, însă, la acele specii de animale la care glia radială este păstrată până la vârsta adultă, neurogeneza are loc activ în perioada postnatală.

În cultură, celulele gliale radiale din neocortexul embrionar al rozătoarelor au format neuroni și celule gliale, neuronii formându-se predominant la vârsta gestațională de 14-16 zile a dezvoltării embrionare (perioada de intensitate maximă a neurogenezei în cortexul cerebral al șoarecilor și șobolanilor). În a 18-a zi de embriogeneză, diferențierea s-a îndreptat spre formarea de astrocite, cu o scădere semnificativă a numărului de neuroni nou formați. Marcarea in situ a celulelor gliale radiale cu GFP a făcut posibilă detectarea diviziunii asimetrice a celulelor marcate în cavitatea veziculelor cerebrale ale embrionilor de șobolan cu vârsta de 15-16 zile, cu apariția celulelor fiice cu caracteristici imunologice și electrofiziologice ale neuroblastelor. Este de remarcat faptul că, conform rezultatelor observațiilor dinamice, neuroblastele emergente utilizează celula mamă a celulelor gliale radiale pentru migrarea către suprafața pială.

Markerul endogen al gliei radiale este proteina filamentului intermediar, nestina. Folosind metoda de sortare în flux fluorescent a celulelor marcate cu un retrovirus asociat cu GFP și exprimate sub controlul nestinei, s-a demonstrat că celulele stem ale girusului și hilului dentat ale hipocampului uman (materialul a fost obținut în timpul operațiilor pentru epilepsie) exprimă nestina. Prin urmare, acestea aparțin gliei radiale, care la om, ca și la alte mamifere, este păstrată doar în girusul dentat.

În același timp, eficiența transplantului de celule este determinată nu numai de viabilitatea ridicată a celulelor donatoare, de potențialul lor de diferențiere și de capacitatea de a înlocui celulele defecte, ci, în primul rând, de migrarea lor direcționată. Integrarea funcțională completă a celulelor transplantate depinde de capacitatea lor de migrare - fără a perturba citoarhitectura creierului receptorului. Deoarece glia radială suferă o reducere aproape completă în perioada postnatală, a fost necesar să se afle cum se pot deplasa celulele donatoare din zona de transplant la locul leziunii cerebrale la receptorii adulți. Există două variante de migrare celulară către SNC care nu depind de glia radială: fenomenul de migrare tangențială sau mișcarea neuroblastelor în timpul dezvoltării cortexului cerebral perpendicular pe rețeaua glială radială, precum și migrarea „pe rând” sau „de-a lungul unui lanț”. În special, migrarea celulelor progenitoare neuronale din zona subventriculară rostrală către bulbul olfactiv are loc ca o secvență de celule strâns adiacente înconjurate de celule gliale. Se crede că aceste celule folosesc celulele partenere ca substrat de migrare, iar principalul regulator al unor astfel de interacțiuni intercelulare este PSA-NCAM (moleculă de adeziune a celulelor neuronale polisialilată). Prin urmare, migrarea neuronală nu necesită neapărat participarea gliei radiale sau a conexiunilor axonale preexistente. Forma extraradială a mișcării celulare într-un „șir” de-a lungul tractului de migrare rostral se menține pe tot parcursul vieții, ceea ce indică o posibilitate reală de livrare țintită a celulelor progenitoare neuronale transplantate către sistemul nervos matur.

Există o ipoteză despre prezența unei linii de celule stem în ontogeneza creierului, conform căreia, în stadiile incipiente ale dezvoltării creierului, celula stem este o celulă neuroepitelială, care, pe măsură ce se maturizează, se transdiferențiază în glia radială. La vârsta adultă, rolul celulelor stem este îndeplinit de celule care au caracteristicile astrocitelor. În ciuda unui număr de puncte controversate (contradicții privind celulele stem ale hipocampului, precum și părțile profunde ale creierului care nu au un cortex stratificat și se dezvoltă din tuberculii talamici, unde glia radială este absentă), un concept clar și simplu al unei schimbări consistente a fenotipului celulelor stem pe parcursul ontogenezei pare foarte atractiv.

Influența factorilor de micromediu asupra determinării și diferențierii ulterioare a celulelor neuronale diferențiate a fost demonstrată clar prin transplantul de celule stem mature din măduva spinării de șobolan în diferite regiuni ale sistemului nervos matur. Atunci când celulele stem au fost transplantate în girusul dentat sau în regiunea de migrare neuronală din bulbii olfactivi, s-a observat o migrare activă a celulelor transplantate, cu formarea a numeroși neuroni. Transplantarea celulelor stem în măduva spinării și regiunea cornului lui Amon a dus la formarea de astrocite și oligodendrocite, în timp ce transplantul în girusul dentat a dus la formarea nu numai a celulelor gliale, ci și a neuronilor.

La un șobolan matur, numărul de celule care se divid în girusul dentat poate ajunge la câteva mii pe zi - mai puțin de 1% din numărul total de celule granulare. Neuronii reprezintă 50-90% din celule, astocite și alte elemente gliale - aproximativ 15%. Celulele rămase nu au caracteristici antigenice ale neuronilor și gliei, dar conțin antigene ale celulelor endoteliale, ceea ce indică o relație strânsă între neurogeneză și angiogeneză în girusul dentat. Susținătorii posibilității diferențierii celulelor endoteliale în celule precursoare neuronale se referă la capacitatea celulelor endoteliale in vitro de a sintetiza BDNF.

Viteza de auto-asamblare a circuitelor neuronale este impresionantă: în timpul diferențierii, celulele precursoare ale celulelor granulare migrează către girusul dentat și formează procese care cresc spre zona SAZ a cornului lui Amon și formează sinapse cu neuroni inhibitori piramidali glutamatergici și intercalari. Celulele granulare nou create sunt integrate în circuitele neuronale existente în decurs de 2 săptămâni, iar primele sinapse apar încă la 4-6 zile de la apariția noilor celule. Prin administrarea frecventă de BrdU sau 3H-timidină (una dintre metodele de identificare a celulelor stem adulte) la animale mature, un număr mare de neuroni și astrocite marcate au fost găsite în cornul lui Amon, ceea ce indică posibilitatea formării de noi neuroni nu numai în girusul dentat, ci și în alte părți ale hipocampului. Interesul pentru procesele de diviziune, diferențiere și moarte celulară din girusul dentat al hipocampului creierului matur se datorează și faptului că neuronii formați aici sunt localizați într-una dintre zonele cheie ale hipocampului, responsabilă de procesele de învățare și memorie.

Astfel, astăzi s-a stabilit că celulele progenitoare neuronale provin din celulele zonei subependimale a ventriculului lateral al rozătoarelor mature. Acestea migrează de-a lungul tractului de migrație rostral format din celulele astrogliale orientate longitudinal către bulbul olfactiv, unde sunt încorporate în stratul de celule granulare și se diferențiază în neuroni ai acestei structuri. Migrarea celulelor neuronale progenitoare a fost detectată în tractul de migrație rostral al maimuțelor adulte, ceea ce indică posibilitatea formării de noi neuroni în bulbul olfactiv al primatelor. Celulele stem neuronale au fost izolate din bulbul olfactiv al unui om adult și transferate în linii, ale căror celule clonate se diferențiază în neuroni, astrocite și oligodendrocite. Celulele stem au fost găsite în hipocampul creierului matur al șobolanilor, șoarecilor, maimuțelor și oamenilor. Celulele stem neuronale din zona subgranulară a fasciei dentate sunt o sursă de celule progenitoare care migrează către membrele mediale și laterale ale hipocampului, unde se diferențiază în celule granulare mature și elemente gliale. Axonii neuronilor formați de novo ai fasciei dentate sunt urmăriți până la câmpul CA3, ceea ce indică participarea neuronilor nou formați la implementarea funcțiilor hipocampice. În zonele de asociație ale neocortexului maimuțelor adulte s-au găsit celule progenitoare neuronale care migrează din zona subventriculară. În stratul VI al neocortexului creierului șoarecelui, noi neuroni piramidali sunt detectați la 2-28 de săptămâni după deteriorarea indusă și moartea neuronilor nativi din acest strat din cauza migrării celulelor progenitoare anterior latente ale zonei subventriculare. În cele din urmă, realitatea neurogenezei postnatale în creierul uman este evidențiată de o creștere de două ori a numărului de neuroni corticali, care continuă în primii 6 ani după naștere.

De o importanță nu lipsită de importanță pentru transplantul celular practic este problema reglării proceselor de reproducere și diferențiere a celulelor stem și progenitoare neuronale. Cei mai importanți factori care suprimă proliferarea celulelor progenitoare neuronale sunt glucocorticoizii, care reduc brusc numărul de diviziuni, în timp ce îndepărtarea glandelor suprarenale, dimpotrivă, crește semnificativ numărul de mitoze (Gould, 1996). Este demn de remarcat faptul că morfogeneza girusului dentat la rozătoare este cea mai intensă în primele două săptămâni de dezvoltare postnatală, în perioada de absență a reacției la stres, pe fondul unei scăderi accentuate a producției și secreției de hormoni steroizi ai cortexului suprarenal. Corticosteroizii inhibă migrarea celulelor granulare - noii neuroni nu sunt încorporați în stratul granular al girusului dentat, ci rămân în hilus. Se presupune că procesele de formare a conexiunilor sinaptice sunt simultan perturbate. Protecția celulelor împotriva unei astfel de „agresiuni steroizice” se realizează prin exprimarea minimă a receptorilor mineralocorticoizi și glucocorticoizi asupra celulelor granulare proliferative nu numai în timpul dezvoltării girusului dentat, ci și la animalele mature. Cu toate acestea, dintre toți neuronii din creier, neuronii hipocampului sunt cei caracterizați prin cel mai mare conținut de receptori glucocorticoizi, ceea ce provoacă efectul stresului asupra hipocampului. Stresul psihoemoțional și situațiile stresante inhibă neurogeneza, iar stresul cronic reduce drastic capacitatea animalelor de a dobândi noi abilități și de a învăța. Un efect negativ mai pronunțat al stresului cronic asupra neurogenezei este destul de ușor de înțeles dacă luăm în considerare starea predominant latentă a celulelor stem neuronale. La imobilizarea șobolanilor gestanți (pentru rozătoare - un factor de stres extrem de puternic), s-a constatat că stresul prenatal provoacă, de asemenea, o scădere a numărului de celule din girusul dentat și inhibă semnificativ neurogeneza. Se știe că glucocorticoizii participă la patogeneza stărilor depresive, al căror echivalent morfologic este inhibarea neurogenezei, reorganizarea patologică a neuronilor și a conexiunilor interneuronale și moartea celulelor nervoase. Pe de altă parte, agenții chimioterapici antidepresivi activează formarea de neuroni de novo, ceea ce confirmă legătura dintre procesele de formare a unor noi neuroni în hipocampus și dezvoltarea depresiei. Estrogenii au un efect semnificativ asupra neurogenezei, ale cărui efecte sunt opuse acțiunii glucocorticoizilor și constau în susținerea proliferării și viabilității celulelor progenitoare neuronale. Trebuie menționat că estrogenii cresc semnificativ capacitatea de învățare a animalelor. Unii autori asociază modificările ciclice ale numărului de celule granulare și excesul acestora la femele cu influența estrogenilor.

Se știe că neurogeneza este controlată de EGF, FGF și BDNF, însă mecanismele efectului semnalelor externe asupra celulelor stem de la mitogeni și factori de creștere nu au fost suficient studiate. S-a stabilit că PDGF menține in vitro direcția neuronală de diferențiere a celulelor progenitoare, iar factorul neurotrofic ciliar (CNTF), la fel ca triiodotironina, stimulează formarea elementelor predominant gliale - astrocite și oligodendrocite. Proteina activatoare a adenilat ciclazei hipofizare (PACAP) și peptida intestinală vasoactivă (VIP) activează proliferarea celulelor progenitoare neuronale, dar în același timp inhibă procesele de diferențiere a celulelor fiice. Opioidele, în special în cazul expunerii lor pe termen lung, inhibă semnificativ neurogeneza. Cu toate acestea, receptorii opioizi nu au fost identificați în celulele stem și celulele progenitoare neuronale ale girusului dentat (aceștia sunt prezenți în neuronii de diferențiere din perioada embrionară), ceea ce nu ne permite să evaluăm efectele directe ale opioidelor.

Nevoile medicinei regenerativ-plastice practice au obligat cercetătorii să acorde o atenție deosebită studiului pluri- și multipotenței celulelor stem. Implementarea acestor proprietăți la nivelul celulelor stem regionale ale unui organism adult ar putea asigura în viitor producerea materialului de transplant necesar. S-a demonstrat mai sus că stimularea epigenetică a celulelor stem neuronale permite obținerea de celule proliferative deja preformate conform fenotipurilor neuronale, ceea ce limitează numărul acestora. În cazul utilizării proprietăților totipotente ale unei celule stem embrionare, proliferarea până la obținerea unui număr suficient de celule are loc mai devreme decât diferențierea neuronală, iar celulele multiplicate sunt ușor convertite într-un fenotip neuronal. Pentru a obține celule stem neuronale, celulele stem embrionare (ESC) sunt izolate din masa celulară internă a blastocistului și cultivate în prezența obligatorie a LIF, care le păstrează totipotența și capacitatea de diviziune nelimitată. După aceasta, diferențierea neuronală a ESC este indusă folosind acid retinoic. Transplantarea celulelor stem neuronale rezultate în striatumul deteriorat de chinolină și 6-hidroxidopamină este însoțită de diferențierea lor în neuroni dopaminergici și serotoninergici. După injectarea în ventriculele creierului embrionar de șobolan, celulele progenitoare neuronale derivate din ESC migrează în diverse regiuni ale creierului receptor, inclusiv cortexul, striatumul, septul, talamusul, hipotalamusul și cerebelul. Celulele rămase în cavitatea ventriculară formează structuri epiteliale asemănătoare unui tub neural, precum și insule individuale de țesut non-neural. În parenchimul cerebral al embrionului receptor, celulele transplantate produc cele trei tipuri principale de celule ale sistemului nervos. Unele dintre ele au dendrite apicale alungite, corpuri celulare piramidale și axoni bazali care se proiectează în corpul calos. Astrocitele de origine donatoare extind procesele către capilarele din apropiere, iar oligodendrocitele intră în contact strâns cu manșoanele de mielină, participând la formarea mielinei. Astfel, celulele progenitoare neuronale obținute din ESC in vitro sunt capabile de migrare direcționată și diferențiere regională adecvată semnalelor micromediului, furnizând neuroni și glie în multe zone ale creierului în curs de dezvoltare.

Unii autori iau în considerare posibilitatea de- și transdiferențierii celulelor stem regionale ale unui organism adult. O confirmare indirectă a dediferențierii celulare în cultură, cu extinderea potențialului lor, este furnizată de datele privind grefarea celulelor stem neuronale de șoarece în măduva osoasă roșie, cu dezvoltarea ulterioară a liniilor celulare din acestea, rezultând celule funcțional active din sângele periferic. În plus, transplantul de celule neurosferice marcate genetic (LacZ) obținute din creierul matur sau embrionar în creierul șoarecilor iradiați cu hematopoieză suprimată a condus nu numai la formarea de derivate neuronale din celulele stem, ci a cauzat și generarea de celule sanguine, ceea ce indică pluripotența celulelor stem neuronale, realizată în afara creierului. Astfel, o celulă stem neuronală este capabilă să se diferențieze în celule sanguine sub influența semnalelor din micromediul măduvei osoase, cu transformare preliminară într-o celulă stem hematopoietică. Pe de altă parte, la transplantul de celule stem hematopoietice din măduva osoasă în creier, s-a stabilit diferențierea acestora sub influența micromediului țesutului cerebral în celule gliale și neuronale. În consecință, potențialul de diferențiere al celulelor stem neuronale și hematopoietice nu este limitat de specificitatea țesuturilor. Cu alte cuvinte, factorii micromediului local, diferiți de cei caracteristici țesuturilor cerebrale și ale măduvei osoase, sunt capabili să modifice direcția de diferențiere a acestor celule. S-a demonstrat că celulele stem neuronale introduse în sistemul venos al șoarecilor iradiați creează populații de celule hematopoietice mieloide, limfoide și imature în splină și măduvă osoasă. In vitro, a fost stabilit efectul proteinelor morfogenetice ale măduvei osoase (BMP) asupra supraviețuirii și diferențierii celulelor stem neuronale, determinând, ca și în stadiile incipiente ale embriogenezei, dezvoltarea lor în direcțiile neuronale sau gliale. În culturile de celule stem neuronale provenite de la embrioni de șobolan în vârstă de 16 zile, BMP-urile induc formarea de neuroni și astroglie, în timp ce în culturile de celule stem derivate din creierul perinatal se formează doar astrocite. În plus, BMP-urile suprimă generarea de oligodendrocite, care apar in vitro doar prin adăugarea antagonistului BMP noggin.

Procesele de transdiferențiere sunt nespecifice speciei: celulele stem hematopoietice din măduva osoasă umană transplantate în striatumul șobolanilor maturi migrează în substanța albă a capsulei externe, neocortexul ipsi- și contralateral, unde formează elemente celulare asemănătoare astrocitelor (Azizi și colab., 1998). Când celulele stem din măduva osoasă sunt alotransplantate în ventriculul lateral al șoarecilor nou-născuți, migrarea celulelor stem hematopoietice poate fi urmărită până la structurile prozencefalului și cerebelului. În striatum și stratul molecular al hipocampului, celulele migrate sunt transformate în astrocite, iar în bulbul olfactiv, stratul intern de celule granulare al cerebelului și formațiunea reticulară a trunchiului cerebral, acestea formează celule asemănătoare neuronilor cu o reacție pozitivă la neurofilamente. În urma administrării intravenoase de celule hematopoietice la șoareci adulți, micro- și astrocite marcate cu GFP au fost detectate în neocortex, talamus, trunchi cerebral și cerebel.

În plus, celulele stem mezenchimale din măduva osoasă, care dau naștere tuturor tipurilor de celule ale țesutului conjunctiv, pot suferi, de asemenea, transdiferențiere neuronală în anumite condiții (reamintim că sursa embrionară de mezenchim sunt celulele crestei neurale). S-a demonstrat că celulele stromale din măduva osoasă umană și murină, cultivate in vitro în prezența EGF sau BDNF, exprimă markerul nestin al celulelor progenitoare neuronale, iar adăugarea diferitelor combinații de factori de creștere duce la formarea de celule cu markeri gliali (GFAP) și neuroni (proteina nucleară, NeuN). Celulele stem mezenchimale singenice marcate, transplantate în ventriculul lateral al creierului șoarecilor nou-născuți, migrează și se localizează în prozencefal și cerebel fără a perturba citoarhitectura creierului receptor. Celulele stem mezenchimale din măduva osoasă se diferențiază în astrocite mature în striat și stratul molecular al hipocampului și populează bulbul olfactiv, straturile granulare ale cerebelului și formațiunea reticulară, unde se transformă în neuroni. Celulele stem mezenchimale din măduva osoasă umană sunt capabile să se diferențieze în macroglie in vitro și să se integreze în structurile creierului de șobolan după transplant. Transplantul direct de celule stem mezenchimale din măduva osoasă în hipocampul șobolanilor adulți este, de asemenea, însoțit de migrarea lor în parenchimul cerebral și de diferențierea neuroglială.

Se presupune că transplantul de celule stem din măduva osoasă ar putea extinde posibilitățile terapiei celulare în bolile SNC caracterizate prin moartea patologică excesivă a neuronilor. Trebuie menționat, totuși, că nu toți cercetătorii recunosc faptul transformării reciproce a celulelor stem neuronale și hematopoietice, în special in vivo, ceea ce se datorează, din nou, lipsei unui marker fiabil pentru evaluarea transdiferențierii și dezvoltării ulterioare a acestora.

Transplantul de celule stem deschide noi orizonturi pentru terapia genică celulară a patologiei neurologice ereditare. Modificarea genetică a celulelor stem neuronale implică inserarea de construcții genetice de reglare, ale căror produse interacționează cu proteinele ciclului celular în modul de reglare automată. Transducția acestor gene în celule progenitoare embrionare este utilizată pentru multiplicarea celulelor stem neuronale. Majoritatea clonelor celulare modificate genetic se comportă ca linii celulare stabile, fără a prezenta semne de transformare in vivo sau in vitro, dar au o capacitate pronunțată de inhibare prin contact a proliferării. La transplant, celulele transfectate multiplicate sunt integrate în țesutul receptor fără a perturba citoarhitectura și fără a suferi transformare tumorală. Celulele stem neuronale donatoare nu deformează zona de integrare și concurează în mod egal pentru spațiu cu celulele progenitoare gazdă. Cu toate acestea, în a 2-a-3-a zi, intensitatea diviziunii celulelor transfectate scade brusc, ceea ce corespunde inhibării prin contact a proliferării lor in vitro. Embrionii-receptori ai transfectanților stem neuronali nu prezintă anomalii în dezvoltarea sistemului nervos central, toate zonele creierului în contact cu transplantul se dezvoltă normal. După transplant, clonele de celule stem neuronale migrează rapid din zona de injecție și adesea depășesc zonele embrionare corespunzătoare de-a lungul tractului rostral, integrându-se în mod adecvat cu alte zone ale creierului. Integrarea clonelor modificate genetic și a liniilor celulare transfectate de celule stem neuronale în creierul organismului gazdă este caracteristică nu numai perioadei embrionare: aceste celule sunt implantate în numeroase zone ale sistemului nervos central al fătului, nou-născutului, adultului și chiar al organismului receptor în vârstă și demonstrează capacitatea de integrare și diferențiere adecvată. În special, după transplantul în cavitatea ventriculară a creierului, celulele transfectate migrează fără a deteriora bariera hematoencefalică și devin componente celulare funcționale integrante ale țesutului cerebral. Neuronii donatori formează sinapse adecvate și exprimă canale ionice specifice. Cu integritatea barierei hematoencefalice păstrată, astroglia, un derivat al celulelor stem neuronale transfectate, extinde procesele la vasele cerebrale, iar oligodendrocitele derivate de la donatori exprimă proteina bazică a mielinei și mielinizează procesele neuronale.

În plus, celulele stem neuronale sunt transfectate pentru a fi utilizate ca vectori celulari. Astfel de construcții genetice vectoriale asigură o expresie stabilă in vivo a genelor străine implicate în dezvoltarea sistemului nervos sau sunt utilizate pentru a corecta defectele genetice existente, deoarece produsele acestor gene sunt capabile să compenseze diverse anomalii biochimice ale sistemului nervos central. Activitatea de migrare ridicată a celulelor stem transfectate și implantarea adecvată în zonele germinale ale diferitelor zone ale creierului în curs de dezvoltare ne permit să sperăm la o restaurare completă a deficienței ereditare a enzimelor celulare. În modelarea sindromului ataxie-telangiectazie (linii mutante de șoareci pg și pcd), celulele Purkinje dispar din cerebelul animalelor experimentale în primele săptămâni de dezvoltare postnatală. S-a demonstrat că introducerea celulelor stem neuronale în creierul acestor animale este însoțită de diferențierea lor în celule Purkinje și neuroni granulari. La mutanții pcd, tulburările de coordonare a mișcărilor sunt parțial corectate, iar intensitatea tremorului este redusă. Rezultate similare au fost obținute prin transplantul de celule stem neuronale umane clonate la primate la care degenerarea celulelor Purkinje a fost indusă folosind onconază. După transplant, celulele stem neuronale donatoare au fost găsite în straturile granulare, moleculare și de celule Purkinje ale parenchimului cerebelos. Prin urmare, modificarea genetică a celulelor progenitoare neuronale poate oferi o modificare stabilă și dedicată a fenotipului, rezistentă la influențele externe. Acest lucru este deosebit de important în procesele patologice asociate cu dezvoltarea factorilor la receptor care împiedică supraviețuirea și diferențierea celulelor donatoare (de exemplu, în timpul agresiunii imune).

Mucopolizaharidoza de tip VII la om este caracterizată prin neurodegenerare și dizabilitate intelectuală progresivă, modelată la șoareci printr-o mutație de deleție în gena beta-glucuronidază. După transplantul de celule stem neuronale transfectate care secretă beta-glucuronidază în ventriculele cerebrale ale șoarecilor receptori nou-născuți cu defecte, celulele donatoare se găsesc mai întâi în zona terminală și apoi se răspândesc în tot parenchimul cerebral, corectând stabil integritatea lizozomilor din creierul șoarecilor mutanți. Într-un model de boală Tay-Sachs, celulele stem neuronale transduse de retrovirus, atunci când sunt administrate in utero la fetuși de șoarece și transplantate la șoareci nou-născuți, asigură o exprimare eficientă a subunității beta a beta-hexosaminidazei la receptorii cu o mutație care duce la acumularea patologică de beta2-gangliozidă.

O altă direcție a medicinei regenerative este stimularea potențialului proliferativ și de diferențiere al propriilor celule stem neuronale ale pacientului. În special, celulele stem neuronale secretă NT-3 în timpul hemisecției măduvei spinării și asfixiei cerebrale la șobolani, exprimă NGF și BDNF în sept și ganglionii bazali, tirozin hidroxilaze în striat, precum și reelină în cerebel și proteină bazică a mielinei în creier.

Cu toate acestea, problemelor legate de stimularea neurogenezei nu li se acordă în mod evident suficientă atenție. Câteva studii sugerează că sarcina funcțională asupra centrelor nervoase responsabile de distingerea mirosurilor se reflectă în formarea de noi neuroni. La șoarecii transgenici cu deficit de molecule de adeziune neuronală, o scădere a intensității neurogenezei și o scădere a numărului de neuroni care migrează către bulbii olfactivi au fost combinate cu o afectare a capacității de a distinge mirosurile, deși pragul de percepție a mirosurilor și memoria olfactivă pe termen scurt nu au fost afectate. Starea funcțională a celulelor girusului dentat joacă un rol important în reglarea neurogenezei: o slăbire a efectului glutamatului asupra celulelor granulare după distrugerea cortexului entorinal promovează proliferarea și diferențierea neuronilor, iar stimularea fibrelor căii perforante (principalul input aferent către hipocampus) provoacă inhibarea neurogenezei. Antagoniștii receptorilor NMDA activează procesele de formare a noilor neuroni, în timp ce agoniștii, dimpotrivă, reduc intensitatea neurogenezei, ceea ce, în efect, seamănă cu acțiunea glucocorticosteroizilor. În literatura de specialitate se găsesc rezultate contradictorii ale cercetărilor: informațiile privind efectul inhibitor dovedit experimental al neurotransmițătorului excitator glutamatul asupra neurogenezei sunt inconsistente cu datele privind stimularea proliferării celulelor progenitoare și apariția de noi neuroni cu o creștere a activității convulsive în hipocampul animalelor cu modele experimentale de epilepsie cu caină și pilocarpină. În același timp, în modelul tradițional de epilepsie cauzată de stimularea multiplă subprag a unei anumite zone a creierului (kindling) și caracterizată prin moarte neuronală mai puțin pronunțată, intensitatea neurogenezei crește doar în faza târzie a kindlingului, când se observă leziuni și moarte neuronilor în hipocamp. S-a demonstrat că în epilepsie, activitatea convulsivă stimulează neurogeneza cu localizarea anormală a unor noi neuroni granulari, mulți dintre aceștia apărând nu numai în girusul dentat, ci și în hilus. Astfel de neuroni sunt de mare importanță în dezvoltarea germinării fibrelor mușchioase, deoarece axonii lor formează colaterale inverse, în mod normal absente, care formează numeroase sinapse cu celulele granulare vecine.

Utilizarea celulelor stem neuronale regionale deschide noi perspective pentru aplicarea transplantului celular în tratamentul bolilor neurodegenerative metabolice și genetice, al bolilor demielinizante și al afecțiunilor post-traumatice ale sistemului nervos central. Înainte de efectuarea transplantului de celule de înlocuire conform uneia dintre metode, se efectuează selecția și extinderea tipului necesar de celule progenitoare neuronale ex vivo, cu scopul introducerii lor ulterioare direct în zona afectată a creierului. Efectul terapeutic, în acest caz, se datorează înlocuirii celulelor deteriorate sau eliberării locale de factori de creștere și citokine. Această metodă de terapie regenerativ-plastică necesită transplantul unui număr suficient de mare de celule cu caracteristici funcționale predeterminate.

Studii suplimentare privind caracteristicile moleculare și potențialul regenerativ-plastic al celulelor stem cerebrale mature, precum și capacitatea celulelor stem regionale de origine tisulară diferită de a se transdiferenția, ar trebui, de asemenea, considerate oportune. Astăzi, screening-ul antigenelor celulelor stem hematopoietice din măduva osoasă a fost deja efectuat, cu determinarea unei combinații de markeri de celule capabile de transdiferențiere în celule stem progenitoare neuronale (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Au fost obținute celule care formează neurosfere in vitro și formează neuroni atunci când sunt transplantate în creierul șoarecilor imunodeficienți nou-născuți. De interes pentru xenotransplantologia celulară sunt rezultatele studiilor privind posibilitatea transplantării încrucișate a celulelor stem la indivizi cu taxoni evolutiv îndepărtați. Rezultatele implantării celulelor stem neuronale în zona tumorii cerebrale rămân fără o interpretare corectă: celulele transplantate migrează activ în întregul volum tumoral fără a depăși limitele sale, iar atunci când celulele sunt introduse în partea intactă a creierului, se observă migrarea lor activă către tumoră. Chestiunea semnificației biologice a unei astfel de migrații rămâne deschisă.

Trebuie menționat că transplantul cu succes al celulelor stem neuronale, precum și al altor celule progenitoare neuronale obținute din celule stem embrionare (CSE), este posibil numai atunci când se utilizează celule progenitoare neuronale înalt purificate, deoarece celulele stem embrionare nediferențiate sunt inevitabil transformate în teratoame și teratocarcinoame atunci când sunt transplantate la un receptor imunocompetent adult. Chiar și o cantitate minimă de celule slab diferențiate în suspensia de celule donatoare crește brusc tumorogenitatea transplantului și crește inacceptabil riscul dezvoltării tumorii sau al formării de țesut non-neural. Obținerea de populații omogene de celule progenitoare neuronale este posibilă atunci când se utilizează celule care apar în anumite stadii ale embriogenezei normale ca sursă alternativă de țesut donator. O altă abordare implică eliminarea atentă a populațiilor de celule nedorite prin selecție specifică liniei celulare. Utilizarea CSE pentru neurotransplantare după expunerea lor insuficientă in vitro la factorii de creștere este, de asemenea, periculoasă. În acest caz, nu se poate exclude un eșec al programului de diferențiere neuronală cu formarea de structuri inerente tubului neural.

Astăzi este destul de evident că celulele stem neuronale prezintă tropism pentru zonele modificate patologic ale sistemului nervos central și au un efect regenerativ-plastic pronunțat. Micromediul din locul morții celulare a țesutului nervos modelează direcția de diferențiere a celulelor transplantate, completând astfel deficiența elementelor neuronale specifice din zona de afectare a SNC. În unele procese neurodegenerative, apar semnale neurogene pentru recapitularea neurogenezei, iar celulele stem neuronale ale creierului matur sunt capabile să răspundă la aceste informații instructive. Numeroase date experimentale servesc ca o ilustrare clară a potențialului terapeutic al celulelor stem neuronale. Administrarea intracisternală a unei clone de celule stem neuronale la animale cu ligatura arterei cerebrale medii (un model de accident vascular cerebral ischemic) ajută la reducerea ariei și volumului zonei cerebrale modificate distructiv, în special în cazul transplantului de celule stem neuronale împreună cu FGF2. Imunocitochimic, se observă migrarea celulelor donatoare în zona ischemică cu integrarea lor ulterioară cu celulele cerebrale receptoare intacte. Transplantarea de celule imature din linia neuroepitelială de șoarece MHP36 în creierul șobolanilor cu accident vascular cerebral experimental îmbunătățește funcția senzoriomotorie, iar introducerea acestor celule în ventriculele cerebrale sporește funcția cognitivă. Transplantarea de celule hematopoietice preformate neuronal din măduva osoasă umană la șobolani elimină disfuncția cortexului cerebral cauzată de leziunile ischemice. În acest caz, celulele progenitoare neuronale xenogene migrează de la locul injectării în zona modificărilor distructive din țesutul cerebral. Transplantul intracranian de celule omoloage din măduva osoasă în cazul leziunilor traumatice ale cortexului cerebral la șobolani duce la restaurarea parțială a funcției motorii. Celulele donatoare se grefează, proliferează, suferă o diferențiere neuronală în neuroni și astrocite și migrează spre leziune. Atunci când sunt injectate în striatumul șobolanilor adulți cu accident vascular cerebral experimental, celulele stem neuronale umane clonate înlocuiesc celulele SNC deteriorate și restabilesc parțial funcția cerebrală afectată.

Celulele stem neuronale umane sunt izolate în principal din telencefalul embrionar, care se dezvoltă mult mai târziu decât părțile situate mai caudal ale trunchiului nervos. S-a demonstrat posibilitatea izolării celulelor stem neuronale din măduva spinării a unui făt uman în vârstă de 43-137 de zile, deoarece în prezența EGF și FGF2 aceste celule formează neurosfere și prezintă multipotență la pasajele timpurii, diferențiendu-se în neuroni și astrocite. Cu toate acestea, cultivarea pe termen lung a celulelor progenitoare neuronale (peste 1 an) le privează de multipotență - astfel de celule sunt capabile să se diferențieze doar în astrocite, adică devin unipotente. Celulele stem neuronale regionale pot fi obținute ca urmare a bulbectomiei parțiale și, după reproducerea în cultură în prezența LIF, transplantate aceluiași pacient cu modificări neurodegenerative în alte părți ale sistemului nervos central. În clinică, terapia celulară de înlocuire folosind celule stem neuronale a fost efectuată pentru prima dată pentru a trata pacienții cu accident vascular cerebral însoțit de leziuni ale ganglionilor bazali ai creierului. Ca urmare a transplantului de celule donatoare, s-a observat o îmbunătățire a stării clinice a majorității pacienților.

Unii autori consideră că abilitatea celulelor stem neuronale de a se grefa, migra și integra în diverse zone ale țesutului nervos în caz de afectare a SNC deschide posibilități nelimitate pentru terapia celulară nu numai a proceselor patologice locale, ci și a celor extinse (accident vascular cerebral sau asfixie), multifocale (scleroză multiplă) și chiar globale (majoritatea tulburărilor metabolice ereditare sau demențele neurodegenerative). Într-adevăr, atunci când celulele stem neuronale clonate de șoarece și om sunt transplantate la animale receptoare (șoareci și primate, respectiv) cu degenerare a neuronilor dopaminergici din sistemul mezostriatal indusă de introducerea metil-fenil-tetrapiridinei (model al bolii Parkinson) cu 8 luni înainte de transplant, celulele stem neuronale donatoare se integrează în SNC-ul receptoarelor. O lună mai târziu, celulele transplantate sunt localizate bilateral de-a lungul mezencefalului. Unii dintre neuronii rezultați de origine donatoare exprimă tirozin hidrolază în absența semnelor unei reacții imune la transplant. La șobolanii cărora li s-a administrat 6-hidroxidopamină (un alt model experimental al bolii Parkinson), adaptarea celulelor transplantate la micromediul din creierul gazdă a fost determinată de condițiile de cultivare a celulelor stem neuronale înainte de transplantul lor. Celulele stem neuronale, proliferând rapid in vitro sub influența EGF, au compensat deficitul de neuroni dopaminergici în striatumul deteriorat mai eficient decât celulele din culturile de 28 de zile. Autorii consideră că acest lucru se datorează pierderii capacității de a percepe semnalele de diferențiere corespunzătoare în timpul procesului de diviziune celulară a celulelor progenitoare neuronale in vitro.

În unele studii, s-au făcut încercări de a crește eficacitatea impactului asupra proceselor de reinervare a striatumului deteriorat prin transplantul de celule striate embrionare în această zonă ca sursă de factori neurotrofici, cu transplantul simultan de neuroni dopaminergici ai mezencefalului ventral. După cum s-a dovedit, eficacitatea neurotransplantării depinde în mare măsură de metoda de introducere a țesutului nervos embrionar. Ca urmare a studiilor privind transplantul de preparate de țesut nervos embrionar în sistemul ventricular al creierului (pentru a evita lezarea parenchimului striatului), s-au obținut informații despre efectul lor pozitiv asupra defectului motor în parkinsonism.

Cu toate acestea, în alte studii, observațiile experimentale au arătat că transplantul de preparate de țesut nervos embrionar din mezencefalul ventral care conțin neuroni dopaminergici în ventriculul cerebral, precum și transplantul de elemente neuronale embrionare GABA-ergice în striatul șobolanilor cu hemiparkinsonism, nu promovează restaurarea funcțiilor afectate ale sistemului dopaminergic. Dimpotrivă, analiza imunocitochimică a confirmat datele privind rata scăzută de supraviețuire a neuronilor dopaminergici din mezencefalul ventral transplantați în striatul șobolanilor. Efectul terapeutic al transplantului intraventricular de țesut nervos embrionar al mezencefalului ventral a fost realizat numai în condițiile implantării simultane a unui preparat de celule striatale embrionare în striatul denervat. Autorii consideră că mecanismul acestui efect este asociat cu efectul trofic pozitiv al elementelor GABA-ergice ale striatului embrionar asupra activității dopaminergice specifice a transplanturilor intraventriculare de mezencefal ventral. O reacție glială pronunțată la transplanturi a fost însoțită de o ușoară regresie a parametrilor testului pentru apomorfină. Aceștia din urmă, la rândul lor, s-au corelat cu conținutul de GFAP din serul sanguin, ceea ce a indicat direct o încălcare a permeabilității barierei hematoencefalice. Pe baza acestor date, autorii au concluzionat că nivelul de GFAP din serul sanguin poate fi utilizat ca un criteriu adecvat pentru evaluarea stării funcționale a transplantului, iar permeabilitatea crescută a barierei hematoencefalice pentru antigene neurospecifice, cum ar fi GFAP, este o legătură patogenetică în dezvoltarea eșecului transplantului din cauza leziunilor autoimune ale țesutului nervos al receptorului.

Din punctul de vedere al altor cercetători, grefarea și integrarea celulelor stem neuronale după transplant sunt stabile și pe tot parcursul vieții, deoarece celulele donatoare se găsesc la receptori timp de cel puțin doi ani după transplant și fără o scădere semnificativă a numărului lor. Încercările de a explica acest lucru prin faptul că, într-o stare nediferențiată, celulele stem neuronale nu exprimă molecule MHC clasa I și II la un nivel suficient pentru a induce o reacție de respingere imună pot fi considerate adevărate doar în raport cu precursorii neuronali slab diferențiați. Cu toate acestea, nu toate celulele stem neuronale din creierul receptorului sunt conservate într-o stare latentă imatură. Majoritatea lor suferă o diferențiere, timp în care moleculele MHC sunt exprimate complet.

În special, eficiența insuficientă a utilizării transplantului intrastriatal de preparate embrionare de mezencefal ventral care conțin neuroni dopaminergici pentru tratamentul parkinsonismului experimental este asociată cu rata scăzută de supraviețuire a neuronilor dopaminergici transplantați (doar 5-20%), care este cauzată de glioza reactivă care însoțește traumatismul local al parenchimului cerebral în timpul transplantului. Se știe că traumatismul local al parenchimului cerebral și glioza concomitentă duc la perturbarea integrității barierei hematoencefalice cu eliberarea de antigene ale țesutului nervos, în special OCAR și antigen specific neuronului, în sângele periferic. Prezența acestor antigene în sânge poate provoca producerea de anticorpi citotoxici specifici împotriva acestora și dezvoltarea agresivității autoimune.

V. Tsymbalyuk și coautorii (2001) raportează că punctul de vedere tradițional încă se menține, conform căruia sistemul nervos central este o zonă privilegiată imunologic, izolată de sistemul imunitar de bariera hematoencefalică. În analiza literaturii de specialitate, autorii citează o serie de lucrări care indică faptul că acest punct de vedere nu corespunde pe deplin esenței proceselor imune din creierul mamiferelor. S-a stabilit că substanțele marcate introduse în parenchimul cerebral pot ajunge la ganglionii limfatici cervicali profunzi, iar după injectarea intracerebrală de antigeni, se formează anticorpi specifici în organism. Celulele ganglionilor limfatici cervicali răspund la astfel de antigeni prin proliferare, începând cu a 5-a zi după injectare. Formarea de anticorpi specifici a fost relevată și în timpul transplantului de piele în parenchimul cerebral. Autorii analizei oferă mai multe căi ipotetice pentru transportul antigenului din creier în sistemul limfatic. Una dintre ele este trecerea antigenelor din spațiile perivasculare în spațiul subarahnoidian. Se presupune că spațiile perivasculare localizate de-a lungul vaselor mari ale creierului sunt echivalentul sistemului limfatic din creier. A doua cale se întinde de-a lungul fibrelor albe - prin osul etmoid în vasele limfatice ale mucoasei nazale. În plus, există o rețea extinsă de vase limfatice în dura mater. Impermeabilitatea barierei hematoencefalice pentru limfocite este, de asemenea, destul de relativă. S-a dovedit că limfocitele activate sunt capabile să producă enzime care afectează permeabilitatea structurilor „filtrului imun” al creierului. La nivelul venulelor postcapilare, receptorii T activați penetrează bariera hematoencefalică intactă. Teza despre absența celulelor din creier care reprezintă antigene nu rezistă criticilor. În prezent, posibilitatea reprezentării antigenelor în SNC prin cel puțin trei tipuri de celule a fost dovedită în mod convingător. În primul rând, acestea sunt celule dendritice derivate din măduva osoasă, care sunt localizate în creier de-a lungul vaselor mari de sânge și în substanța albă. În al doilea rând, antigenele sunt capabile să prezinte antigene în celulele endoteliale ale vaselor de sânge cerebrale și, în asociere cu antigenele MHC, susțin creșterea clonală a celulelor T specifice acestor antigene. În al treilea rând, celulele microgliale și astrogliale acționează ca agenți prezentatori de antigen. Participând la formarea răspunsului imun în sistemul nervos central, astrocitele dobândesc proprietățile unei celule efectoare imune și exprimă o serie de antigene, citokine și imunomodulatori. Atunci când sunt incubate cu interferon-γ (y-INF), celulele astrogliale exprimă in vitro antigene MHC clasa I și II, iar astrocitele stimulate sunt capabile de prezentare de antigen și de menținere a proliferării clonale a limfocitelor.

Traumatismele țesutului cerebral, inflamația postoperatorie, edemul și depozitele de fibrină care însoțesc transplantul de țesut nervos embrionar creează condiții pentru creșterea permeabilității barierei hematoencefalice cu afectarea autotoleranței, sensibilizării și activării limfocitelor CD3+CD4+. Prezentarea auto- și aloantigenelor este realizată de astrocite și celule microgliale care răspund la y-INF prin exprimarea moleculelor MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, moleculelor costimulatoare B7-1 (CD80) și B7-2 (CD86), precum și prin secreția de IL-Ia, IL-Ip și y-INF.

Prin urmare, faptul că supraviețuirea mai lungă a țesutului nervos embrionar după transplantul intracerebral decât după administrarea sa periferică poate fi cu greu asociată cu absența inițierii imunității de transplant. Mai mult, monocitele, limfocitele activate (celule citotoxice CD3+CD8+ și celule T helper) și citokinele pe care le produc, precum și anticorpii împotriva antigenelor transplantului periferic de țesut nervos embrionar joacă un rol major în procesul de respingere a acestuia. Un nivel scăzut de expresie a moleculelor MHC în țesutul nervos embrionar este de o anumită importanță în crearea condițiilor pentru o rezistență mai lungă a neurotransplanturilor la procesele imune ale celulelor T. Acesta este motivul pentru care, în experiment, inflamația imună după transplantul de țesut nervos embrionar în creier se dezvoltă mai lent decât după grefa de piele. Cu toate acestea, se observă distrugerea completă a transplanturilor individuale de țesut nervos după 6 luni. În acest caz, limfocitele T restricționate de antigenele MHC clasa II sunt localizate predominant în zona de transplant (Nicholas și colab., 1988). S-a stabilit experimental că, în timpul neurotransplantului xenologic, epuizarea celulelor T helper (L3T4+), dar nu și a limfocitelor T citotoxice (Lyt-2), prelungește supraviețuirea țesutului nervos de șobolan în creierul șoarecilor receptori. Respingerea neurotransplantului este însoțită de infiltrarea acestuia de către macrofagele și limfocitele T gazdă. În consecință, macrofagele gazdă și celulele microgliale activate acționează in situ ca celule imunostimulatoare prezentatoare de antigen, iar expresia crescută a antigenelor MHC clasa I donatoare sporește activitatea killer a limfocitelor T citotoxice receptore.

Nu are rost să analizăm numeroasele încercări speculative de a explica faptul respingerii neurotransplantului prin reacția sistemului imunitar al receptorului la celulele endoteliale sau elementele gliale ale donatorului, deoarece chiar și liniile pure de celule progenitoare neuronale sunt supuse atacului imun. Este demn de remarcat faptul că exprimarea liganzilor Fas de către celulele cerebrale care leagă receptorii apoptozei (moleculele Fas) de limfocitele T care infiltrează creierul și induc apoptoza acestora joacă un rol important în mecanismele de supraviețuire mai lungă a transplantului în SNC, acesta fiind un mecanism de protecție tipic al țesuturilor autoimunogene trans-barieră.

După cum notează pe bună dreptate V. Tsymbalyuk și coautorii (2001), transplantul de țesut nervos embrionar se caracterizează prin dezvoltarea inflamației cu participarea celulelor sensibilizate la antigenele cerebrale și a celulelor activate, a anticorpilor, precum și ca urmare a producției locale de citokine. Un rol important în aceasta îl joacă sensibilizarea preexistentă a organismului la antigenele cerebrale, care apare în timpul dezvoltării bolilor SNC și poate fi îndreptată împotriva antigenelor transplantului. Acesta este motivul pentru care supraviețuirea pe termen lung a neurotransplanturilor histoincompatibile se realizează doar prin suprimarea sistemului imunitar cu ciclosporină A sau prin introducerea de anticorpi monoclonali în limfocitele CD4+ ale receptorului.

Astfel, multe probleme ale neurotransplantului rămân nerezolvate, inclusiv cele legate de compatibilitatea imunologică a țesuturilor, care pot fi rezolvate doar după cercetări fundamentale și clinice specifice.