^

Sănătate

Celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical

, Editorul medical
Ultima examinare: 04.07.2025
Fact-checked
х

Tot conținutul iLive este revizuit din punct de vedere medical sau verificat pentru a vă asigura cât mai multă precizie de fapt.

Avem linii directoare de aprovizionare stricte și legătura numai cu site-uri cu reputație media, instituții de cercetare academică și, ori de câte ori este posibil, studii medicale revizuite de experți. Rețineți că numerele din paranteze ([1], [2], etc.) sunt link-uri clickabile la aceste studii.

Dacă considerați că oricare dintre conținuturile noastre este inexactă, depășită sau îndoielnică, selectați-o și apăsați pe Ctrl + Enter.

Sângele din cordonul ombilical este o sursă bună de celule stem hematopoietice din punct de vedere al potențialului proliferativ și al capacităților de repopulare a celulelor hematopoietice. S-a demonstrat în repetate rânduri că, până la naștere, sângele din cordonul ombilical conține un număr suficient de mare de celule progenitoare hematopoietice slab angajate. Unii autori consideră că avantajul transplantului de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical constă în lipsa necesității de a căuta un donator compatibil cu antigenele HLA. În opinia lor, imaturitatea sistemului imunitar al nou-născutului determină o activitate funcțională redusă a celulelor imunocompetente și, în consecință, o incidență mai mică a bolii grefă-contra-gazdă severe decât în cazul transplantului de măduvă osoasă. În același timp, rata de supraviețuire a unui transplant de celule din sângele cordonului ombilical nu este mai mică decât cea a celulelor din măduva osoasă, chiar și în cazul utilizării unui număr mai mic de HSC administrate la 1 kg din greutatea corporală a pacientului. Cu toate acestea, în opinia noastră, problemele legate de numărul optim de celule din sângele cordonului ombilical transplantate, necesare pentru grefarea eficientă în corpul receptorului, compatibilitatea lor imunologică și o serie de alte aspecte ale transplantului de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical necesită o analiză mai serioasă.

trusted-source[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Obținerea de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical

Procedura de obținere a celulelor stem hematopoietice din sângele din cordonul ombilical necesită recoltarea acestora imediat după nașterea copilului și separarea lor de placentă atunci când placenta este in utero sau ex utero, precum și în timpul unei cezariene, dar și ex utero. S-a demonstrat că, dacă timpul de la momentul nașterii până la separarea nou-născutului de placentă se reduce la 30 de secunde, volumul de sânge din cordonul ombilical obținut crește în medie cu 25-40 ml. Dacă această procedură este efectuată ulterior, se pierde aceeași cantitate de sânge. S-a stabilit că separarea precoce a copilului de placentă nu implică consecințe negative pentru nou-născut.

Institutul Rus de Cercetare în Hematologie și Transfuziologie a dezvoltat tehnologii eficiente și cu costuri reduse pentru obținerea sângelui din cordonul ombilical atât în timpul nașterii normale ((70,2+25,8) ml), cât și în timpul cezarienei ((73,4+25,1) ml). A fost propusă o metodă de separare a sângelui din cordonul ombilical cu un randament suficient de mare de celule nucleate și mononucleare - (83,1+9,6) și, respectiv, (83,4+14,1)%. A fost îmbunătățită o metodă de crioconservare a sângelui din cordonul ombilical, care asigură o conservare ridicată a celulelor mononucleare și a UFC-GM - (96,8+5,7) și, respectiv, (89,6+22,6)%. A fost determinată eficiența metodei de drenaj pentru colectarea sângelui din cordonul ombilical folosind recipientul Kompoplast-300 (Rusia). Autorii au colectat sânge din cordonul ombilical imediat după nașterea copilului și separarea acestuia de placentă, în condițiile plasării placentei in utero sau ex utero. Înainte de puncția venei ombilicale, cordonul ombilical a fost tratat o dată cu tinctură de iod 5%, apoi de două ori cu alcool etilic 70%. Sângele a curs spontan prin tuburile de legătură în recipient. Procedura de recoltare a durat cel mult 10 minute. Volumul mediu a 66 de probe de sânge din cordonul ombilical colectate prin drenaj a fost de (72 + 28) ml, iar numărul de leucocite din volumul total mediu al probei a fost de (1,1 + 0,6) x 107. La analiza sterilității sângelui din cordonul ombilical (contaminare bacteriană, HIV-1, virusurile hepatitei B și C, sifilis și infecție cu citomegalovirus), anticorpii IgG împotriva virusului hepatitei C au fost detectați într-o singură probă. Într-un alt studiu, placenta a fost plasată cu fața fetală în jos pe un cadru special imediat după naștere, iar cordonul ombilical a fost tratat cu soluție de iod 5% și alcool etilic 75%. Vena ombilicală a fost drenată folosind un ac dintr-un sistem de transfuzie (G16). Sângele a curs spontan în recipient. Volumul mediu de sânge recoltat în acest mod a fost de (55+25) ml. În lucrarea lui G. Kogler și colab. (1996), sângele din cordonul ombilical a fost recoltat folosind o metodă închisă și s-au obținut volume mari de sânge - în medie (79+26) ml. Autorii notează că dintre cele 574 de probe de sânge din cordonul ombilical, aproximativ 7% conțineau mai puțin de 40 ml de sânge, ceea ce nu permite utilizarea lor pentru transplant. K. Isoyama și colab. (1996), recoltând sânge din cordonul ombilical prin exfuzie activă folosind seringi, au obținut o medie de 69,1 ml de sânge (volumul de sânge din cordonul ombilical a variat de la 15 la 135 ml). În cele din urmă, A. Abdel-Mageed PI și colab. (1997) au reușit să obțină o medie de 94 ml de sânge din cordonul ombilical (de la 56 la 143 ml) prin cateterizarea venei ombilicale.

Pentru a reduce riscul de infecție iatrogenă și contaminare cu secreții materne, a fost dezvoltat un sistem închis de colectare a sângelui, bazat pe sistemul de transfuzie utilizat pe scară largă de Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (SUA), care conține 62,5 ml de CPDA (citrat-fosfat-dextroză cu adenină) ca anticoagulant. Tehnologia de obținere a materialului este de o importanță primordială pentru prepararea unei probe de înaltă calitate în ceea ce privește volumul, conținutul și puritatea suspensiei celulare. Dintre metodele existente de colectare a sângelui din cordonul ombilical, care sunt clasificate convențional în sisteme închise, semi-deschise și deschise, ar trebui acordată preferință primei, deoarece sistemul închis reduce semnificativ riscul de contaminare microbiană a materialului, precum și de contaminare a suspensiei celulare cu celule materne.

A. Nagler și colab. (1998) au efectuat o analiză comparativă a eficienței tuturor celor trei sisteme de colectare a sângelui din cordonul ombilical. În prima variantă, procedura a fost efectuată într-un sistem închis prin exfolierea sângelui direct într-un recipient. În a doua variantă, sângele din cordonul ombilical a fost obținut prin exfuzia activă a sângelui cu o seringă MP1, urmată de spălarea venelor placentare și drenarea simultană a sângelui într-un recipient (metoda deschisă). În a treia variantă, sângele a fost colectat într-un sistem semi-deschis prin extragerea activă cu seringi și spălarea acestuia prin artera ombilicală cu exfuzie simultană într-un recipient. În prima variantă, autorii au obținut sânge din cordonul ombilical într-un volum de (76,4+32,1) ml cu un conținut leucocitar de (10,5+3,6) x 10⁶ în 1 ml de sânge. În a doua variantă, indicatorii corespunzători au fost (174,4+42,8) ml și (8,8+3,4) x 10⁶ / ml; în al treilea - (173,7+41,3) ml și (9,3+3,8) x 10 6 /ml. Cea mai frecventă infecție a probelor de sânge din cordonul ombilical a fost observată la utilizarea unui sistem deschis. S-a stabilit o corelație directă între masa placentei și volumul de sânge extras - odată cu creșterea masei placentei, crește și cantitatea de sânge recoltată.

După recoltarea sângelui din cordonul ombilical, urmează etapa de separare - izolarea celulelor mononucleare și purificarea suspensiei celulare din eritrocite. În condiții experimentale, celulele nucleate sunt izolate prin sedimentare cu metilceluloză în timpul lizei eritrocitelor cu clorură de amoniu. Cu toate acestea, metilceluloza nu ar trebui utilizată în scopuri clinice, deoarece pierderile de celule stem hematopoietice pe aceasta ajung la 50-90%. Liza eritrocitelor nu se efectuează aproape niciodată în clinică din cauza volumelor mari de soluție de lucru, deși procentul de izolare a celulelor nucleate cu fenotipul CD34+, precum și a celulelor progenitoare cu funcțiile CFU-GM și CFU-GEMM în acest mod este semnificativ mai mare. Este raportată apariția unui nou mijloc de izolare a celulelor mononucleare într-un gradient de densitate, soluția Buyant Density (BDS72). Această substanță are următorii parametri fiziologici: pH - 7,4, osmolalitate - 280 mOsm/kg, densitate - 1,0720 g/ml. Conform autorilor, poate fi utilizat pentru a izola până la 100% din celulele CD34-pozitive și a elimina 98% din eritrocite. Cu toate acestea, BDS72 nu este încă utilizat în clinică.

În metodele aprobate de izolare a celulelor nucleate din sângele din cordonul ombilical, se utilizează de obicei o soluție de hidroxietilamidon 10% sau o soluție de gelatină 3%. Eficiența sedimentării eritrocitelor și izolarea celulelor nucleate este în ambele cazuri aproximativ egală. Cu toate acestea, atunci când gelatina este utilizată ca agent de sedimentare, este posibil să se obțină o cantitate puțin mai mare de CFU-GM decât atunci când se utilizează hidroxietilamidon. Se presupune că diferențele de eficiență a izolării CFU-GM se datorează ratelor diferite de sedimentare ale fracțiunilor individuale de celule nucleate sau capacității moleculelor de hidroxietilamidon de a fi absorbite pe suprafața receptorilor celulelor hematopoietice și, prin urmare, de a bloca sensibilitatea acestora la factorii de stimulare a coloniilor utilizați în cultivarea CFU-GM in vitro. Cu toate acestea, ambele sedimentatoare ar putea fi potrivite pentru izolarea celulelor nucleate atunci când se creează bănci de sânge din cordonul ombilical la scară largă.

Metodele de separare și crioconservare a sângelui din cordonul ombilical nu sunt practic diferite de cele utilizate în lucrul cu celule stem hematopoietice din sângele periferic și măduva osoasă a donatorilor adulți. Însă, atunci când se prepară un număr mare de probe de sânge din cordonul ombilical pentru băncile sale, metodele de separare trebuie, în primul rând, să fie ieftine. Prin urmare, din păcate, în prezent, din nevoi clinice, se utilizează metode de rutină deja testate de izolare și crioconservare a celulelor din sângele din cordonul ombilical, iar metode mai eficiente, dar costisitoare, rămân în grija experimentatorilor.

În general, au fost aprobate criteriile pentru evaluarea numărului de celule hematopoietice și cerințele pentru examinarea probelor de sânge din cordonul ombilical pentru identificarea agenților infecțioși. Pentru a asigura siguranța transplantului de celule hematopoietice din sângele din cordonul ombilical, toate probele de sânge trebuie examinate în primul rând pentru infecții cu transmitere hematogenă și boli genetice. O serie de autori recomandă metode speciale suplimentare pentru examinarea sângelui din cordonul ombilical pentru diagnosticarea bolilor genetice precum a-talasemia, anemia falciformă, deficitul de adenozin deaminază, agamaglobulinemia Bruton, bolile Hurler și Ponter.

Conform recomandărilor lui L. Ticheli și coautorilor (1998), fiecare probă de sânge din cordonul ombilical trebuie testată pentru celule nucleate, celule CD34-pozitive și CFU-GM, trebuie efectuată tipizarea HLA, iar grupa sanguină trebuie determinată în funcție de ABO și factorul Rh al acestuia. În plus, trebuie efectuată cultura bacteriologică, testarea serologică pentru infecția cu HIV și citomegalovirus, HBsAg, hepatita virală C, HTLY-I și HTLV-II (leucemie cu celule T umane), sifilis și toxoplasmoză. Reacția în lanț a polimerazei pentru infecția cu citomegalovirus și HIV este obligatorie.

Procedura de recoltare a sângelui din cordonul ombilical trebuie efectuată în strictă conformitate cu principiile bioeticii medicale. Înainte de recoltarea sângelui, este necesar să se obțină consimțământul femeii însărcinate pentru efectuarea acesteia. O discuție preliminară cu femeia însărcinată pentru a obține consimțământul informat pentru toate manipulările, de la prelevarea de sânge până la completarea documentației, se efectuează numai de către personalul medical. În niciun caz nu este permis ca niciuna dintre aceste proceduri să fie efectuată de personal cu educație biologică, chimică, farmaceutică sau de altă natură, din cauza încălcării normelor stabilite de bioetică și a drepturilor omului. În cazul testelor pozitive pentru purtătorul de HBsAg, prezența anticorpilor la agenții patogeni ai hepatitei C, infecției cu HIV și sifilisului, sângele din cordonul ombilical nu se recoltează, iar probele de sânge deja recoltate sunt respinse și distruse. Trebuie menționat că purtătorul de infecții latente la nou-născuți este mult mai puțin frecvent decât la adulți, prin urmare, probabilitatea transferului hematogen și a dezvoltării complicațiilor infecțioase în timpul perfuziilor de celule hematopoietice din sângele din cordonul ombilical este semnificativ mai mică decât în cazul utilizării măduvei osoase de la donatori adulți pentru transplant.

Un aspect important al utilizării clinice a sângelui din cordonul ombilical este evaluarea transplantului, care se bazează pe determinarea cantității de celule stem hematopoietice dintr-o probă de sânge din cordonul ombilical și a dozelor de celule necesare pentru transplant. În prezent, nu au fost încă elaborate standarde pentru cantitatea optimă de celule din sângele din cordonul ombilical necesar pentru transplant. Nu există un punct de vedere general acceptat nici măcar asupra unor parametri de rutină precum numărul de celule CD34-pozitive și CFU-GM. Unii autori evaluează potențialul celulelor hematopoietice prin analizarea culturilor pe termen lung cu determinarea conținutului de unități formatoare de colonii comune granulocitelor, eritrocitelor, monocitelor și megacariocitelor - CFU-GEMM.

Cu toate acestea, într-un cadru clinic, evaluarea standard a unui transplant de sânge din cordonul ombilical implică de obicei doar determinarea numărului de celule nucleate sau mononucleare.

Depozitarea celulelor stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical

Există, de asemenea, unele probleme în tehnologia de stocare a celulelor hematopoietice din sângele cordonului ombilical. La crioconservarea celulelor stem hematopoietice, pentru a obține modul optim de congelare, este necesar să se reducă cât mai mult posibil volumul de sânge din cordonul ombilical și, de asemenea, să se îndepărteze eritrocitele în prealabil pentru a evita hemoliza și riscul dezvoltării unei reacții de incompatibilitate pentru antigenele eritrocitare (ABO, Rh). Diverse metode de izolare a celulelor nucleate sunt potrivite pentru aceste scopuri. La începutul anilor '90 ai secolului trecut, cea mai utilizată metodă a fost izolarea celulelor nucleate într-un gradient de densitate pe bază de Ficoll cu o densitate de 1,077 g/ml sau Percoll cu o densitate de 1,080 g/ml. Separarea sângelui din cordonul ombilical într-un gradient de densitate permite izolarea celulelor predominant mononucleare, dar duce la pierderi semnificative de celule progenitoare hematopoietice - până la 30-50%.

Eficiența de sedimentare a hidroxietilamidonului în procesul de izolare a celulelor hematopoietice din sângele cordonului ombilical este evaluată în mod diferit. Unii autori subliniază calitatea scăzută a separării folosind această metodă, în timp ce alți cercetători, dimpotrivă, dintre toate metodele posibile, acordă preferință izolării HSC din sângele cordonului ombilical folosind o soluție de hidroxietilamidon de 6%. În același timp, se subliniază eficiența ridicată a sedimentării celulelor hematopoietice, care, conform unor date, ajunge de la 84% la 90%.

Susținătorii unui punct de vedere diferit consideră că practic toate metodele de fracționare sunt asociate cu pierderi mari de celule nucleate și propun efectuarea separării prin centrifugare, împărțind sângele din cordonul ombilical în 3 fracțiuni: eritrocite, inel leucocitar și plasmă. Prin izolarea celulelor în acest mod, autorii au descoperit că conținutul de celule mononucleare, celule progenitoare hematopoietice timpurii și celule cu imunofenotip CD34+ s-a ridicat în final la 90, 88 și respectiv 100% din nivelul inițial. Valori similare pentru creșterea numărului de celule din sângele cordonului ombilical purificate prin această metodă au fost obținute și de alți cercetători: după sedimentare, au fost izolate 92% din celulele nucleate, 98% din celulele mononucleare, 96% din celulele CD34-pozitive și 106% din unitățile formatoare de colonii.

La sfârșitul anilor 1990, gelatina a fost utilizată pe scară largă ca agent de sedimentare. În practica clinică, gelatina a fost utilizată pentru izolarea celulelor stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical încă din 1994. Atunci când se utilizează o soluție de gelatină 3%, eficiența izolării celulelor nucleate ajunge la 88-94%. Utilizarea pe scară largă a gelatinei în crearea unei bănci de sânge din cordonul ombilical a confirmat avantajele sale față de alți agenți de sedimentare. O analiză comparativă a eficienței tuturor metodelor de mai sus pentru izolarea celulelor nucleate în condițiile utilizării lor secvențiale pe fiecare dintre probele de sânge din cordonul ombilical testate a dovedit că o soluție de gelatină 3% este agentul de sedimentare optim în ceea ce privește randamentul de celule mononucleare cu fenotipul CD34+/CD45+, precum și în ceea ce privește numărul de UFC-GM și UFC-GEMM. Metodele care utilizează un gradient de densitate Ficoll, precum și utilizarea hidroxietilamidonului și a metilcelulozei, au fost semnificativ mai puțin eficiente, pierderile de celule hematopoietice ajungând la 60%.

Extinderea volumelor de transplant de celule stem din sângele cordonului ombilical este asociată nu numai cu dezvoltarea metodelor de achiziție a acestora, ci și cu depozitarea acestora. Există numeroase probleme direct legate de pregătirea sângelui cordonului ombilical pentru depozitarea pe termen lung și de alegerea tehnologiei optime pentru crioconservarea probelor sale. Printre acestea se numără aspectele legate de fezabilitatea efectuării procedurilor de separare, utilizarea diferitelor medii de crioconservare și aplicarea metodelor de pregătire a celulelor decongelate pentru transplant. Transportul probelor native de sânge cordonului ombilical se efectuează adesea din regiuni îndepărtate de centrele hematologice. În acest sens, apare problema perioadelor acceptabile de depozitare a sângelui cordonului ombilical din momentul achiziției sale până la începutul crioconservării, ceea ce are o importanță deosebită la crearea băncilor de sânge din cordonul ombilical.

Un studiu al activității funcționale a celulelor hematopoietice din sângele din cordonul ombilical după depozitarea pe termen lung (până la 12 ani) în azot lichid a arătat că aproximativ 95% dintre celulele hematopoietice nu își pierd capacitatea proliferativă ridicată în această perioadă. În lucrarea lui S. Yurasov și coautorilor (1997), s-a demonstrat că depozitarea sângelui din cordonul ombilical la temperatura camerei (22°C) sau la 4°C timp de 24 și 48 de ore nu reduce semnificativ viabilitatea celulelor hematopoietice, care este de 92 și respectiv 88% din nivelul inițial. Cu toate acestea, dacă perioada de depozitare este prelungită la trei zile, numărul de celule nucleate viabile din sângele din cordonul ombilical scade semnificativ. În același timp, alte studii au arătat că, atunci când sunt păstrate timp de 2-3 zile la 22 sau 4°C, viabilitatea granulocitelor mature, mai degrabă decât a celulelor hematopoietice, are de suferit în primul rând.

Viabilitatea celulelor stem hematopoietice din sângele din cordonul ombilical poate fi afectată negativ de componentele sistemelor de colectare a sângelui din cordonul ombilical. O analiză a efectului diferitelor anticoagulante al căror mecanism de acțiune se datorează legării ionilor de calciu (ACD, EDTA, XAPD-1) asupra celulelor progenitoare hematopoietice în condiții de depozitare a sângelui din cordonul ombilical timp de 24 până la 72 de ore a relevat efectul lor negativ asupra viabilității celulelor nucleate. În acest sens, autorii recomandă utilizarea PBS (soluție tampon fosfat) cu adaos de heparină nativă fără conservant la o concentrație de 20 U/ml, ceea ce, în opinia lor, permite creșterea perioadei de depozitare a sângelui din cordonul ombilical nefracționat la 72 de ore și păstrează activitatea funcțională a unităților formatoare de colonii. Cu toate acestea, un studiu privind siguranța CFU-GM și CFU-G a arătat că timpul de depozitare a sângelui din cordonul ombilical înainte de crioconservare nu trebuie să depășească nouă ore. Evident, principiul care ar trebui aplicat în acest caz este că, în prezența unor date contradictorii, ar trebui utilizată perioada minimă recomandată de depozitare pentru sângele din cordonul ombilical și ar trebui inițiată cât mai curând posibil congelarea programată a celulelor izolate.

La congelarea celulelor stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical, se utilizează de obicei o soluție de DMSO 10% ca și crioprotector. Cu toate acestea, pe lângă efectul crioprotector pronunțat, dimetilsulfoxidul într-o astfel de concentrație are și un efect citotoxic direct, chiar și cu o expunere minimă la celulele hematopoietice din sângele cordonului ombilical. Pentru a reduce efectul citotoxic al DMSO, se utilizează o temperatură de expunere zero, se crește viteza tuturor manipulărilor și se efectuează spălări multiple după decongelarea probelor de sânge din cordonul ombilical.

Din anul 1995, Institutul de Hematologie și Transfuziologie al Academiei de Științe Medicale din Ucraina dezvoltă o direcție științifică care vizează un studiu cuprinzător al sângelui din cordonul ombilical ca sursă alternativă de celule stem hematopoietice. În special, au fost dezvoltate noi tehnologii pentru crioconservarea la temperatură scăzută a celulelor hematopoietice din sângele din cordonul ombilical nefracționat și fracționat. Polivinilpirolidona medicală cu greutate moleculară mică este utilizată ca crioprotector. Metoda de crioconservare a sângelui din cordonul ombilical nefracționat se bazează pe o tehnologie originală de pregătire prealabilă a celulelor pentru congelare și pe o metodă de procesare specială a suspensiei celulare imediat înainte de transplant.

Unul dintre cei mai importanți factori care influențează nivelul activității funcționale a celulelor stem hematopoietice crioconservate este viteza de răcire a suspensiei celulare, în special în timpul fazei de cristalizare. O abordare software pentru rezolvarea problemei vitezei și timpului de congelare oferă oportunități excelente pentru crearea unor metode de crioconservare simple și extrem de eficiente, fără spălarea suspensiei celulare de pe crioprotectorii înainte de transplant.

Cele mai periculoase etape pentru viabilitatea celulelor în timpul preparării lor sunt etapele de congelare și decongelare directă. La congelarea celulelor hematopoietice, o parte semnificativă a acestora poate fi distrusă în momentul tranziției mediului intercelular din faza lichidă în cea solidă - cristalizarea. Pentru a reduce procentul de moarte celulară, se utilizează crioprotectori, ale căror mecanisme de acțiune și eficiență crioprotectoare sunt suficient descrise în literatura științifică.

O direcție promițătoare pentru optimizarea metodelor de crioconservare a celulelor din măduva osoasă și din sângele cordonului ombilical este combinarea unor concentrații scăzute ale mai multor crioprotectori cu mecanisme de acțiune diferite într-o singură soluție, de exemplu, DMSO care acționează la nivel intracelular și hidroxietilamidon sau albumină, care au un efect protector extracelular.

Pentru crioconservarea celulelor din sângele cordonului ombilical, se utilizează în mod tradițional o soluție de DMSO 20%, care se toarnă lent în suspensia celulară sub agitare mecanică constantă într-o baie de gheață, până când se obține un raport egal (1:1) între volumele de crioprotector și suspensie celulară. Concentrația finală de dimetilsulfoxid este de 10%. Suspensia celulară este apoi răcită într-o unitate criogenică programată cu o viteză de GS/min până la -40°C, după care viteza de răcire este crescută la 10°C/min. După atingerea temperaturii de -100°C, recipientul cu suspensia celulară este plasat în azot lichid (-196°C). Cu această tehnică de crioconservare, conservarea celulelor mononucleare funcțional active după decongelare atinge 85% din nivelul inițial.

Modificările metodelor de crioconservare au ca scop reducerea concentrației de DMSO prin adăugarea de hidroxietilamidon (concentrațiile finale de dimetilsulfoxid și hidroxietilamidon sunt de 5% și, respectiv, 6%). O eficiență ridicată a unei astfel de combinații de crioprotectori se observă la congelarea unei suspensii de celule mieloide și cu o citoprotecție nu mai mică decât atunci când se utilizează doar o soluție de 10% de dimetilsulfoxid. Numărul de celule nucleate viabile a atins 96,7% din nivelul inițial, iar activitatea lor funcțională, estimată prin numărul de UFC-GM, a fost de 81,8%.

Când se utilizează o soluție de dimetilsulfoxid în concentrații de la 5 la 10% în combinație cu hidroxietilamidon 4% (concentrație finală), s-a constatat că siguranța celulelor CD34-pozitive în astfel de intervale de dimetilsulfoxid rămâne practic neschimbată. În același timp, când concentrația de dimetilsulfoxid scade de la 5 la 2,5%, se observă moartea masivă a celulelor sanguine din cordonul ombilical - numărul de unități celulare viabile scade de la 85,4 la 12,2%. Și alți autori au ajuns la concluzia că soluțiile de dimetilsulfoxid de 5 și 10% (în versiunea autorului - în combinație cu ser autolog) oferă citoprotecție cu eficiență maximă în timpul crioconservării HSC-urilor din sângele cordonului ombilical. În plus, se observă o conservare ridicată a celulelor congelate și decongelate succesiv în cazul unei combinații de dimetilsulfoxid de 5 sau 10% cu o soluție de hidroxietilamidon 4%, în special la o rată controlată de răcire de GS/min. Într-un alt studiu, s-a utilizat o soluție crioprotectoare constând din trei ingrediente - DMSO, albumină umană purificată și mediu RPMI într-un raport de 1:4:5, care a fost adăugată la suspensia celulară într-un raport de volum egal (concentrația finală de dimetilsulfoxid a fost de 5%). După decongelare într-o baie de apă la o temperatură de +4 GS, conservarea CFU-GM a depășit 94%.

Unii autori sugerează utilizarea sângelui din cordonul ombilical nefracționat pentru crioconservare, deoarece în timpul procesului de îndepărtare a globulelor roșii se pierd cantități semnificative de celule hematopoietice. În această variantă, se utilizează o soluție de 10% de dimetilsulfoxid pentru a proteja celulele mononucleare de efectele dăunătoare ale criocristalizării. Congelarea se efectuează la o rată constantă de răcire de GS/min până la -80°C, după care suspensia de celule din sângele din cordonul ombilical este coborâtă în azot lichid. Această metodă de congelare are ca rezultat liza parțială a globulelor roșii, astfel încât probele de sânge nu necesită fracționare. După decongelare, suspensia celulară este spălată de hemoglobina liberă și dimetilsulfoxid într-o soluție de albumină umană sau în serul sanguin autolog al pacientului și utilizată pentru transplant.

Conservarea celulelor progenitoare hematopoietice după decongelarea sângelui din cordonul ombilical nefracționat este într-adevăr mai mare decât cea a sângelui fracționat din cordonul ombilical, însă, din cauza criostabilității unor eritrocite, pot apărea probleme post-transfuzionale grave din cauza transfuziei de eritrocite incompatibile cu ABO. În plus, volumul de sânge nefracționat stocat crește semnificativ. Din punct de vedere clinic, crioconservarea celulelor hematopoietice din sângele din cordonul ombilical izolate și purificate anterior din alte fracțiuni celulare este încă preferabilă.

În special, a fost dezvoltată o metodă de crioconservare a celulelor sanguine fracționate din cordonul ombilical, care permite îndepărtarea eritrocitelor în etapa de pregătire pentru congelare, în care o soluție de hidroxietil amidon de 6% este utilizată ca parte a soluției de substituție a plasmei „Stabizol”. După decongelare, suspensia celulară obținută în acest mod este gata pentru utilizare clinică fără manipulări suplimentare.

Astfel, în prezent există multe metode destul de eficiente de crioconservare a sângelui din cordonul ombilical. Diferența lor fundamentală constă în faptul că probele de sânge sunt congelate nefracționate sau sunt supuse separării în fracțiuni celulare în etapa de preparare și se prepară celule nucleate fără amestec de eritrocite.

Transplant de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical

La sfârșitul anilor 1980 și începutul anilor 1990, s-a stabilit că sângele din cordonul ombilical, care oferă fătului suport vital în timpul sarcinii, are un conținut ridicat de celule stem hematopoietice. Simplitatea relativă a obținerii celulelor din sângele cordonului ombilical și absența unor probleme etice evidente au contribuit la utilizarea celulelor stem din sângele cordonului ombilical în medicina practică. Primul transplant reușit de sânge din cordonul ombilical la un copil cu anemie Fanconi a servit ca punct de plecare pentru extinderea volumului de transplanturi de celule stem din sângele cordonului ombilical și crearea unui sistem pentru stocarea acestuia. În sistemul mondial de bănci de sânge din cordonul ombilical, cea mai mare este Centrul pentru Sânge Placentar din New York, care se află în bilanțul Institutului Național de Sănătate din SUA. Numărul de probe de sânge din cordonul ombilical stocate în această bancă se apropie de 20.000. Numărul de receptori (în majoritate copii) care au suferit un transplant reușit este, de asemenea, în creștere. Potrivit Departamentului de Sănătate al SUA, perioada de viață fără recidivă post-transplant a receptorilor de transplant de sânge din cordonul ombilical depășește deja 10 ani.

Acest lucru nu este surprinzător, deoarece numeroase studii privind potențialul hematopoietic al sângelui din cordonul ombilical au arătat că, în ceea ce privește cantitatea și calitatea celor mai timpurii celule stem, acesta nu numai că nu este inferior măduvei osoase a unui adult, dar o și depășește în anumite privințe. Potențialul proliferativ mai mare al celulelor stem din sângele cordonului ombilical se datorează caracteristicilor ontogenetice ale semnalizării celulare, prezenței receptorilor pentru factori de creștere specifici pe HSC, capacității celulelor din sângele cordonului ombilical de a produce autocrin factori de creștere și dimensiunii și lungimii mari a telomerilor.

Astfel, caracteristicile genomice și fenotipice ale celulelor stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical predetermină o grefare de înaltă calitate a transplantului, cu un potențial ridicat de restaurare a hematopoiezei donatorului în corpul receptorului.

Beneficiile celulelor stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical

Printre avantajele reale ale utilizării celulelor stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical pentru transplant față de alte surse de celule hematopoietice, merită menționat riscul practic zero pentru sănătatea donatorului (dacă nu luăm în considerare placenta ca atare) și absența necesității anesteziei generale. Utilizarea sângelui cordonului ombilical extinde posibilitățile de transplant celular datorită transplanturilor parțial compatibile cu HLA (incompatibilitate de la unu la trei antigene). A fost dezvoltată o metodă de stocare pe termen lung a celulelor hematopoietice din sângele cordonului ombilical în stare congelată, ceea ce crește probabilitatea obținerii unor tipuri rare de HLA și reduce timpul de căutare a unui transplant HLA compatibil pentru transplantul alogen. În același timp, riscul de a dezvolta anumite infecții latente transmise pe căi transmisibile este redus semnificativ. În plus, o formă ieftină de asigurare de viață biologică apare datorită posibilității de utilizare a celulelor din sângele cordonului ombilical pentru transplantul autolog.

Totuși, din cauza volumelor mici de sânge care pot fi recoltate din placentă (în medie nu mai mult de 100 ml), apare problema obținerii unei cantități maxime de sânge din vena cordonului ombilical, respectând cu strictețe condiția de risc minim de contaminare bacteriană a probelor de sânge din cordonul ombilical obținute.

Celulele hematopoietice primitive din sângele cordonului ombilical sunt de obicei identificate prin prezența glicofosfoproteinei CD34 pe suprafața lor, precum și pe baza proprietăților lor funcționale prin studierea clonogenității sau a formării coloniilor in vitro. Analiza comparativă a arătat că în sângele cordonului ombilical și măduva osoasă conținutul maxim de celule CD34-pozitive în fracția mononucleară este de 1,6 și respectiv 5,0%, nivelul maxim de unități formatoare de colonii în subpopulația de celule CD34+ este de 80 și 25%, eficiența totală de clonare a celulelor CD34+ este de 88 și 58%, conținutul maxim de celule formatoare de colonii cu potențial de proliferare ridicat (HPP-CFC în populația CD34+) este de 50 și 6,5%. Trebuie adăugat că eficiența clonării celulelor CD34+CD38 și capacitatea de a răspunde la stimularea citokinelor sunt, de asemenea, mai mari în celulele stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical.

Combinarea antigenelor fenotipice Thy-1, CD34 și CD45RA confirmă potențialul proliferativ ridicat al celulelor hematopoietice din sângele cordonului ombilical, iar exprimarea acestor trei antigene pe suprafața celulelor din sângele cordonului ombilical indică apartenența lor la celulele stem. În plus, s-a constatat că sângele cordonului ombilical conține celule cu fenotipul CD34+ care nu au markeri de diferențiere liniară. Nivelul subpopulațiilor celulare cu profilul fenotipic CD34+/Lin din sângele cordonului ombilical este de aproximativ 1% din numărul total de celule CD34-pozitive. Celulele progenitoare hematopoietice din sângele cordonului ombilical dau naștere atât liniei celulare limfoide, cât și seriei mieloide pluripotente de diferențiere celulară liniară, ceea ce indică și apartenența lor la celulele stem.

După cum am menționat deja, diferențele semnificative între măduva osoasă și sângele din cordonul ombilical constă în cantitatea de celule hematopoietice utilizate pentru transplant, obținute în timpul unei singure proceduri de colectare. Dacă în timpul transplantului de măduvă osoasă pierderea masei celulare în timpul separării, crioconservării, decongelarii și testării este acceptabilă în limita a 40-50%, atunci pentru sângele din cordonul ombilical astfel de pierderi celulare sunt foarte semnificative, deoarece dacă se utilizează o cantitate insuficientă de HSC, transplantul se poate dovedi ineficient. Conform lui G. Kogler și colab. (1998), pentru transplantul de celule cu o greutate corporală a receptorului de 10 kg, toate probele de sânge din cordonul ombilical pot fi transplanturi potențiale (numărul total de probe de sânge din cordonul ombilical colectate este de 2098), cu o greutate corporală de 35 kg - 67%, și doar 25% din probe pot oferi un transplant eficient la pacienții cu o greutate corporală de 50-70 kg. Această situație clinică indică necesitatea optimizării și îmbunătățirii eficienței metodelor existente de colectare, reproducere și stocare a celulelor din sângele din cordonul ombilical. Prin urmare, literatura de specialitate discută pe larg în prezent problemele standardizării metodelor de colectare, testare, separare și crioconservare a sângelui din cordonul ombilical pentru crearea de bănci de sânge, utilizarea acestuia în clinică și stipulează, de asemenea, condițiile și termenii de depozitare a celulelor stem hematopoietice din sângele din cordonul ombilical.

trusted-source[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Utilizarea celulelor stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical în medicină

De obicei, este posibil să se izoleze până la 10⁶ celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical, rareori mai mult. În acest sens, întrebarea dacă o astfel de cantitate de celule hematopoietice din sângele cordonului ombilical este suficientă pentru a restabili hematopoieza la un receptor adult rămâne deschisă și în prezent. Opiniile cu privire la această chestiune sunt împărțite. Unii cercetători consideră că o astfel de cantitate este suficientă pentru transplantul la copii, dar prea puțină pentru transplantul la un adult, pentru care cantitatea optimă este introducerea a (7-10) x 10⁶ celule CD34-pozitive la 1 kg de greutate corporală - o medie de 7 x 10⁶ per transplant. Din aceste calcule rezultă că o probă de sânge din cordonul ombilical conține de 700 de ori mai puține celule stem hematopoietice decât este necesar pentru un transplant la un pacient adult. Cu toate acestea, o astfel de evaluare cantitativă se face prin analogie cu numărul de celule din măduva osoasă transfuzate și nu ia deloc în considerare caracteristicile ontogenetice ale hematopoiezei.

În special, este ignorat faptul că există un potențial proliferativ mai mare al celulelor stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical în comparație cu celulele progenitoare hematopoietice din măduva osoasă. Rezultatele studiilor in vitro privind potențialul de formare a coloniilor sugerează că o doză de sânge din cordonul ombilical este capabilă să asigure reconstituirea hematopoiezei receptorului adult. Pe de altă parte, nu trebuie uitat faptul că numărul de celule stem din sângele cordonului ombilical scade chiar și în timpul dezvoltării embrionare: conținutul de celule CD34-pozitive din sângele cordonului ombilical scade liniar de 5 ori în perioada de la 20 de săptămâni (sângele pentru studiu a fost obținut în timpul întreruperii premature de sarcină) până la 40 de săptămâni de gestație (perioada travaliului fiziologic), ceea ce este însoțit de o expresie paralelă, în continuă creștere, a markerilor liniari de citodiferențiere.

Din cauza lipsei unei abordări standardizate pentru determinarea cantitativă a celulelor progenitoare în probele de sânge din cordonul ombilical, dezbaterile despre doza optimă de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical continuă. Unii cercetători consideră că numărul de celule nucleate și celule mononucleare recalculate pentru greutatea corporală a receptorului, adică doza acestuia, poate fi utilizată drept criteriu pentru selectarea probelor de sânge din cordonul ombilical. Unii autori consideră că pragul cantitativ minim de celule CD34+ chiar și pentru autotransplantarea HSC-urilor este de 2 x 10 6 /kg. În același timp, o creștere a dozei de celule hematopoietice la 5 x 10 6 celule/kg (doar de 2,5 ori) asigură deja o evoluție mai favorabilă a perioadei post-transplant timpurii, reduce incidența complicațiilor infecțioase și scurtează durata terapiei antibiotice preventive.

Conform lui E. Gluckman și colab. (1998), în oncohematologie, condiția pentru transplantul de celule din sângele cordonului ombilical cu succes este introducerea a cel puțin 3,7 x 10⁶ celule nucleate la 1 kg greutate corporală a receptorului. Atunci când doza de celule stem hematopoietice este redusă la 1 x 10⁶ sau mai puțin celule nucleate la 1 kg greutate corporală a pacientului, riscul de eșec al transplantului și de recidivă a cancerului de sânge crește brusc. Trebuie recunoscut faptul că numărul minim de celule progenitoare necesar pentru restaurarea rapidă a hematopoiezei după alotransplantarea de celule stem stem (HSC) este încă necunoscut. Teoretic, acest lucru poate fi realizat folosind o singură celulă, dar în practica clinică a transplantului de măduvă osoasă, grefarea rapidă și stabilă este garantată prin transfuzia a cel puțin (1-3) x 10⁶ celule nucleate la 1 kg greutate corporală a pacientului.

Un studiu recent detaliat pentru determinarea numărului optim de HSC-uri în oncohematologie a inclus observarea pacienților în trei grupuri, alocate în funcție de conținutul de celule CD34-pozitive din materialul transplantat. Pacienților din primul grup li s-au administrat (3-5) x 10⁶ celule /kg. Doza de HSC la pacienții din al doilea grup a fost de (5-10) x 10⁶ celule /kg, iar pacienților din al treilea grup li s-au transplantat peste 10 x 10⁶ celule CD34+/kg. Cele mai bune rezultate au fost observate în grupul de receptori care au primit un transplant cu numărul de celule CD34-pozitive egal cu (3-5) x 10⁶ / kg. Odată cu creșterea dozei de celule transplantate peste 5 x 10⁶ / kg, nu au fost evidențiate avantaje semnificative statistic. În acest caz, un conținut foarte ridicat de HSC-uri în transplant (> 10 x 10⁶ / kg) este asociat cu reinfuzarea unui număr semnificativ de celule tumorale reziduale, ceea ce duce la recidiva bolii. Nu a fost stabilită o relație directă între numărul de celule progenitoare alogene transplantate și dezvoltarea reacției grefă-contra-gazdă.

Experiența mondială acumulată în transplantul de sânge din cordonul ombilical confirmă potențialul ridicat de repopulare a acestora. Rata de grefare a transplantului de sânge din cordonul ombilical se corelează cu numărul de celule nucleate introduse. Cele mai bune rezultate se observă în cazul transplantului de 3 x 10⁷ / kg, în timp ce pentru măduva osoasă această doză este de 2 x 10⁶ / kg. Conform datelor centrelor coordonatoare, la sfârșitul anului 2000, la nivel mondial au fost efectuate 1200 de transplanturi de celule din sângele din cordonul ombilical, în principal de la donatori înrudiți (83%). Este evident că sângele din cordonul ombilical ar trebui considerat o alternativă la măduva osoasă pentru transplantul la pacienții cu hemoblastoze.

În același timp, natura neonatală a sursei de țesut hematopoietic din cordonul ombilical inspiră optimism datorită prezenței caracteristicilor funcționale ale celulelor hematopoietice hematopoietice (HSC) din acesta. În același timp, doar experiența clinică poate răspunde la întrebarea dacă o singură probă de sânge din cordonul ombilical este suficientă pentru a restabili hematopoieza la un adult cu aplazie hematopoietică. Transplantul de celule din sângele cordonului ombilical este utilizat în programele de tratament pentru multe boli tumorale și non-tumorale: leucemie și sindroame mielodisplazice, limfom non-Hodgkin și neuroblastom, anemia aplastică, anemiile congenitale Fanconi și Diamond-Blackfan, deficitul de aderență leucocitară, sindromul Barr, boala Gunther, sindromul Hurler, talasemia.

Aspectele imunologice ale transplantului de celule hematopoietice din sângele cordonului ombilical merită o atenție deosebită și un studiu separat. S-a demonstrat că, în cazul transplantului de celule stem din sângele cordonului ombilical de la donatori cu compatibilitate HLA incompletă, rezultatele transplantului sunt destul de satisfăcătoare, ceea ce, potrivit autorilor, indică o imunoreactivitate mai scăzută a celulelor din sângele cordonului ombilical decât a măduvei osoase.

Un studiu detaliat al compoziției celulare a sângelui din cordonul ombilical a relevat caracteristicile atât ale spectrului fenotipic al celulelor efectoare ale sistemului imunitar, cât și ale activității lor funcționale, ceea ce a permis considerarea sângelui din cordonul ombilical ca o sursă de HSC-uri cu un risc relativ scăzut de a dezvolta o reacție „grefă contra gazdă”. Printre semnele de imaturitate funcțională a celulelor imunocompetente din sângele din cordonul ombilical, este necesar de remarcat dezechilibrul în producția de citokine și o scădere a sensibilității la reglarea răspunsului imun de către citokine. Inhibarea rezultată a activității limfocitelor citotoxice este considerată un factor care contribuie la formarea toleranței imunologice față de țesutul hematopoietic transplantat. În populația de limfocite din sângele cordonului ombilical, spre deosebire de sângele periferic și măduva osoasă a donatorilor adulți, predomină limfocitele inactive, imature și celulele supresoare. Aceasta indică o disponibilitate redusă a limfocitelor T din sângele cordonului ombilical pentru un răspuns imun. O caracteristică importantă a populației monocitare de celule din sângele cordonului ombilical este conținutul scăzut de celule prezentatoare de antigen, funcționale și active.

Pe de o parte, maturitatea scăzută a celulelor efectoare ale sistemului imunitar din sângele din cordonul ombilical extinde indicațiile pentru utilizarea sa în clinică, deoarece aceste caracteristici asigură o scădere a intensității conflictului imun dintre celulele donatorului și receptorului. Dar, pe de altă parte, se cunoaște existența unei corelații între gradul de dezvoltare a reacției „grefă contra gazdă” și efectul antitumoral al transplantului, adică dezvoltarea efectului „grefă contra leucemie”. În acest sens, a fost efectuat un studiu privind citotoxicitatea antitumorală a celulelor din sângele din cordonul ombilical. Rezultatele obținute indică faptul că, în ciuda răspunsului cu adevărat slăbit al celulelor imunocompetente din sângele din cordonul ombilical la stimularea cu antigen, limfocitele care sunt activate în principal sunt celule killer naturale și celule killer-like care participă activ la mecanismele de implementare a citotoxicității antitumorale. În plus, în sângele din cordonul ombilical s-au găsit subpopulații de limfocite cu fenotipurile CD16+CD56+ și CD16"TCRa/p+. Se presupune că aceste celule în forma lor activată implementează reacția „grefă contra leucemie”.

La Institutul de Oncologie al Academiei de Științe Medicale din Ucraina, celule hematopoietice crioconservate din sângele cordonului ombilical au fost administrate pacienților cu cancer cu hipoplazie hematopoietică persistentă datorată chimioterapiei și radioterapiei. La acești pacienți, transplantul de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical a restabilit destul de eficient hematopoieza deprimată, după cum reiese din creșterea persistentă a conținutului de elemente mature formate în sângele periferic, precum și o creștere a indicatorilor care caracterizează starea imunității celulare și umorale. Stabilitatea efectului de repopulare după transplantul de celule hematopoietice din sângele cordonului ombilical permite continuarea radioterapiei și chimioterapiei fără întreruperea tratamentului. Există informații despre o eficiență mai mare a alotransplantării de celule stem din sângele cordonului ombilical la pacienții oncohematologici: riscul anual de recidivă a unei boli tumorale cu utilizarea lor a fost de 25% față de 40% la pacienții cu transplant de măduvă osoasă alogenă.

Mecanismul de acțiune al celulelor stem crioconservate din sângele cordonului ombilical trebuie considerat rezultatul stimulării umorale a hematopoiezei receptorului, cauzat de capacitatea unică a celulelor neonatale de a produce autocrin factori de creștere hematopoietici, precum și o consecință a grefării temporare a celulelor donatoare (evidențiată de o creștere semnificativă a conținutului de hemoglobină fetală în sângele periferic al receptorilor în ziua 7-15 după transfuzie, comparativ cu datele inițiale). Absența reacțiilor post-transfuzionale la receptorii de sânge din cordonul ombilical este rezultatul toleranței relative a celulelor imunocompetente ale acestuia, precum și un criteriu de încredere pentru adecvarea biologică a materialului crioconservat.

Celulele progenitoare limfocitelor T ucigașe din sângele cordonului ombilical sunt capabile de activare sub influența stimulării cu citokine exogene, care este utilizată pentru a dezvolta noi metode ex vivo și in vivo pentru inducerea citotoxicității antitumorale a elementelor limfoide din transplant pentru imunoterapie ulterioară. În plus, „imaturitatea” genomului celulelor imunocompetente din sângele cordonului ombilical permite utilizarea acestora pentru a spori activitatea antitumorală folosind metode de modelare moleculară.

Astăzi, sângele din cordonul ombilical și-a găsit aplicații largi, în principal în hematologia pediatrică. La copiii cu leucemie acută, alotransplantul de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical, comparativ cu alotransplantul de măduvă osoasă, reduce semnificativ incidența bolii grefă-contra-gazdă. Cu toate acestea, aceasta este însoțită de o perioadă mai lungă de neutro- și trombocitopenie și, din păcate, de o rată mai mare a mortalității la 100 de zile post-transplant. O perioadă mai lungă de recuperare a nivelurilor de granulocite și trombocite în sângele periferic se poate datora diferențierii insuficiente a subpopulațiilor individuale de celule CD34-pozitive din sângele cordonului ombilical, după cum reiese din nivelul scăzut de absorbție a rodaminei radioactive și expresia scăzută a antigenelor CD38 pe suprafața acestora.

În același timp, transplantul de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical la pacienți adulți, efectuat din cauza absenței atât a unui donator de măduvă osoasă neînrudit compatibil, cât și a posibilității de mobilizare a HSC-urilor autologe, a demonstrat o supraviețuire fără recidivă la un an ridicată la grupul de pacienți sub 30 de ani (73%). Extinderea intervalului de vârstă al receptorilor (18-46 de ani) a dus la o scădere a supraviețuirii la 53%.

Analiza cantitativă a celulelor cu fenotipul CD34+ din măduva osoasă și sângele din cordonul ombilical a relevat un conținut mai mare (de 3,5 ori) al acestora în măduva osoasă, însă în sângele din cordonul ombilical s-a observat o predominanță semnificativă a celulelor cu profilul fenotipic CD34+HLA-DR. Se știe că celulele sanguine cu markeri imunologici CD34+HLA-DR proliferează mai activ decât celulele cu imunofenotipul CD34+HLA-DR+, fapt confirmat în studii experimentale privind creșterea culturilor de celule hematopoietice pe termen lung in vitro. Precursorii celulelor primitive cu fenotipul CD34+CD38 sunt conținuți atât în sângele din cordonul ombilical, cât și în măduva osoasă, însă celulele din sângele din cordonul ombilical cu setul de markeri CD34+CD38 au o activitate clonogenică mai mare decât celulele hematopoietice cu același fenotip izolate din măduva osoasă a donatorilor adulți. În plus, celulele din sângele cordonului ombilical cu imunofenotipul CD34+CD38 proliferează mai rapid ca răspuns la stimularea cu citokine (IL-3, IL-6, G-CSF) și produc de 7 ori mai multe colonii în culturi pe termen lung decât celulele din măduva osoasă.

Bănci de celule stem din sângele cordonului ombilical

Pentru dezvoltarea corectă a unui nou domeniu al medicinei practice - transplantul de celule stem din sângele cordonului ombilical, precum și pentru implementarea transplanturilor de celule stem hematopoietice din măduva osoasă, este necesară o rețea extinsă de bănci de sânge, care au fost deja create în SUA și Europa. Rețelele interne de bănci de sânge din cordonul ombilical sunt unite de Asociația Netcord Bank. Oportunitatea creării unei asociații internaționale de bănci de sânge din cordonul ombilical este determinată de faptul că este nevoie de un număr mare de probe de sânge din cordonul ombilical tipizate pentru a efectua transplanturi neînrudite, ceea ce permite selectarea unui donator HLA-identic. Doar înființarea unui sistem de bănci cu stocarea probelor de sânge din diferite tipuri HLA poate rezolva cu adevărat problema găsirii donatorului necesar. Organizarea unui astfel de sistem de bănci de sânge din cordonul ombilical necesită dezvoltarea preliminară a unor norme etice și juridice, care sunt în prezent discutate la nivel internațional.

Pentru a crea bănci de sânge din cordonul ombilical în Ucraina, trebuie elaborată o serie întreagă de reglementări și documente.

În primul rând, este vorba de probleme de standardizare a metodelor de colectare, fracționare și congelare a sângelui din cordonul ombilical. Este necesară reglementarea regulilor de colectare a sângelui din cordonul ombilical în maternități, în conformitate cu cerințele eticii medicale, pentru a determina volumul minim de sânge din cordonul ombilical care asigură succesul transplantului. Este necesară compararea și standardizarea diverselor criterii de evaluare a calității și cantității celulelor progenitoare hematopoietice, precum și a metodelor de tipizare HLA și a metodelor de diagnostic pentru bolile genetice și infecțioase care pot fi transmise în timpul perfuziei cu celule din sângele cordonului ombilical, pentru a stabili criterii comune pentru selecția donatorilor sănătoși. De asemenea, merită discutate problemele legate de crearea unor spații separate de depozitare pentru ser, celule și ADN obținute din sângele din cordonul ombilical.

Este absolut necesară organizarea unei rețele informatice de date despre sângele din cordonul ombilical pentru a se conecta cu registrele de donatori de măduvă osoasă. Pentru dezvoltarea ulterioară a transplantologiei celulare, este necesară dezvoltarea de protocoale speciale pentru compararea rezultatelor transplantului de sânge din cordonul ombilical și măduvă osoasă de la rude cu HLA identic și donatori neînrudiți. Standardizarea documentației, inclusiv consimțământul informat al părinților, precum și notificarea mamei sau a rudelor despre bolile genetice și/sau infecțioase detectate la copil, poate ajuta la rezolvarea problemelor etice și juridice ale utilizării clinice a celulelor din sângele din cordonul ombilical.

Condiția definitorie pentru dezvoltarea transplantologiei celulare în Ucraina va fi adoptarea Programului Național de Donare a Celulelor Stem și dezvoltarea cooperării internaționale cu alte țări prin intermediul Asociației Mondiale a Donatorilor de Măduvă (WMDA), al Programului Național de Donatori de Măduvă din SUA (NMDP) și al altor registre.

Rezumând istoria încă scurtă a dezvoltării transplantului de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical, observăm că primele presupuneri despre posibilitatea utilizării sângelui cordonului ombilical într-o clinică, exprimate încă la începutul anilor '70, au fost confirmate în anii '80 de rezultatele studiilor experimentale pe animale, iar în 1988 a fost efectuat primul transplant mondial de celule hematopoietice din sângele cordonului ombilical la om, după care a început să fie creată o rețea globală de bănci de sânge din cordonul ombilical. În 10 ani, numărul pacienților cu transplant de celule hematopoietice din sângele cordonului ombilical s-a apropiat de 800. Printre aceștia s-au numărat pacienți cu diverse boli de natură tumorală (leucemie, limfom, tumori solide) și non-tumorală (imunodeficiențe congenitale, anemie, boli asociate cu tulburări metabolice).

Conținutul de precursori celulari timpurii și angajați în sângele din cordonul ombilical este mai mare decât în sângele periferic al unui adult. În ceea ce privește numărul de unități formatoare de colonii de granulocite-macrofage și potențialul lor proliferativ, sângele din cordonul ombilical depășește semnificativ sângele periferic al adulților chiar și după introducerea factorilor de creștere. În culturile celulare in vitro pe termen lung, s-a observat o activitate proliferativă și o viabilitate mai mare a celulelor din sângele cordonului ombilical decât a celulelor din măduva osoasă. Momentele critice în transplantul de celule stem din sângele cordonului ombilical sunt numărul și potențialul hematopoietic al celulelor nucleate, prezența infecției cu citomegalovirus, compatibilitatea HLA a donatorului și a receptorului, greutatea corporală și vârsta pacientului.

Cu toate acestea, transplantul de celule stem din sângele cordonului ombilical ar trebui considerat o alternativă la transplantul de măduvă osoasă pentru tratamentul bolilor severe ale sângelui, în principal la copii. Problemele clinice ale transplantului de celule din sângele cordonului ombilical sunt rezolvate treptat - există deja metode destul de eficiente pentru colectarea, separarea și crioconservarea celulelor din sângele cordonului ombilical, se asigură condițiile pentru formarea băncilor de sânge din cordonul ombilical și se îmbunătățesc metodele de testare a celulelor nucleate. Soluția de gelatină 3% și soluția de hidroxietilamidon 6% ar trebui considerate optime pentru separare în timpul prelevării la scară largă de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical la crearea băncilor.

P. Perekhrestenko și coautorii (2001) notează pe bună dreptate că transplantul de celule stem din sângele cordonului ombilical ar trebui să-și ocupe locul cuvenit în complexul de măsuri terapeutice pentru depășirea depresiilor hematopoietice de diverse origini, deoarece celulele stem din sângele cordonului ombilical prezintă o serie de avantaje semnificative, printre care cele mai importante sunt simplitatea relativă a prelevării lor, absența riscului pentru donator, contaminarea scăzută a celulelor neonatale cu virusuri și costul relativ scăzut al transplantului. Unii autori subliniază că transplantul de celule din sângele cordonului ombilical este mai rar însoțit de complicații asociate cu reacția grefă-contra-gazdă decât transplantul de celule din măduva osoasă, ceea ce se datorează, în opinia lor, expresiei slabe a antigenelor HLA-DR pe celulele din sângele cordonului ombilical și imaturității acestora. Cu toate acestea, principala populație de celule nucleate din sângele cordonului ombilical sunt limfocitele T (celule CD3-pozitive), al căror conținut este de aproximativ 50%, ceea ce este cu 20% mai puțin decât în sângele periferic al unui adult, dar diferențele fenotipice în subpopulațiile de celule T din aceste surse sunt nesemnificative.

Printre factorii care influențează direct rata de supraviețuire în transplantul de celule stem din sângele cordonului ombilical, merită menționată vârsta pacienților (cele mai bune rezultate se observă la receptorii cu vârsta cuprinsă între unu și cinci ani), diagnosticarea precoce a bolii și forma de leucemie (eficacitatea este semnificativ mai mare în leucemia acută). De mare importanță sunt doza de celule nucleate din sângele cordonului ombilical, precum și compatibilitatea lor HLA cu receptorul. Nu este o coincidență faptul că analiza eficacității clinice a transplantului de celule stem stem din sângele cordonului ombilical în oncohematologie arată cele mai bune rezultate terapeutice atunci când se utilizează transplanturi conexe: supraviețuirea fără recidivă la un an în acest caz ajunge la 63%, în timp ce în cazul transplantului neconex - doar 29%.

Astfel, prezența unui număr mare de celule stem în sângele din cordonul ombilical și capacitatea ridicată de repopulare a celulelor stem hematopoietice neonatale permit utilizarea acestora pentru transplantul alogen la pacienții oncohematologici. Cu toate acestea, trebuie menționat că recapitularea hematopoiezei după transplantul de celule hematopoietice din sângele cordonului ombilical este „prelungită în timp”: restabilirea conținutului de neutrofile în sângele periferic se observă de obicei până la sfârșitul celei de-a 6-a săptămâni, iar trombocitopenia dispare de obicei după 6 luni. În plus, imaturitatea celulelor hematopoietice din sângele cordonului ombilical nu exclude conflictele imunologice: boala grefă-contra-gazdă acută și cronică severă se observă la 23, respectiv 25% dintre receptori. Recidivele leucemiei acute până la sfârșitul primului an după transplantul de celule din sângele cordonului ombilical se observă în 26% din cazuri.

trusted-source[ 10 ], [ 11 ]

You are reporting a typo in the following text:
Simply click the "Send typo report" button to complete the report. You can also include a comment.