Limitări, pericole și complicații ale transplantului de celule

Medicina plastic regenerative se bazeaza pe realizarea in celulele stem si progenitoare embrionare pluripotente clinica si proprietati toti-, permitand in vitro si in vivo, pentru a crea o linii de celule predeterminate repopulată țesuturi și organe ale unui pacient uman deteriorat.

Posibilitatea reală de utilizare a celulelor stem ale embrionului și celulelor stem din țesuturile definitive (așa-numitele celule stem adulte) ale unei ființe umane în scopuri terapeutice nu mai este îndoielnică. Cu toate acestea, experții de la Academiile Naționale și Medicale din Statele Unite (SUA) recomandă ca proprietățile celulelor stem în experimente să fie studiate mai detaliat pe modele biologice adecvate și evaluarea obiectivă a tuturor consecințelor transplantului și numai apoi utilizarea celulelor stem în clinică.

Se constată că celulele stem fac parte din derivatele tisulare ale tuturor celor trei prospecte embrionare. Celulele stem se gasesc in retina, cornee, piele, epiderma, măduva osoasă și sângele periferic, în vasele, pulpa dintelui, rinichiul, epiteliul tractului digestiv, pancreas și ficat. Cu ajutorul metodelor moderne se demonstrează că celulele stem neuronale sunt localizate în creierul adult și măduva spinării. Aceste descoperiri senzationale au atras o atenție deosebită oamenilor de știință și mass-media, ca neuronii din creier au fost un exemplu clasic al unei populații de celule statice, care nu poate fi restabilită. Ambele perioade timpurii și târzii ale ontogenezei din cauza celulelor stem neuronale din creier umane si animale generate neuroni, astrocite si oligodendrocitele (celule stem: progresul științific și direcții de cercetare viitoare Nat Inst, Statele Unite ale Americii de Sanatate ..).

Cu toate acestea, în condiții normale, plasticitatea celulelor stem din țesuturile definitive nu apare. Pentru a realiza potențialul plastic al celulelor stem din țesuturile definitive, acestea trebuie izolate și apoi cultivate în mediu cu citokine (LIF, EGF, FGF). Mai mult, derivații de celule stem supraviețuiesc cu succes numai atunci când sunt transplantate în corpul unui animal cu un sistem imunitar deprimat (iradiere, citostatice, busulfan etc.). Până în prezent, nu au existat dovezi convingătoare despre plasticitatea celulelor stem la animalele care nu au fost iradiate sau expuse în alt mod la imunosupresie profundă.

În astfel de circumstanțe, PGCs potență periculoase se manifestă în principal în zona lor de transplant ectopice - injecție subcutanată ESK șoarecii imunodeficienți la teratocarcinomului format la locul de injectare. Mai mult decât atât, în timpul dezvoltării embrionare umane frecventa anomaliilor cromozomiale decat in embriogeneza la animale. La stadiul de blastocist doar 20-25% dintre embrioni umani sunt compuse din celule cu un cariotip normal, iar în majoritatea covârșitoare a embrionilor umani timpurii obținute după fertilizarea in vitro, cromozomială mosaicism detectate aberațiilor numerice și structurale haotice și foarte frecvente.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Efectul benefic al celulelor stem

Rezultatele preliminare ale studiilor clinice confirmă efectul benefic al celulelor stem asupra pacientului, dar până în prezent nu există informații cu privire la consecințele pe termen lung ale transplantului de celule. În literatura de specialitate, inițial dominat de rapoarte de rezultate pozitive ale transplantului de măduvă fragmente de embrioni în boala Parkinson, dar apoi a început să apară datele negând efectele terapeutice eficiente ale tesutului neuronale embrionare sau fetale transplantate in creierul pacientilor.

La mijlocul secolului XX restaurarea hematopoiezei a fost descoperit pentru prima data la animalele iradiate după transfuzie lethally intravenoasă a celulelor de măduvă osoasă, iar în anul 1969 cercetătorul american D. Thomas a efectuat primul transplant de măduvă osoasă om. Lipsa cunoștințelor privind mecanismele imunologice donator de măduvă osoasă incompatibilitate și primitor, în timp ce mortalitatea ridicată cauzată din cauza frecventă a grefei neprizhivleniya și reacția de dezvoltare „grefă contra gazdă“. Descoperirea complexului major de histocompatibilitate, care este compus din antigenul leucocitar uman (HbA) și îmbunătățirea metodelor de dactilografiere posibilă creșterea semnificativă a ratei de supraviețuire după transplantul de măduvă osoasă, care a condus la scara larga aceasta metoda de tratament in Oncologie si Hematologie. După un deceniu, a fost efectuat primul transplant de celule stem hematopoietice (HSC) obținut din sângele periferic cu ajutorul leucoferezei. În 1988, în Franța, pentru tratamentul unui copil cu anemie Fanconi ca sursă de CSH a fost folosit pentru prima dată de sânge din cordonul ombilical, iar la sfârșitul anului 2000 în presă au început să apară cu privire la capacitatea de HSC să se diferențieze în celule de diferite tipuri de țesuturi, care se extinde potențial sfera de aplicare a acestora clinice. Cu toate acestea, sa dovedit că materialul pentru transplant, împreună cu GSK, conține o cantitate semnificativă de celule ne-hemopoietice, care sunt diverse în natură și proprietăți. În legătură cu aceasta, sunt dezvoltate metode de purificare a grefei și criterii de evaluare a purității sale celulare. În special, este utilizată imunozătarea pozitivă a celulelor CD34 +, ceea ce face posibilă izolarea HSC cu ajutorul anticorpilor monoclonali.

[8], [9], [10], [11], [12]

Complicațiile terapiei cu celule stem

Complicațiile transplantului de măduvă osoasă sunt, cel mai adesea, hematologice și sunt asociate cu o perioadă prelungită de pancitopenie iatrogenică. Cele mai frecvente infecții sunt anemia, anemia și hemoragiile. În acest sens, este foarte important modul de a găsi modul optim de prelevare a probelor, prelucrarea și stocarea de măduvă osoasă pentru conservarea maximă a celulelor stem care asigură o recuperare rapidă și stabilă a hematopoiezei. In caracterizarea grefa luate pentru a evalua următorii parametri este acum: numărul de mononucleare și / sau celule nucleate și celule formatoare de colonii de conținut de unități SB34-pozitive. Din păcate, acești indicatori oferă doar o estimare indirectă a capacității hematopoietice reale a populației de transplant de celule stem. În prezent, există parametri absolut corectă care determină suficiența grefei de recuperare pe termen lung a hematopoiezei la pacientii chiar si cu transplant de măduvă osoasă autologă. Dezvoltarea unor criterii comune este extrem de dificilă din cauza lipsei de standarde rigide de procesare, de crioconservare și de testare a grefei. În plus, este necesar să se ia în considerare varietatea factorilor care influențează parametrii recuperării cu succes a hematopoiezei la fiecare pacient. In transplantul de măduvă osoasă autologă cele mai importante dintre acestea sunt numărul de regimuri anterioare, în special regimul de condiționare, o perioadă a bolii, care este produs în măduva osoasă schema de colectare a coloniei aplicare factori de stimulare în perioada posttransplant. În plus, nu trebuie uitat că chimioterapia precedată de altoirea fetală poate avea un efect negativ asupra celulelor stem din măduva osoasă.

Incidența complicațiilor toxice severe crește semnificativ în cazul transplantului de măduvă osoasă alogenă. În acest sens, sunt interesante datele statistice privind transplantul de măduvă osoasă alogenă în talasemie. În rapoartele Grupului european de transplant al măduvei osoase, au fost înregistrate aproximativ 800 de transplanturi de măduvă osoasă la pacienții cu talasemie mare. Transplantul alogenic in talasemia in majoritatea cazurilor efectuate la fratii HLA identic, care este asociată cu complicații grave și mortalitate mai mare în transplantul de material cu celule stem legate parțial compatibile sau potrivite donatorii independenți. Pentru a minimiza riscul de complicații infecțioase fatale, pacienții sunt plasați în cutie aseptice izolate cu flux laminar, sunt dietă scăzută sau abacterial. Pentru decontaminarea bacteriană a intestinului per os prescrie forme non-resorbtive de antibiotice, medicamente antifungice. Pentru a preveni amfotericina intravenoasa B. Prevenirea infectiilor sistemice amikacina si ceftazidim fixe, care desemnează o zi înainte de transplant, în cazul continuării tratamentului pentru descărcarea pacienților. Toate preparatele din sânge înainte de iradiere sunt iradiate la o doză de 30 Gy. Nutriția parenterală în timpul transplantului este o condiție prealabilă și începe imediat prin limitarea aportului de alimente în mod natural.

O serie de complicații asociate cu toxicitate ridicată de medicamente imunosupresoare, care provoacă adesea greață, vărsături și inflamații ale mucoaselor, leziuni renale, și pneumonie interstițială. Una dintre cele mai severe complicatii ale chimioterapiei este venookklyuzionnaya boli hepatice care duce la deces în perioada post-transplant precoce. Printre factorii de risc pentru tromboză venoasă a sistemului portal al ficatului trebuie remarcat vârsta pacientului, prezența de hepatită și fibroza hepatică și deținerea terapiei imunosupresoare după transplantul de măduvă osoasă. Venookklyuzionnaya boala este deosebit de periculoasă în talasemia, care este însoțită de hemosideroza fibroza hepatică și hepatită - sateliți frecvente trans-terapie fuzională. Tromboză venoasă a sistemului portal al ficatului se dezvoltă în decurs de 1-2 săptămâni după transplant și se caracterizează printr-o creștere rapidă a bilirubinei din sânge și transaminazele, hepatomegalia progresivă, ascită, encefalopatie și durere la nivelul abdomenului superior. Histologic materialul autopsie definit in leziuni endoteliale, hemoragie subendotelial, leziunile tsentrolobulyarnyh hepatocite, venulele hepatice obstrucție trombotice și vena centrală. Pacienții cu talasemie sunt descrise cazuri de stop cardiac fatal legate de efectele toxice ale citostaticelor.

În pregătirea pentru transplant, ciclofosfamida și busulfanul cauzează adesea cistită hemoragică toxică cu modificări patologice în celulele uroepiteliale. Utilizarea ciclosporinei A în transplantul de măduvă osoasă este adesea însoțită de efectele nefro- și neurotoxicității, sindromul hipertensiunii, retenția de lichide în organism și citoliza hepatocitelor. Încălcarea funcțiilor sexuale și reproductive este mai frecvent observată la femei. La copiii mici, după transplant, dezvoltarea pubertății nu suferă de obicei, dar la copiii mai mari patologia dezvoltării sferei genitale poate fi foarte gravă - până la sterilitate. Complicațiile care au legătură directă cu transplantul în sine includ respingerea celulelor maduvei osoase alogene, incompatibilitatea în sistemul ABO, formele acute și cronice ale reacției "grefă versus gazdă".

În pacient după transplant de măduvă osoasă ABO incompatibil tip idioagglutinin „gazdă împotriva ABO donator“ produs în termen de 330-605 de zile după transplant, care poate duce la hemoliza prelungită și o creștere bruscă a nevoii de transfuzii de sânge. Complicație menționată este prevenită prin transfuzie de eritrocite grupe numai 0. După transplant într-un număr de pacienți autoimuna neutropenie, trombocitopenie, pancitopenie, sau, pentru corectarea care trebuie efectuată splenectomie.

In 35-40% din beneficiarii de reacție acută „grefă contra gazdă“ se dezvoltă în decurs de 100 de zile după transplant de măduvă osoasă alogenice-hemoglobină identică. Gradul de leziuni ale pielii, ficat și intestine variază de la erupții cutanate, hiperbilirubinemie, diaree și ușoară la descuamarea pielii, obstrucție intestinală și insuficiență hepatică acută. Pacientii cu frecventa talasemie „grefă contra gazdă“ acută reacție măsură I după transplantul de măduvă osoasă este de 75%, II și mai mare măsură - 11-53%. Reacție cronică „grefă contra gazdă“ ca un sindrom multiorgan sistemic dezvoltă de obicei în termen de 100-500 de zile după transplantul de măduvă osoasă alogenă la 30-50% dintre pacienți. Sunt afectate pielea, gura, ficatul, ochii, esofagul și tractul respirator superior. Distinge formă limitată de reacție „grefă contra gazdă“ cronică atunci când pielea afectată și / sau ficatului, pe scara larga, leziuni cutanate generalizate atunci când sunt combinate cu hepatită cronică agresivă, boli de ochi, glandele salivare sau orice alt organ. Cauza morții este adesea complicațiile infecțioase care rezultă din imunodeficiența severă. In forma usoara cronica talasemiei a „grefa versus gazda“ Reacția a fost găsită în 12%, moderată - 3% și severe - au 0,9% din beneficiarii de măduvă osoasă alogenic HLA-compatibile. O complicație gravă în transplantul de măduvă osoasă este respingerea transplantului, care se dezvoltă la 50-130 zile după operație. Frecvența de respingere depinde de modul de condiționare. In particular, pacienții cu talasemie tratați în timpul preparării metotrexat în monoterapie, respingerea grefei de măduvă osoasă este observată la 26% din cazuri, combinații de metotrexat cu ciclosporină A - 9%, iar când se asociază numai ciclosporină A - 8% din cazuri (Haziyev etc. ., 1995).

Infecțiile complicate după transplantul de măduvă osoasă provoacă viruși, bacterii și ciuperci. Dezvoltarea lor este legată de neutropenie profundă, care este indusă în timpul chimioterapiei condiționat, citostaticele învinge barierele mucoase și de reacție „grefă contra gazdă“. În funcție de timpul de dezvoltare, există trei faze de infecție. În prima fază (în curs de dezvoltare, în prima lună post-transplant) este dominat de deteriorarea barierei mucoaselor si neutropenie, adesea însoțită de infecții virale (herpes, virusul Epstein-Barr, citomegalovirus, Varicella zoster), precum și infecții cauzate de grampolozhi - bacterii inflamatorii și Gram-negative, Candida ciuperci , aspergiloame. În perioada post-transplant precoce (a doua și a treia luni după transplant) este infecția cu citomegalovirus cele mai severe, care de multe ori duce la moartea pacienților în a doua fază a infecției. Infecția cu citomegalovirus talasemie după transplantul de măduvă osoasă apare la 1.7-4.4% dintre destinatari. Faza a treia se observă în perioada tardivă post-transplant (la trei luni după operație) și se caracterizează prin imunodeficiență combinată severă. Această perioadă se constată frecvent infecții cauzate de virusul varicelei, streptococ, Pneumocystis Carini, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, și virusurile hepatotropic. Mortalitatea talasemie la pacienți după transplant de măduvă osoasă este asociată cu sepsis bacterian și fungice, interstițială idiopatică și pneumonia citomegalovirus, sindrom de detresă respiratorie acută, insuficiență cardiacă acută, tamponada cardiacă, hemoragie cerebrală, boli de ficat venookklyuzionnoy și reacția „grefă contra gazdă“ acut.

În prezent, s-au înregistrat anumite progrese în dezvoltarea metodelor de izolare din măduva osoasă a unei populații pure de celule stem hematopoietice. Tehnica de obținere a sângelui fetal din cordonul ombilical a fost îmbunătățită și s-au dezvoltat metode de izolare a celulelor care formează sânge din sângele din cordonul ombilical. În presa științifică există rapoarte că, atunci când sunt cultivate în medii cu citokine, celule stem hematopoietice sunt capabile de multiplicare. Atunci când se utilizează bioreactoare special concepute pentru extinderea HSC, biomasa celulelor hemopoetice stem izolate din măduva osoasă, sângele periferic sau din cordonul ombilical este crescută în mod semnificativ. Posibilitatea expansiunii HSC este un pas important în dezvoltarea clinică a transplantului de celule.

Cu toate acestea, înainte de reproducere in vitro GSK este necesar să se aloce o populație omogenă de celule stem hematopoietice. Acest lucru este de obicei realizată folosind markeri, care permite marcarea selectiv anticorpi monoclonali HSC legate covalent la eticheta magnetic sau fluorescent și selectați-le cu un sortator de celule adecvate. În același timp, problema caracteristicilor fenotipice ale celulelor stem hematopoietice nu a fost soluționat. A. Petrenko., V. Hryschenko (2003), în calitate de candidați pentru GSK tratate celule, care sunt prezente pe suprafața CD34, AC133 și antigeni Thyl și nu CD38, HLA-DR și a altor markeri de diferențiere (celule cu CD34 fenotip + Liir). Prin markeri de diferențiere liniare (descendență, Lin) includ glycophorin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Considerat promițătoare pentru transplant de celule cu fenotip CD34 + CD45RalüW CD71low, precum CD34 + Thyl + CD38low / c-kit-/ redus.

Problema numărului de HSC-uri care este suficientă pentru transplantul eficient rămâne o problemă. În prezent, sursa celulelor stem care formează sânge este măduva osoasă, sângele periferic și cordonul ombilical, precum și ficatul embrionar. Extinderea celulelor stem hemopoietice se realizează prin cultivarea acestora în prezența endoteliocitelor și a factorilor de creștere hematopoietici. În diferite protocoale, mieloproteine, SCF, eritropoietină, factori de creștere asemănători insulinei, corticosteroizi și estrogeni sunt utilizați pentru a induce proliferarea HSC. Când se utilizează combinații de citokine in vitro, se poate obține o creștere semnificativă a concentrației de HSC cu un vârf al eliberării lor la sfârșitul celei de-a doua săptămâni de cultivare.

În mod tradițional, sângele din cordonul ombilical HSC este utilizat în principal în hemoblastoză. Cu toate acestea, doza minimă de celule hematopoietice necesare pentru transplantul cu succes a celulelor din sângele ombilical este de 3,7 x 10 ⁷ celule nucleate la 1 kg de greutate corporală a destinatarului. Utilizarea unei cantități mai mici de HSC crește semnificativ riscul de insuficiență a grefei și de recădere a bolii. Prin urmare, transplantul de celule care formează sânge din sângele din cordonul ombilical este utilizat în principal în tratamentul hemoblastozei la copii.

Din păcate, încă nu există standarde de achiziție, precum și protocoale standardizate pentru utilizarea clinică a celulelor hematopoietice din sângele din cordonul ombilical. În consecință, celulele stem din sângele ombilical nu reprezintă o sursă recunoscută legal de celule hematopoietice pentru transplant. În plus, nu există norme etice și juridice care să reglementeze activitatea și organizarea băncilor de sânge ombilical, disponibile în străinătate. Între timp, pentru transplantul sigur, toate probele de sânge din cordonul ombilical trebuie monitorizate cu atenție. Înainte de colectarea unei probe de sânge de la o femeie însărcinată, trebuie obținut consimțământul ei. Fiecare gravidă trebuie examinată pe un cărucior de AgHBs, anticorpi la virusul hepatitei C, HIV și sifilis. Fiecare probă de sânge din cordonul ombilical trebuie testată în mod curent pentru numărul de celule nucleate, CD34 + și capacitatea de formare a coloniilor. În plus, se efectuează tastarea HLA, determinarea grupului sanguin în funcție de ABO și apartenența la factorul Rhesus. Procedurile de testare sunt necesare culturilor pe sterilitate bacteriologic, testele serologice pentru HIV-1 și HIV-2 infectie, HBsAg, virusul hepatitei C, infecția cu citomegalovirus, NTLY NTLY-1 și II, sifilis, toxoplasmoza. În plus, se efectuează o reacție în lanț a polimerazei pentru a detecta citomegalovirusul și infecția cu HIV. Pare oportun să se completeze analiza protocoalelor de testare ombilical HSC sânge din cordonul ombilical pentru a identifica astfel de boli genetice, cum ar fi talasemie si siclemie, deficit de adenozin deaminază, agamaglobulinemia Bruton, boala Harlera si punter.

La următoarea etapă de pregătire pentru transplant, se pune problema păstrării GSK. Cele mai periculoase pentru viabilitatea celulelor la prepararea lor sunt procedurile de înghețare și dezghețare. Când se blochează celulele hemopoietice, o parte semnificativă a acestora poate fi distrusă datorită formării cristalului. Pentru a reduce procentul de moarte celulară, se utilizează substanțe speciale - crioprotectori. Cel mai adesea, în calitate de crioprotector, se utilizează DMSO la o concentrație finală de 10%. Cu toate acestea, pentru DMSO, această concentrație este caracterizată printr-un efect citotoxic direct, care se manifestă chiar și în condiții de expunere minimă. Redus efect citotoxic realizată prin menținerea unui mod de expunere și conformitatea reglarea temperaturii zero, materialul de prelucrare rigid în timpul și după decongelare (viteza tuturor manipulărilor aplicarea procedurilor multiple de spălare). Nu aplicați o concentrație de DMSO mai mică de 5%, deoarece în acest caz, moartea în masă a celulelor hematopoietice se produce în timpul perioadei de îngheț.

Prezența impurităților celulelor roșii din sânge în amestecul de suspensie GSK creează pericolul de a dezvolta o reacție de incompatibilitate pentru antigene de eritrocite. În același timp, prin eliminarea eritrocitelor, pierderea celulelor hematopoietice crește semnificativ. În această privință, a fost propusă o metodă de separare fracționată a GCS. În acest caz, pentru a proteja celulele nucleate de efectele dăunătoare ale temperaturilor scăzute utilizând soluție 10% DMSO și răcire la o viteză constantă (HS / min) până la -80 ° C, după care suspensia de celule a fost înghețat în azot lichid. Se crede că prin această tehnică de crioconservare are loc o liză parțială a eritrocitelor, prin urmare eșantioanele de sânge nu necesită fracționare. Înainte de transplantare, suspensia celulară este decongelată, spălată fără hemoglobină și DMSO într-o soluție de albumină umană sau ser. Păstrarea progenitoare folosind această metodă este într-adevăr mai mare decât după fracționare sângelui din cordonul ombilical, dar pericolul complicațiilor cauzate de transfuzie de transfuzii ABO incompatibile cu eritrocit stocate.

Stabilirea unui sistem de bănci pentru depozitarea probelor HSC testate și HSC ar putea rezolva problemele de mai sus. Cu toate acestea, pentru aceasta este necesar să se dezvolte norme etice și legale, care sunt încă doar discutate. Înainte de crearea unei rețele bancare, este necesar să se adopte o serie de dispoziții și documente privind standardizarea procedurilor de eșantionare, fracționare, testare și tipare și crioconservarea GCW. O condiție esențială a activității eficiente a băncilor GSK este organizarea de baze de date informatice pentru relația cu donator de maduva osoasa inregistreaza World Association (WMDA) și măduva osoasă Națională donator Statelor Unite pentru Programul (NMDP).

În plus, este necesar să se optimizeze și să se standardizeze metodele de expansiune HSC in vitro, în primul rând celule hematopoietice din sângele din cordonul ombilical. Reproducerea sângelui cordonului HSC este necesară pentru creșterea numărului de potențiali beneficiari compatibili cu sistemul HLA. Datorită cantităților mici de sânge din cordonul ombilical, cantitatea de HSC conținută în acesta nu este, de regulă, capabilă să asigure repopularea măduvei osoase la pacienții adulți. În același timp, pentru efectuarea transplanturilor independente, este necesar să se aibă acces la un număr suficient de probe tipice GSK (de la 10.000 la 1.500.000 la 1 recipient).

Transplantul de celule stem hemopoietice nu elimină complicațiile care însoțesc transplantul de măduvă osoasă. Analiza arată că în transplantul de celule stem din sângele ombilical, forme severe de reacție acută "grefă-versus-gazdă" se dezvoltă în 23%, cronică la 25% dintre beneficiari. La pacienții oncohematologici, recidivele de leucemie acută în primul an după transplantul de sânge din cordonul ombilical sunt observați în 26% din cazuri.

În ultimii ani, metodele de transplantare a celulelor stem hematopoietice periferice s-au dezvoltat intens. Conținutul de HSC din sângele periferic este atât de mic (există 1 GSK la 100.000 celule sanguine), încât izolarea lor fără preparare specială nu are sens. De aceea, donatorului i sa dat anterior un curs de stimulare a eliberării de celule hematopoietice de măduvă osoasă în sânge. În acest scop, se utilizează astfel de medicamente extrem de inofensive precum factorul de stimulare a ciclofosfamidei și a coloniilor de granulocite. Dar chiar și după procedura de mobilizare a HSC în sângele periferic, conținutul de celule CD34 + în el nu depășește 1,6%.

Pentru a mobiliza HSC în clinică, C-CEC este mai frecvent utilizat, care se caracterizează prin tolerabilitate relativ bună, cu excepția aspectului aproape obișnuit al durerii în oase. Trebuie remarcat faptul că utilizarea separatoarelor de sânge moderne ne permite să izolați în mod eficient progenitorii sângelui de hematopoieză. Cu toate acestea, în condiții de hematopoieză normală, trebuie efectuate cel puțin 6 proceduri pentru a obține un număr suficient de celule stem hematopoietice, comparabile cu capacitatea repopulativă a tulpinii măduvei osoase. Cu fiecare astfel de procedeu, separatorul procesează 10-12 litri de sânge, care poate provoca trombocitopenie și leucopenie. Procedura de separare implică administrarea unui donor anticoagulant (citrat de sodiu), care nu exclude, totuși, contactarea activării trombocitelor în timpul centrifugării extracorporale. Acești factori creează condiții pentru dezvoltarea complicațiilor infecțioase și hemoragice. Un alt dezavantaj al metodei constă în variabilitatea considerabilă a răspunsului mobilizării, care necesită monitorizarea conținutului de HSC în donatorii de sânge periferic, necesari pentru a determina nivelul lor maxim.

Transplantul autologe HSC, spre deosebire de alogenice, elimină complet dezvoltarea reacției de respingere. Cu toate acestea, un dezavantaj semnificativ de transplant autolog de celule stem hematopoietice, limitând domeniul de indicații pentru comportamentul său, este o mare probabilitate de celule reinfusion clona leucemică cu un transplant. Mai mult, lipsa efectului imun mediat de „grefa-contra-tumoral“ crește semnificativ frecvența recurenței bolilor maligne ale sângelui. Prin urmare, singura cale de eliminare radicală a neoplazice hematopoietice clonale și restore hematopoieza policlonal normale în sindromul mielodisplazic este chimioterapia intensivă cu transplantul de HSC alogen.

Dar chiar și în acest caz, tratamentul este direcționat la majoritatea tumori maligne hematologice crește doar în ceea ce privește supraviețuirea și îmbunătățirea calității vieții lor. Conform mai multor studii majore, fără boală supraviețuirea pe termen lung a fost obținută la 40% dupa allotransplantation pacienti GSK cu tumori maligne hematologice. Când se folosește o celula stem de potrivire a hemoglobinei frate cele mai bune rezultate sunt observate la pacienții tineri cu o scurta istorie a bolii, numărul de celule blastice până la 10%, și citogenetică favorabile. Din păcate, mortalitatea asociată cu procedura de HSC allotransplantation, pacienții cu boală mielodisplazice rămâne ridicată (în majoritatea mesajelor - aproximativ 40%). Rezultatele 10 ani de muncă Programul US National de donare de măduvă osoasă (510 pacienți, vârsta mediană - 38 ani) indică faptul că boala fără supraviețuirea este de 29% în termen de doi ani, la o probabilitate relativ scăzută de recidivă (14%). Cu toate acestea, rata de mortalitate din cauza procedurii de allotransplantation CSH de la un donator care nu au legătură, și ajunge extrem de mare pe o perioadă de doi ani, 54%. Rezultate similare au fost obținute în studiul european (118 pacienți, vârsta medie - 24 de ani, de doi ani recurență supravietuire fara - 28% recidiva - mortalitate de 35% - 58%).

În efectuarea de chimioterapie intensivă, urmată de reducerea celulelor hematopoietice alogene gemopo- etice apar adesea imuno și transfuziei de complicații. În multe privințe, ele sunt legate de faptul că grupurile de sânge la oameni sunt moștenite independent de moleculele MHC. Prin urmare, chiar dacă donatorul și receptorul sunt compatibile cu principalele antigene HLA, eritrocitele lor pot avea un fenotip diferit. Alocați „mare“ incompatibilitate atunci când preexist în anticorpul recipient pentru antigeni de donator de celule roșii din sânge, și „mici“, atunci când donatorul anticorpi la antigenele de celule roșii din sânge ale destinatarului. Există cazuri de combinare a incompatibilităților "mari" și "mici".

Rezultatele analizei comparative a eficacității clinice a măduvei osoase și a celulelor stem hematopoietice alografelor sânge ombilical în tumori maligne hematologice indică faptul că copiii allotransplantation GSK de sange din cordonul ombilical a redus semnificativ riscul de reacție „grefă contra gazdă“, dar există o perioadă mai lungă de recuperare de neutrofile și trombocite o frecvență mai mare a mortalității după transplant de 100 de zile.

Studiul cauzelor letalității timpurii a făcut posibilă clarificarea contraindicațiilor transplantului alogen al GSK, dintre care cele mai importante sunt:

• prezența în recipient sau donator a testelor pozitive pentru infecția cu citomegalovirus (fără a efectua un tratament preventiv);
• boală acută de radiații;
• prezența sau chiar suspiciunea prezenței unei infecții micotice la pacient (fără profilaxie timpurie sistemică cu medicamente fungicide);
• hemoblastoză, în care pacienții au primit tratament prelungit cu citostatice (datorită probabilității mari de stop cardiac și a insuficienței multiple a organelor);
• transplantul de la donatori HLA ne-identici (fără prevenirea reacției acute de "transplant împotriva gazdei" de către ciclosporina A);
• hepatita cronică virală C (datorită riscului ridicat de apariție a bolii veno-ocluzive a ficatului).

Astfel, transplantul GSK poate provoca complicații grave, ceea ce duce deseori la moarte. La începutul anilor (până la 100 de zile post-transplant) perioada acestea includ complicații infecțioase, reacția acută „grefă contra gazdă“, respingerea transplantului (neprizhivlenie HSC donor), venookklyuzionnaya boli de ficat, precum și datorită toxicității regimului pregătitor, leziuni tisulare, pentru care caracteristica ridicată viteza de remodelare (piele, endoteliu vascular, epiteliu intestinal). Complicațiile perioada tardivă post-transplant includ reacția cronică de „grefă contra gazdă“ recurența bolii de baza, întârzierea creșterii la copii, afectarea funcției reproductive și a bolilor de ochi tiroidian.

Recent, în legătură cu apariția publicațiilor privind plasticitatea celulelor din măduva osoasă, a apărut ideea utilizării GSK pentru tratamentul atacurilor de inimă și a altor boli. Deși unele experimente pe animale susțin și această posibilitate, concluziile privind plasticitatea celulelor din măduva osoasă trebuie confirmate. Această circumstanță ar trebui luată în considerare de acei cercetători care cred că celulele transplantate ale măduvei osoase umane sunt ușor transformate în celule de mușchi scheletici, miocard sau CNS. Ipoteza că GSK-urile sunt o sursă celulară naturală de regenerare a acestor organe necesită dovezi serioase.

În special, a publicat primele rezultate ale unui studiu deschis, randomizat, Belenkova V. (2003), al căror scop - pentru a studia efectul C-SIS (de exemplu, mobilizarea CSH sanguine autologe) asupra clinice, hemodinamic și starea neuroumoral de pacienți cu insuficiență cardiacă moderată cronică severă, precum și evaluarea siguranței cu terapia standard (inhibitori ai ECA, beta-blocante, diuretice, glicozide cardiace). Prima publicare a rezultatelor autorilor programului de cercetare notăm că singurul argument în favoarea O-CBP sunt rezultatele tratamentului unui pacient care în timpul tratamentului cu acest medicament gasit imbunatatire incontestabila a tuturor parametrilor clinici și hemodinamici. Cu toate acestea, teoria mobilizării HSC în fluxul sanguin, urmată de regenerarea miocardului în zona de post-infarct nu a fost confirmat - chiar și la pacienții cu o dinamică pozitive clinice ale ecocardiografia de stres cu dobutamină nu au evidențiat apariția miocardului viabil în zonele cicatrice ale câmpului.

Trebuie remarcat faptul că, în prezent, datele care permit recomandarea terapiei celulare substitutive pentru introducerea pe scară largă în practica clinică de zi cu zi nu sunt în mod clar suficiente. Un spectacol bine realizat și calitativă a studiilor clinice pentru a determina eficacitatea diferitelor opțiuni ale terapiei cu celule de regenerare, dezvoltarea indicații și contraindicații pentru aceasta, precum și liniile directoare privind utilizarea combinată a regenerative și terapia de plastic si tratament chirurgical sau conservator convențional. Până în prezent, nici un răspuns la întrebarea de ce fel de o populație de celule de măduvă osoasă (stem hematopoietice sau stromale) pot da naștere la neuroni și cardiomiocite, și nu este clar ce condiții contribuie la acest lucru in vivo.

Activitatea în aceste domenii se desfășoară în multe țări. În rezumatul simpozion privind insuficienta hepatica acuta US National Institutes of Health, printre metodele promițătoare de tratament, impreuna cu transplantul de ficat, transplant marcate conexiune hepatocite xenon sau alogen și în bioreactoare vitro cu celulele hepatice. Există dovezi directe că numai hepatocitele străine, active din punct de vedere funcțional, pot oferi un sprijin eficient ficatului destinatarului. Pentru utilizarea clinică a hepatocitelor izolate necesare pentru a crea o bancă de celule, ceea ce va reduce foarte mult timpul între eliberarea celulelor și utilizarea acestora. Cel mai acceptabil pentru crearea unei bănci de hepatocite izolate este crioconservarea celulelor hepatice în azot lichid. Utilizarea unor astfel de celule în clinică pentru pacienții cu boli hepatice acute si cronice a relevat un efect terapeutic suficient de ridicat.

In ciuda rezultatelor optimiste și încurajatoare ale transplantului de celule hepatice in experiment si clinica, există încă multe probleme sunt încă departe de a fi rezolvată. Acestea includ cantitatea limitată de organisme adecvate pentru a obține hepatocite izolate metode insuficient eficiente de separare, lipsa unor metode standardizate de conservare a celulelor hepatice intelegerea fuzzy a mecanismelor de reglementare a creșterii și proliferării celulelor transplantate, lipsa de evaluare sau de respingere a hepatocitelor alogenice metode de grefare adecvate. Acest lucru ar trebui să includă prezența imunității transplantului folosind celule alogeneice sau xenogeneice, deși mai puțin decât în transplantul ortotopic de ficat, dar care necesită aplicarea unor medicamente imunosupresoare, încapsularea hepatocite izolate sau de enzime speciale de procesare. Transplantul de hepatocite duce adesea la un conflict imun între primitor și donator într-o reacție de respingere, care impune utilizarea citostaticelor. O soluție la această problemă este de a utiliza media microporoase polimer pentru a izola celulele hepatice, care vor îmbunătăți supraviețuirea lor, deoarece membrana capsulei protejează în mod eficient hepatocitelor, în ciuda imunizării gazdă.

Cu toate acestea, în insuficiența hepatică acută astfel de transplant de hepatocite nu are nici un efect, din cauza timpului destul de lung necesar pentru grefarea celulelor hepatice în noul mediu, cu acces la o funcționare optimă pas. O limitare potențială este secreția biliară transplant ectopice a hepatocitelor izolate, iar atunci când se utilizează bioreactoare barieră fiziologică esențială acționează discrepanță între specii proteine umane si proteine care produc hepatocitele xenogene.

În literatura de specialitate există rapoarte care transplantul local al celulelor stem stromale ale măduvei osoase facilitează corecție eficientă a defectelor osoase și refacerea oaselor în acest caz este mai intensă decât în regenerarea reparatorie spontane. In mai multe studii preclinice pe modele animale au demonstrat în mod convingător posibilitatea de a folosi transplanturi de celule stromale de măduvă osoasă în ortopedie, deși pentru a optimiza aceste metode, chiar și în cazurile cele mai simple, sunt necesare lucrări suplimentare. În special, condițiile optime pentru expansiunea celulelor stromale osteogene ex vivo nu au fost încă găsite, structura și compoziția purtătorului lor ideal (matrice) rămân neoperate. Numărul minim de celule necesare pentru regenerarea osoasă în vrac nu este determinat.

Se demonstrează că celulele stem mezenchimale prezintă plasticitate transgermală - capacitatea de a se diferenția în tipuri celulare care nu au legătură fenotipică cu celulele liniei originale. In conditii optime policlonal de celule stem linia de cultură a celulelor stromale medulare menținute in vitro, pentru mai mult de 50 de diviziuni, ceea ce face posibilă primirea de miliarde de celule stromale de la 1 ml de aspiratul de măduvă osoasă. Cu toate acestea, populația de celule stem mezenchimale caracterizate prin eterogenitate, care se manifestă ca o variabilitate în dimensiuni de colonii, diferite viteze de formare și diversitate morfologică a tipurilor de celule - de la fibroblast-like ax în formă pentru celule plane de mari dimensiuni. In termen de 3 săptămâni de celule stem stromale observate cultura heterogenitate fenotipică: o colonie care formează noduli de țesut osos, în timp ce altele - grupuri de adipocite și alte, mai rare, insule care formează de cartilaj.

Pentru tratamentul bolilor degenerative ale sistemului nervos central, a fost folosit mai întâi transplantul de țesut nervos embrionar. În ultimii ani, în loc de țesutul creierului embrionar, elementele celulare ale neurosferelor derivate din celule stem neurale au fost transplantate (Poltavtseva, 2001). Neurosferele conțin precursori neuronali comuni și neuroglia - aceasta dă speranță pentru restaurarea funcțiilor creierului pierdut după transplantul lor. După transplantul de celule la neurosferele corp șobolan striato cerebral dispersat marcat proliferarea și diferențierea în neuronii dopaminergici, care elimina asimetria motorie la șobolani cu gemiparkinsonizmom experimental. Cu toate acestea, în unele cazuri, celulele tumorale s-au dezvoltat din celulele neurosferei, ceea ce a condus la moartea animalelor (Bjorklund, 2002).

Clinica de studiu atent a două grupe de pacienți, în care nici pacientii, nici medicii lor (dublu-orb) a știut vizionarea, că un grup de pacienti transplantat tesut embrionar cu neuronilor care produc dopamina, un al doilea grup de pacienți a făcut un pas fals, a dat rezultate neașteptate . Pacienții care au fost transplantați cu țesut nervos embrionic nu s-au simțit mai bine decât pacienții din grupul de control. Mai mult, 5 din 33 de pacienți după 2 ani după transplant de țesut neural embrionar dezvoltat diskinezia persistenta, care a avut nici un grup de pacienți de control (celule stem: progresul științific și direcții de cercetare viitoare Nat Inst, Sănătății USA ...). Una dintre problemele nerezolvate ale studiilor clinice de celule stem neuronale ale creierului este analiza perspective reale și limitări ale transplantului derivaților lor pentru corectarea tulburărilor SNC. Este posibil ca activitatea prelungită la crize induse neyronogenez in hipocampus, ceea ce duce la modificări structurale și funcționale poate fi un factor în dezvoltarea progresivă a epilepsiei. Această concluzie este remarcabil, deoarece indică posibilele efecte negative ale generării de neuroni noi in creier pentru adulti, si formarea de conexiuni sinaptice aberante.

Nu trebuie să uităm că în mediul de cultură cu citokine (mitogeni) aproximează caracteristicile celulelor stem cu cea a celulelor tumorale, deoarece acestea apar aproape de modificări în reglarea ciclurilor celulare, determinarea capacității de a diviza pe termen nelimitat. Este nemaipomenit să transplantăm la oameni derivații timpurii ai celulelor stem embrionare, deoarece în acest caz amenințarea de dezvoltare a neoplasmelor maligne este foarte mare. Este mult mai sigur să se folosească descendenții lor mai angajați, adică celule progenitoare de linii diferențiate. Cu toate acestea, în prezent, nu a fost încă elaborată o tehnică fiabilă pentru obținerea de linii celulare stabile umane care să se diferențieze în direcția cea bună.

Utilizarea tehnologiilor de biologie moleculară pentru corectarea patologiei ereditare și a bolilor umane cu ajutorul modificării celulelor stem este de mare interes pentru medicina practică. Caracteristicile genomului celulelor stem permit dezvoltarea schemelor unice de transplant cu scopul de a corecta bolile genetice. Dar în această direcție există, de asemenea, o serie de limitări care trebuie depășite înainte ca aplicarea practică a ingineriei genetice a celulelor stem să înceapă. În primul rând, este necesar să se optimizeze procesul de modificare a genomului de celule stem ex vivo. Se știe că o proliferare prelungită (de 3-4 săptămâni) a celulelor stem reduce transfecția lor, deci sunt necesare mai multe cicluri de transfecție pentru a obține un nivel ridicat al modificării lor genetice. Cu toate acestea, principala problemă este legată de durata de exprimare a genei terapeutice. Până în prezent, în niciunul dintre studii, perioada de expresie efectivă după transplantare a celulelor modificate nu a depășit patru luni. În 100% din cazuri în timp, expresia genelor transfectate este redusă datorită inactivării promotorilor și / sau moartea celulelor cu un genom modificat.

O problemă importantă este costul utilizării tehnologiilor celulare în medicină. De exemplu, cerința anuală de finanțare estimată doar pentru cheltuielile medicale ale unui departament de transplant de măduvă osoasă, concepută pentru a efectua 50 de transplanturi pe an, este de aproximativ 900.000 de dolari.

Dezvoltarea tehnologiilor celulare în medicina clinică este un proces complex și în mai multe etape care implică o cooperare constructivă a centrelor științifice și clinice multidisciplinare și a comunității internaționale. În același timp, se acordă o atenție deosebită organizării științifice a cercetării în domeniul terapiei celulare. Cele mai importante dintre acestea sunt elaborarea de protocoale pentru studiile clinice, monitorizarea validității datelor clinice, formarea unui registru național de cercetare, integrarea în programele internaționale de studii clinice multicentrice și introducerea rezultatelor în practica clinică.

Concluzii introducerea unor probleme de transplant de celule, aș dori să exprim speranța că eforturile comune de conducere experți din Ucraina din diferite domenii ale științei vor asigura un progres semnificativ în studiile clinice și experimentale și va permite în următorii ani pentru a găsi modalități eficiente de a ajuta oamenii grav bolnavi care au nevoie de transplanturi de organe , țesuturi și celule.

[13], [14], [15], [16], [17], [18]