Celule stem hematopoietice ale sacului gălbenuș

Evident, diversele potențiale proliferative și de diferențiere ale celulelor stem hematopoietice sunt determinate de particularitățile dezvoltării lor ontogenetice, deoarece chiar și localizarea principalelor zone de hematopoieză se modifică la om în timpul ontogenezei. Celulele progenitoare hematopoietice din sacul vitelin fetal sunt dedicate formării unei linii celulare exclusiv eritropoietice. După migrarea HSC-urilor primare către ficat și splină, spectrul liniilor de angajare se extinde în micromediul acestor organe. În special, celulele stem hematopoietice dobândesc capacitatea de a genera celule din linia limfoidă. În perioada prenatală, celulele progenitoare hematopoietice ajung în zona de localizare finală și populează măduva osoasă. În timpul dezvoltării intrauterine, sângele fetal conține un număr semnificativ de celule stem hematopoietice. De exemplu, în săptămâna a 13-a de sarcină, nivelul HSC atinge 18% din numărul total de celule mononucleare din sânge. Ulterior, se observă o scădere progresivă a conținutului lor, dar chiar înainte de naștere, cantitatea de HSC-uri din sângele cordonului ombilical diferă puțin de cantitatea lor din măduva osoasă.

Conform conceptelor clasice, schimbarea naturală a localizării hematopoiezei în timpul dezvoltării embrionare a mamiferelor se realizează prin migrarea și introducerea într-un micromediu nou a celulelor stem hematopoietice pluripotente - din sacul vitelin până la ficat, splină și măduvă osoasă. Întrucât în stadiile incipiente ale dezvoltării embrionare țesutul hematopoietic conține un număr mare de celule stem, care scade pe măsură ce fătul se maturizează, cel mai promițător pentru obținerea celulelor stem hematopoietice este considerat a fi țesutul hematopoietic al ficatului embrionar, izolat din material avortat la 5-8 săptămâni de gestație.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Întrebări despre originea celulelor stem hematopoietice

Nu există nicio îndoială că formarea embrionară a eritrocitelor își are originea în insulele sanguine ale sacului vitelin. Cu toate acestea, potențialul de diferențiere in vitro al celulelor hematopoietice din sacul vitelin este foarte limitat (acestea se diferențiază în principal în eritrocite). Trebuie menționat că transplantul de celule stem hematopoietice din sacul vitelin nu este capabil să restabilească hematopoieza pentru o perioadă lungă de timp. S-a dovedit că aceste celule nu sunt precursorii HSC-urilor adulte. HSC-urile adevărate apar mai devreme, în săptămâna 3-5 de dezvoltare intrauterină, în zona de formare a țesutului stomacal și a endoteliului vaselor de sânge (splanchnopleura paraaortică, P-SP), precum și în locul aortei, gonadelor și rinichilor primari - în mezonefros sau așa-numita regiune AGM. S-a demonstrat că celulele din regiunea AGM sunt o sursă nu numai de HSC-uri, ci și de celule endoteliale ale vaselor de sânge, precum și de osteoclaste implicate în procesele de formare a țesutului osos. În săptămâna a 6-a de gestație, celulele progenitoare hematopoietice timpurii din regiunea AGM se deplasează în ficat, care rămâne principalul organ hematopoietic al fătului până la naștere.

Întrucât acest punct este extrem de important din punctul de vedere al transplantului celular, problema originii celulelor stem hematopoietice (HSC) în procesul de embriogeneză umană merită o prezentare mai detaliată. Ideile clasice conform cărora celulele stem hematopoietice ale mamiferelor și păsărilor provin dintr-o sursă extraembrionară se bazează pe studiile lui Metcalf și Moore, care au fost primii care au utilizat metode de clonare a HSC-urilor și a descendenților acestora izolați din sacul vitelin. Rezultatele muncii lor au servit drept bază pentru teoria migrației, conform căreia HSC-urile, apărând pentru prima dată în sacul vitelin, populează secvențial organele hematopoietice tranzitorii și definitive pe măsură ce se formează micromediul corespunzător în ele. Așa s-a stabilit punctul de vedere conform căruia generarea HSC-urilor, localizate inițial în sacul vitelin, servește drept bază celulară pentru hematopoieza definitivă.

Celulele progenitoare hematopoietice din sacul vitelin aparțin categoriei celor mai timpurii celule progenitoare hematopoietice. Fenotipul lor este descris de formula AA4.1+CD34+c-kit+. Spre deosebire de HSC-urile mature din măduva osoasă, acestea nu exprimă antigene Sca-1 și molecule MHC. Se pare că apariția antigenelor marker pe membranele de suprafață ale HSC-urilor din sacul vitelin în timpul cultivării corespunde diferențierii lor în timpul dezvoltării embrionare, cu formarea unor linii hematopoietice dedicate: nivelul expresiei antigenelor CD34 și Thy-1 scade, expresia CD38 și CD45RA crește și apar molecule HLA-DR. Odată cu specializarea ulterioară in vitro indusă de citokine și factori de creștere, începe exprimarea antigenelor specifice celulelor progenitoare hematopoietice ale unei anumite linii celulare. Cu toate acestea, rezultatele studiului hematopoiezei embrionare la reprezentanții a trei clase de vertebrate (amfibieni, păsări și mamifere) și, în special, analiza originii HSC-urilor responsabile de hematopoieza definitivă în ontogeneza postnatală, contrazic conceptele clasice. S-a stabilit că la reprezentanții tuturor claselor luate în considerare, în timpul embriogenezei se formează două regiuni independente în care apar HSC-urile. Regiunea extraembrionară „clasică” este reprezentată de sacul vitelin sau analogii săi, în timp ce zona intraembrionară recent identificată de localizare a HSC-urilor include mezenchimul paraaortic și regiunea AGM. Astăzi, se poate argumenta că la amfibieni și păsări, HSC-urile definitive provin din surse intraembrionare, în timp ce la mamifere și oameni, participarea HSC-urilor din sacul vitelin la hematopoieza definitivă nu poate fi încă complet exclusă.

Hematopoieza embrionară în sacul vitelin este, de fapt, eritropoieza primară, care se caracterizează prin conservarea nucleului în toate etapele de maturare a eritrocitelor și sinteza hemoglobinei de tip fetal. Conform celor mai recente date, valul de eritropoieză primară se termină în sacul vitelin în a 8-a zi de dezvoltare embrionară. Este urmat de o perioadă de acumulare a celulelor progenitoare eritroide definitive - BFU-E, care se formează exclusiv în sacul vitelin și apar pentru prima dată în a 9-a zi de gestație. În următoarea etapă a embriogenezei, celulele progenitoare eritroide definitive - CFU-E, precum și (!) mastocitele și CFU-GM sunt deja formate. Aceasta este baza punctului de vedere conform căruia celulele progenitoare definitive apar în sacul vitelin, migrează odată cu fluxul sanguin, se stabilesc în ficat și inițiază rapid prima fază a hematopoiezei intraembrionare. Conform acestor concepte, sacul vitelin poate fi considerat, pe de o parte, locul eritropoiezei primare, iar pe de altă parte, prima sursă de celule progenitoare hematopoietice definitive în dezvoltarea embrionară.

S-a demonstrat că celulele formatoare de colonii cu potențial proliferativ ridicat pot fi izolate din sacul vitelin încă din a 8-a zi de gestație, adică cu mult înainte de închiderea sistemului vascular al embrionului și a sacului vitelin. Mai mult, celulele cu potențial proliferativ ridicat obținute din sacul vitelin in vitro formează colonii a căror dimensiune și compoziție celulară nu diferă de parametrii corespunzători creșterii culturale a celulelor stem din măduva osoasă. În același timp, la retransplantarea celulelor formatoare de colonii din sacul vitelin cu potențial proliferativ ridicat, se formează semnificativ mai multe celule fiice formatoare de colonii și celule progenitoare multipotente decât atunci când se utilizează celule progenitoare din măduva osoasă ale hematopoiezei.

O concluzie finală privind rolul celulelor stem hematopoietice din sacul vitelin în hematopoieza definitivă ar putea fi oferită de rezultatele lucrării în care autorii au obținut o linie de celule endoteliale din sacul vitelin (G166), care a susținut eficient proliferarea celulelor sale cu caracteristicile fenotipice și funcționale ale HSC-urilor (AA4.1+WGA+, densitate scăzută și proprietăți adezive slabe). Conținutul acestora din urmă a crescut de peste 100 de ori atunci când au fost cultivate pe un strat hedgehog de celule C166 timp de 8 zile. Macrofage, granulocite, megacariocite, celule blastice și monocite, precum și celule precursoare ale limfocitelor B și T au fost identificate în colonii mixte crescute pe un substrat de celule C166. Celulele din sacul vitelin care cresc pe un substrat de celule endoteliale au avut capacitatea de autoreproducere și au rezistat până la trei pasaje în experimentele autorilor. Restaurarea hematopoiezei cu ajutorul lor la șoarecii maturi cu imunodeficiență combinată severă (SCID) a fost însoțită de formarea tuturor tipurilor de leucocite, precum și a limfocitelor T și B. Cu toate acestea, autorii în studiile lor au utilizat celule din sacul vitelin de la un embrion de 10 zile, în care sistemele vasculare extra- și intraembrionare sunt deja închise, ceea ce nu ne permite să excludem prezența HSC-urilor intraembrionare printre celulele din sacul vitelin.

În același timp, analiza potențialului de diferențiere a celulelor hematopoietice din stadii incipiente de dezvoltare, izolate înainte de unificarea sistemelor vasculare ale sacului vitelin și embrionului (8-8,5 zile de gestație), a relevat prezența precursorilor celulelor T și B în sacul vitelin, dar nu și în corpul embrionului. În sistemul in vitro, prin metoda cultivării în două etape pe un monostrat de celule epiteliale și subepiteliale ale timusului, celulele mononucleare ale sacului vitelin s-au diferențiat în limfocite pre-T și limfocite T mature. În aceleași condiții de cultivare, dar pe un monostrat de celule stromale ale ficatului și măduvei osoase, celulele mononucleare ale sacului vitelin s-au diferențiat în limfocite pre-B și limfocite IglVT-B mature.

Rezultatele acestor studii indică posibilitatea dezvoltării celulelor sistemului imunitar din țesutul extraembrionar al sacului vitelin, iar formarea liniilor primare de celule T și B depinde de factorii micromediului stromal al organelor hematopoietice embrionare.

Alți autori au arătat, de asemenea, că sacul vitelin conține celule cu potențial de diferențiere limfoidă, iar limfocitele rezultate nu diferă în ceea ce privește caracteristicile antigenice de cele ale animalelor mature sexual. S-a stabilit că celulele din sacul vitelin al unui embrion de 8-9 zile sunt capabile să restabilească limfopoieza în timusul atimocitar odată cu apariția limfocitelor mature CD3+CD4+- și CD3+CD8+- care posedă un repertoriu format de receptori ai celulelor T. Astfel, timusul poate fi populat de celule de origine extraembrionară, dar este imposibil de exclus migrarea probabilă a celulelor precursoare timpurii ale limfocitelor T din surse intraembrionare de limfopoieză în timus.

În același timp, transplantul de celule hematopoietice din sacul vitelin la receptori adulți iradiați nu are întotdeauna ca rezultat o repopulare pe termen lung a zonelor de localizare a țesutului hematopoietic epuizat, iar celulele sacului vitelin in vitro formează semnificativ mai puține colonii splenice decât celulele din regiunea AGM. În unele cazuri, utilizând celule din sacul vitelin de la un embrion de 9 zile, este încă posibil să se realizeze o repopulare pe termen lung (până la 6 luni) a țesutului hematopoietic la receptorii iradiați. Autorii consideră că celulele sacului vitelin cu fenotipul CD34+c-kit+ nu numai că nu diferă de cele din regiunea AGM în ceea ce privește capacitatea lor de a repopula organele hematopoietice epuizate, dar și restabilesc hematopoieza mai eficient, deoarece sacul vitelin conține de aproape 37 de ori mai multe.

Trebuie menționat că experimentele au utilizat celule hematopoietice din sacul vitelin cu antigene marker ale celulelor stem hematopoietice (c-kit+ și/sau CD34+ și CD38+), care au fost injectate direct în ficat sau în vena abdominală a descendenților șoarecilor femele care au primit o injecție cu busulfan în a 18-a zi de sarcină. La astfel de animale nou-născute, propria mielopoieză a fost puternic suprimată din cauza eliminării celulelor stem hematopoietice cauzate de busulfan. După transplantul de celule stem hematopoietice din sacul vitelin, elemente formate care conțin markerul donator - glicerofosfat dehidrogenază - au fost detectate în sângele periferic al receptorilor timp de 11 luni. S-a constatat că HSC-urile din sacul vitelin restabilesc conținutul de celule limfoide, mieloide și eritroide din sânge, timus, splină și măduvă osoasă, iar nivelul de himerism a fost mai mare în cazul administrării intrahepatice decât intravenoase a celulelor din sacul vitelin. Autorii consideră că celulele hematopoietice hematopoietice (HSC) din sacul vitelin al embrionilor aflați în stadiu incipient (până la 10 zile) necesită o interacțiune preliminară cu micromediul hematopoietic al ficatului pentru a popula cu succes organele hematopoietice ale receptorilor adulți. Este posibil să existe o etapă unică de dezvoltare în embriogeneză, când celulele din sacul vitelin, migrând inițial către ficat, dobândesc apoi capacitatea de a popula stroma organelor hematopoietice ale receptorilor maturi.

În acest sens, trebuie menționat că himerismul celulelor sistemului imunitar este destul de des observat după transplantul de celule ale măduvei osoase la receptori maturi iradiați - în sângele acestora din urmă, celulele cu fenotipul donatorului se găsesc în cantități destul de mari printre limfocitele B, T și granulocitele receptorului, ceea ce continuă timp de cel puțin 6 luni.

Celulele hematopoietice la mamifere sunt detectate pentru prima dată prin metode morfologice în a 7-a zi de dezvoltare embrionară și sunt reprezentate de insule hematopoietice din interiorul vaselor sacului vitelin. Cu toate acestea, diferențierea hematopoietică naturală în sacul vitelin este limitată la eritrocitele primare care rețin nucleii și sintetizează hemoglobina fetală. Cu toate acestea, în mod tradițional se credea că sacul vitelin servește drept singura sursă de celule stem hematopoietice (HSC) care migrează către organele hematopoietice ale embrionului în curs de dezvoltare și asigură hematopoieza definitivă la animalele adulte, deoarece apariția HSC-urilor în corpul embrionului coincide cu închiderea sistemelor vasculare ale sacului vitelin și ale embrionului. Acest punct de vedere este susținut de datele conform cărora celulele sacului vitelin, atunci când sunt clonate in vitro, dau naștere la granulocite și macrofage, iar in vivo - la colonii splenice. Apoi, în cursul experimentelor de transplant, s-a stabilit că celulele hematopoietice ale sacului vitelin, care în sacul vitelin în sine sunt capabile să se diferențieze doar în eritrocite primare, în micromediul ficatului șoarecilor SCID nou-născuți și adulți, timusul epuizat sau stromalul hrănitor dobândesc capacitatea de a repopula organele hematopoietice cu restaurarea tuturor liniilor hematopoietice chiar și la animalele receptoare adulte. În principiu, acest lucru ne permite să le clasificăm drept HSC-uri adevărate - ca celule care funcționează în perioada postnatală. Se presupune că sacul vitelin, împreună cu regiunea AGM, servește drept sursă de HSC-uri pentru hematopoieza definitivă la mamifere, dar contribuția lor la dezvoltarea sistemului hematopoietic este încă neclară. Semnificația biologică a existenței a două organe hematopoietice cu funcții similare în embriogeneza timpurie a mamiferelor este, de asemenea, neclară.

Căutarea răspunsurilor la aceste întrebări continuă. In vivo, a fost posibil să se dovedească prezența în sacul vitelin al embrionilor cu vârsta de 8-8,5 zile a unor celule care restabilesc limfopoieza la șoareci SCID iradiați subletal cu un deficit pronunțat de limfocite T și B. Celulele hematopoietice din sacul vitelin au fost injectate atât intraperitoneal, cât și direct în splină și țesutul hepatic. După 16 săptămâni, la receptori au fost detectate limfocite T CD4+ și CD8+ TCR/CD34 și limfocite B IgM+ B-220+ marcate cu antrogene MHC donatoare. În același timp, autorii nu au găsit celule stem capabile de o astfel de restaurare a sistemului imunitar în corpul embrionilor cu vârsta de 8-8,5 zile.

Celulele hematopoietice din sacul vitelin au un potențial proliferativ ridicat și sunt capabile de autoreproducere prelungită in vitro. Unii autori identifică aceste celule ca HSC-uri pe baza generării prelungite (aproape 7 luni) de celule progenitoare eritroide, care diferă de progenitorii măduvei osoase din linia eritroidă printr-o perioadă de pasaj mai lungă, dimensiuni mai mari ale coloniilor, sensibilitate crescută la factorii de creștere și proliferare mai lungă. În plus, în condiții adecvate de cultivare a celulelor din sacul vitelin in vitro, se formează și celule progenitoare limfoide.

Datele prezentate ne permit, în general, să considerăm sacul vitelin ca o sursă de HSC-uri, mai puțin angajate și, prin urmare, posedând un potențial proliferativ mai mare decât celulele stem din măduva osoasă. Cu toate acestea, în ciuda faptului că sacul vitelin conține celule progenitoare hematopoietice pluripotente care mențin diverse linii de diferențiere hematopoietică in vitro pentru o perioadă lungă de timp, singurul criteriu pentru caracterul complet al HSC-urilor este capacitatea lor de a repopula pe termen lung organele hematopoietice ale receptorului, ale cărui celule hematopoietice sunt distruse sau defecte genetic. Astfel, întrebarea cheie este dacă celulele hematopoietice pluripotente ale sacului vitelin pot migra și popula organele hematopoietice și dacă este recomandabil să se revizuiască lucrările cunoscute care demonstrează capacitatea lor de a repopula organele hematopoietice ale animalelor mature cu formarea principalelor linii hematopoietice. Surse intraembrionare de celule stem germinale (CSM) definitive au fost identificate în embrionii de păsări încă din anii 1970, ceea ce punea deja la îndoială ideile consacrate despre originea extraembrionară a CSM, inclusiv la reprezentanții altor clase de vertebrate. În ultimii ani, au apărut publicații despre prezența unor zone intraembrionare similare care conțin CSM la mamifere și oameni.

Trebuie menționat încă o dată că cunoștințele fundamentale în acest domeniu sunt extrem de importante pentru transplantul celular practic, deoarece vor ajuta nu numai la determinarea sursei preferate de HSC-uri, ci și la stabilirea caracteristicilor interacțiunii celulelor hematopoietice primare cu un organism genetic străin. Se știe că introducerea celulelor stem hematopoietice din ficat fetal uman într-un embrion de oaie în stadiul de organogeneză duce la nașterea unor animale himere, în sângele și măduva osoasă ale cărora 3 până la 5% din celulele hematopoietice umane sunt determinate stabil. În același timp, HSC-urile umane nu își modifică cariotipul, menținând o rată ridicată de proliferare și capacitatea de diferențiere. În plus, HSC-urile xenogene transplantate nu intră în conflict cu sistemul imunitar și fagocitele organismului gazdă și nu se transformă în celule tumorale, ceea ce a stat la baza dezvoltării intensive a metodelor de corectare intrauterină a patologiei genetice ereditare folosind HSC-uri sau ESC-uri transfectate cu gene deficitare.

Dar în ce etapă a embriogenezei este mai potrivit să se efectueze o astfel de corecție? Pentru prima dată, celulele determinate pentru hematopoieză apar la mamifere imediat după implantare (ziua a 6-a de gestație), când semnele morfologice ale diferențierii hematopoietice și presupusele organe hematopoietice sunt încă absente. În această etapă, celulele dispersate ale embrionului de șoarece sunt capabile să repopuleze organele hematopoietice ale receptorilor iradiați cu formarea de eritrocite și limfocite care diferă de celulele gazdă prin tipul de hemoglobină sau respectiv izomerază glicerofosfat, precum și un marker cromozomial suplimentar (Tb) al celulelor donatoare. La mamifere, ca și la păsări, simultan cu sacul vitelin, înainte de închiderea patului vascular comun, celulele hematopoietice apar direct în corpul embrionului în splanchnopleura paraaortică. Celulele hematopoietice cu fenotipul AA4.1+ au fost izolate din regiunea AGM și caracterizate ca celule hematopoietice multipotente care formează limfocite T și B, granulocite, megacariocite și macrofage. Fenotipic, aceste celule progenitoare multipotente sunt foarte apropiate de HSC-urile din măduva osoasă a animalelor adulte (CD34+c-kit+). Numărul de celule AA4.1+ multipotente dintre toate celulele regiunii AGM este mic - acestea reprezintă nu mai mult de 1/12 din componenta sa.

În embrionul uman a fost identificată și o regiune intraembrionară care conține HSC-uri omoloage cu regiunea AGM la animale. Mai mult, la om, peste 80% din celulele multipotente cu potențial proliferativ ridicat sunt conținute în corpul embrionului, deși astfel de celule sunt prezente și în sacul vitelin. O analiză detaliată a localizării lor a arătat că sute de astfel de celule sunt colectate în grupuri compacte, situate în imediata apropiere a endoteliului peretelui ventral al aortei dorsale. Fenotipic, acestea sunt celule CD34+CD45+Lin. Dimpotrivă, în sacul vitelin, precum și în alte organe hematopoietice ale embrionului (ficat, măduvă osoasă), astfel de celule sunt singulare.

În consecință, în embrionul uman, regiunea AGM conține grupuri de celule hematopoietice strâns asociate cu endoteliul ventral al aortei dorsale. Acest contact este urmărit și la nivel imunochimic - atât celulele grupurilor hematopoietice, cât și celulele endoteliale exprimă factorul de creștere endotelial vascular, ligandul Flt-3, receptorii acestora FLK-1 și STK-1, precum și factorul de transcripție al celulelor stem leucemice. În regiunea AGM, derivații mezenchimali sunt reprezentați de un lanț dens de celule rotunjite situate de-a lungul întregii aorte dorsale și care exprimă tenascina C - o glicoproteină a substanței fundamentale implicată activ în procesele de interacțiune și migrație intercelulară.

Celulele stem multipotente din regiunea AGM, după transplant, restabilesc rapid hematopoieza la șoarecii maturi iradiați și asigură hematopoieza eficientă pentru o perioadă lungă de timp (până la 8 luni). Autorii nu au găsit celule cu astfel de proprietăți în sacul vitelin. Rezultatele acestui studiu sunt confirmate de datele unei alte lucrări, care a arătat că la embrionii aflați în stadii incipiente de dezvoltare (10,5 zile), regiunea AGM este singura sursă de celule care corespund definiției HSC, restabilind hematopoieza mieloidă și limfoidă la receptorii maturi iradiați.

Linia stromală AGM-S3 a fost izolată din regiunea AGM, ale cărei celule susțin generarea de celule progenitoare dedicate CFU-GM, BFU-E, CFU-E și unități formatoare de colonii de tip mixt în cultură. Conținutul acestora din urmă în timpul cultivării pe un substrat hrănitor de celule din linia AGM-S3 crește de 10 până la 80 de ori. Astfel, micromediul regiunii AGM conține celule de bază stromale care susțin eficient hematopoieza, astfel încât regiunea AGM în sine poate acționa ca un organ hematopoietic embrionar - o sursă de HSC-uri definitive, adică HSC-uri care formează țesutul hematopoietic al unui animal adult.

Imunofenotiparea extinsă a compoziției celulare a regiunii AGM a arătat că aceasta conține nu numai celule hematopoietice multipotente, ci și celule dedicate diferențierii mieloide și limfoide (limfocite T și B). Cu toate acestea, analiza moleculară a celulelor CD34+c-kit+ individuale din regiunea AGM utilizând reacția în lanț a polimerazei a relevat activarea doar a genelor beta-globinei și mieloperoxidazei, dar nu și a genelor limfoide care codifică sinteza CD34, Thy-1 și 15. Activarea parțială a genelor specifice liniei celulare este caracteristică etapelor ontogenetice timpurii ale generării de HSC-uri și celule progenitoare. Având în vedere că numărul de celule progenitoare dedicate din regiunea AGM a unui embrion de 10 zile este cu 2-3 ordine de mărime mai mic decât în ficat, se poate argumenta că în a 10-a zi de embriogeneză, hematopoieza în regiunea AGM abia începe, în timp ce în principalul organ hematopoietic al fătului în această perioadă, liniile hematopoietice s-au dezvoltat deja.

Într-adevăr, spre deosebire de celulele stem hematopoietice anterioare (9-11 zile) din sacul vitelin și regiunea AGM, care repopulează micromediul hematopoietic al nou-născutului, dar nu și al organismului adult, celulele progenitoare hematopoietice ale ficatului embrionar de 12-17 zile nu mai necesită un micromediu postnatal precoce și populează organele hematopoietice ale unui animal adult la fel ca un nou-născut. După transplantul de HSC-uri hepatice embrionare, hematopoieza la șoarecii adulți receptori iradiați a avut un caracter policlonal. În plus, utilizând colonii marcate, s-a demonstrat că funcționarea clonelor grefate este complet supusă succesiunii clonale relevate în măduva osoasă adultă. În consecință, HSC-urile hepatice embrionare, marcate în cele mai blânde condiții, fără prestimulare cu citokine exogene, posedă deja principalele atribute ale HSC-urilor adulte: nu necesită un micromediu postembrionar timpuriu, intră într-o stare de repaus profund după transplant și sunt mobilizate în formare clonală secvențial, în conformitate cu modelul de succesiune clonală.

Evident, este necesar să ne oprim asupra fenomenului succesiunii clonale mai detaliat. Eritropoeza este realizată de celulele stem hematopoietice care au un potențial proliferativ ridicat și capacitatea de a se diferenția în toate liniile de celule precursoare dedicate ale celulelor sanguine. La intensitate normală a hematopoiezei, majoritatea celulelor stem hematopoietice se află într-o stare latentă și sunt mobilizate pentru proliferare și diferențiere, formând secvențial clone care se înlocuiesc reciproc. Acest proces se numește succesiune clonală. Dovezi experimentale ale succesiunii clonale în sistemul hematopoietic au fost obținute în studii cu HSC-uri marcate prin transfer genetic retroviral. La animalele adulte, hematopoieza este menținută de numeroase clone hematopoietice funcționale simultan, derivate ale HSC-urilor. Pe baza fenomenului succesiunii clonale, a fost dezvoltată o abordare de repopulare pentru identificarea HSC-urilor. Conform acestui principiu, se face o distincție între celulele stem hematopoietice pe termen lung (LT-HSC), care sunt capabile să restabilească sistemul hematopoietic pe tot parcursul vieții, și HSC pe termen scurt, care îndeplinesc această funcție pentru o perioadă limitată de timp.

Dacă luăm în considerare celulele stem hematopoietice din punctul de vedere al abordării repopulării, atunci particularitatea celulelor hematopoietice ale ficatului embrionar constă în capacitatea lor de a crea colonii semnificativ mai mari decât cele din creșterea HSC-urilor din sângele cordonului ombilical sau din măduva osoasă, iar acest lucru se aplică tuturor tipurilor de colonii. Acest fapt în sine indică un potențial proliferativ mai mare al celulelor hematopoietice ale ficatului embrionar. O proprietate unică a celulelor progenitoare hematopoietice ale ficatului embrionar este un ciclu celular mai scurt în comparație cu alte surse, ceea ce este de mare importanță din punctul de vedere al eficacității repopulării organelor hematopoietice în timpul transplantului. Analiza compoziției celulare a suspensiei hematopoietice obținute din surse ale unui organism matur indică faptul că, în toate etapele ontogenezei, celulele nucleare sunt reprezentate predominant de celule diferențiate final, al căror număr și fenotip depind de vârsta ontogenetică a donatorului de țesut hematopoietic. În special, suspensiile de celule mononucleare din măduva osoasă și sângele din cordonul ombilical constau din peste 50% celule mature din seria limfoidă, în timp ce țesutul hematopoietic al ficatului embrionar conține mai puțin de 10% limfocite. În plus, celulele liniei mieloide din ficatul embrionar și fetal sunt reprezentate în principal de seria eritroidă, în timp ce în sângele din cordonul ombilical și măduva osoasă predomină elementele granulocitare-macrofage.

De asemenea, este important ca ficatul embrionar să conțină un set complet de precursori hematopoietici timpurii. Printre aceștia din urmă, trebuie remarcați celulele eritroide, granulopoietice, megacariopoietice și celulele formatoare de colonii multiliniare. Precursorii lor mai primitivi - LTC-IC - sunt capabili să prolifereze și să se diferențieze in vitro timp de 5 săptămâni sau mai mult și, de asemenea, își păstrează activitatea funcțională după grefarea în corpul receptorului în timpul transplantului alogen și chiar xenogen la animale imunodeficiente.

Importanța biologică a predominanței celulelor eritroide în ficatul embrionar (până la 90% din numărul total de elemente hematopoietice) se datorează necesității de a asigura volumul sanguin în creștere rapidă al fătului în curs de dezvoltare cu masă eritrocitară. În ficatul embrionar, eritropoieza este reprezentată de precursori eritroidieni nucleari cu diferite grade de maturitate, care conțin hemoglobină fetală (a2u7), care, datorită afinității sale mai mari pentru oxigen, asigură absorbția eficientă a acestuia din urmă din sângele matern. Intensificarea eritropoiezei în ficatul embrionar este asociată cu o creștere locală a sintezei eritropoietinei (EPO). Este de remarcat faptul că prezența eritropoietinei în sine este suficientă pentru realizarea potențialului hematopoietic al celulelor hematopoietice din ficatul embrionar, în timp ce o combinație de citokine și factori de creștere constând din EPO, SCF, GM-CSF și IL-3 este necesară pentru angajarea HSC-urilor din măduva osoasă și sângele cordonului ombilical în eritropoieză. În același timp, celulele progenitoare hematopoietice timpurii izolate din ficatul embrionar, care nu au receptori pentru EPO, nu răspund la eritropoetina exogenă. Pentru inducerea eritropoiezei într-o suspensie de celule mononucleare ale ficatului embrionar, este necesară prezența unor celule mai avansate sensibile la eritropoetină cu fenotipul CD34+CD38+, care exprimă receptorul EPO.

În literatura de specialitate, încă nu există un consens cu privire la dezvoltarea hematopoiezei în perioada embrionară. Semnificația funcțională a existenței surselor extra- și intraembrionare de celule progenitoare hematopoietice nu a fost stabilită. Cu toate acestea, nu există nicio îndoială că în embriogeneza umană, ficatul este organul central al hematopoiezei și în săptămânile a 6-a până la a 12-a de gestație servește drept principală sursă de celule stem hematopoietice care populează splina, timusul și măduva osoasă. Ficatul (GDR) asigură îndeplinirea funcțiilor corespunzătoare în perioadele pre- și postnatale de dezvoltare.

Trebuie menționat încă o dată că ficatul embrionar, comparativ cu alte surse, este caracterizat de cel mai mare conținut de HSC-uri. Aproximativ 30% din celulele CD344 ale ficatului embrionar au fenotipul CD38. În același timp, numărul de celule progenitoare limfoide (CD45+) în stadiile incipiente ale hematopoiezei în ficat nu depășește 4%. S-a stabilit că, pe măsură ce fătul se dezvoltă, de la 7 la 17 săptămâni de gestație, numărul de limfocite B crește progresiv cu un „treaptă” lunară de 1,1%, în timp ce nivelul HSC-urilor scade permanent.

Activitatea funcțională a celulelor stem hematopoietice depinde și de perioada de dezvoltare embrionară a sursei lor. Studiul activității de formare a coloniilor celulelor hepatice ale embrionilor umani la 6-8 și 9-12 săptămâni de gestație în timpul cultivării într-un mediu semilichid în prezența SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 și EPO a arătat că numărul total de colonii este de 1,5 ori mai mare la însămânțarea HSC-urilor din ficat embrionar în stadii incipiente de dezvoltare. În același timp, numărul de celule progenitoare de mielopoieză, cum ar fi CFU-GEMM, din ficat la 6-8 săptămâni de embriogeneză, este de peste trei ori mai mare decât numărul lor la 9-12 săptămâni de gestație. În general, activitatea de formare a coloniilor celulelor hepatice hematopoietice ale embrionilor în primul trimestru de gestație a fost semnificativ mai mare decât cea a celulelor hepatice fetale în al doilea trimestru de sarcină.

Datele de mai sus indică faptul că ficatul embrionar la începutul embriogenezei se distinge nu numai printr-un conținut crescut de celule progenitoare hematopoietice timpurii, ci și printr-un spectru mai larg de diferențiere în diverse linii celulare. Aceste caracteristici ale activității funcționale a celulelor stem hematopoietice ale ficatului embrionar pot avea o anumită semnificație clinică, deoarece caracteristicile lor calitative ne permit să ne așteptăm la un efect terapeutic pronunțat la transplantul chiar și a unui număr mic de celule obținute în stadii incipiente ale gestației.

Cu toate acestea, problema cantității de celule stem hematopoietice necesare pentru un transplant eficient rămâne deschisă și relevantă. Se fac încercări de a o rezolva utilizând potențialul ridicat de autoreproducere a celulelor hematopoietice ale ficatului embrionar in vitro atunci când sunt stimulate de citokine și factori de creștere. Prin perfuzarea constantă a HSC-urilor hepatice embrionare timpurii într-un bioreactor, după 2-3 zile, este posibil să se obțină o cantitate de celule stem hematopoietice la o producție de 15 ori mai mare decât nivelul lor inițial. Pentru comparație, trebuie menționat că sunt necesare cel puțin două săptămâni pentru a obține o creștere de 20 de ori a producției de HSC-uri din sângele cordonului ombilical uman în aceleași condiții.

Astfel, ficatul embrionar diferă de alte surse de celule stem hematopoietice printr-un conținut mai mare atât de celule progenitoare hematopoietice dedicate, cât și de celule progenitoare hematopoietice timpurii. În cultura cu factori de creștere, celulele hepatice embrionare cu fenotipul CD34+CD45Ra1 CD71l0W formează de 30 de ori mai multe colonii decât celulele similare din sângele cordonului ombilical și de 90 de ori mai multe decât HSC-urile din măduva osoasă. Cele mai pronunțate diferențe în sursele specificate constau în conținutul de celule progenitoare hematopoietice timpurii care formează colonii mixte - cantitatea de CFU-GEMM din ficatul embrionar depășește cea din sângele cordonului ombilical și măduva osoasă de 60, respectiv 250 de ori.

De asemenea, este important ca până în săptămâna a 18-a de dezvoltare embrionară (perioada de debut a hematopoiezei în măduva osoasă), peste 60% din celulele hepatice să fie implicate în implementarea funcției hematopoietice. Deoarece fătul uman nu are timus și, în consecință, timocite până în săptămâna a 13-a de dezvoltare, transplantul de celule hematopoietice din ficat embrionar de 6-12 săptămâni de gestație reduce semnificativ riscul de a dezvolta o reacție „grefă contra gazdă” și nu necesită selectarea unui donator histocompatibil, deoarece facilitează relativ realizarea himerismului hematopoietic.