Celule stem mezenchimale

Printre celulele stem regionale, un loc special îl ocupă celulele stem mezenchimale (MSC), ale căror derivate constituie matricea stromală a tuturor organelor și țesuturilor corpului uman. Prioritatea în cercetarea MSC aparține reprezentanților științei biologice ruse.

La mijlocul secolului trecut, o cultură omogenă de celule stem stromale multipotente din măduva osoasă a fost izolată pentru prima dată în laboratorul lui A. Friedenstein. Celulele stem mezenchimale atașate la substrat au menținut o intensitate de proliferare ridicată pentru o lungă perioadă de timp, iar în culturi cu o densitate de însămânțare scăzută, după fixarea pe substrat, au format clone de celule asemănătoare fibroblastelor care nu au avut activitate fagocitară. Încetarea proliferării MSC s-a încheiat cu diferențierea lor spontană in vitro în celule osoase, adipose, cartilaj, musculare sau țesut conjunctiv. Studii ulterioare au făcut posibilă stabilirea potențialului osteogenic al celulelor asemănătoare fibroblastelor din stroma măduvei osoase a diferitelor specii de mamifere, precum și a activității lor de formare a coloniilor. Experimentele in vivo au arătat că atât transplantul hetero-, cât și cel ortotopic de celule asemănătoare fibroblastelor formatoare de colonii are ca rezultat formarea de țesut osos, cartilaj, fibros și adipos. Deoarece celulele stem stromale din măduva osoasă sunt caracterizate printr-o capacitate ridicată de autoreînnoire și diferențiere multifațetată în cadrul unei singure linii celulare, acestea sunt numite celule progenitoare mezenchimale multipotente.

Trebuie menționat că, în peste 45 de ani de cercetare fundamentală asupra celulelor stem mezenchimale, s-au creat condiții reale pentru utilizarea derivaților acestora în practica clinică.

Astăzi nu există nicio îndoială că toate țesuturile corpului uman sunt formate din celule stem din diverse linii celulare, ca urmare a proceselor de proliferare, migrare, diferențiere și maturare. Cu toate acestea, până de curând se credea că celulele stem dintr-un organism adult sunt specifice țesuturilor, adică capabile să producă linii de celule specializate doar din acele țesuturi în care se află. Această poziție conceptuală a fost infirmată de faptele transformării celulelor stem hematopoietice nu numai în elemente celulare ale sângelui periferic, ci și în celule ovale ale ficatului. În plus, celulele stem neuronale s-au dovedit a fi capabile să dea naștere atât neuronilor, cât și elementelor gliale, precum și liniilor timpurii de celule progenitoare hematopoietice. La rândul lor, celulele stem mezenchimale, care produc de obicei elemente celulare ale osului, cartilajului și țesutului adipos, sunt capabile să se transforme în celule stem neuronale. Se presupune că, în procesul de creștere, regenerare fiziologică și reparatorie a țesuturilor, celulele progenitoare neangajate sunt generate din rezervele stem nespecifice țesuturilor. De exemplu, repararea țesutului muscular poate fi realizată datorită migrării celulelor stem mezenchimale din măduva osoasă la mușchii scheletici.

Deși o astfel de interschimbabilitate încrucișată a celulelor stem nu este recunoscută de toți cercetătorii, posibilitatea utilizării clinice a celulelor stem mezenchimale ca sursă pentru transplantul celular și vector celular al informațiilor genetice nu mai este contestată de nimeni, la fel ca și multipotența celulelor stem stromale din măduva osoasă, care pot fi relativ ușor izolate și extinse în cultură in vitro. În același timp, în literatura științifică continuă să apară rapoarte despre potențiala pluripotență a celulelor stem stromale din măduva osoasă. Ca dovadă, sunt citate protocoale de cercetare în care, sub influența unor inductori specifici de transdiferențiere, MSC-urile sunt transformate în celule nervoase, cardiomiocite și hepatocite. Cu toate acestea, unii oameni de știință au îndoieli serioase cu privire la posibilitatea activării și exprimării repetate a genelor din perioada embriogenezei timpurii. În același timp, toată lumea înțelege că, dacă se vor găsi condiții pentru extinderea multipotenței celulelor stem mezenchimale la pluripotența ESC-urilor, multe probleme etice, morale, religioase și juridice din medicina plastică regenerativă vor fi rezolvate automat. În plus, întrucât în acest caz sursa potențialului regenerativ al stemului devin celulele stromale autologe ale pacientului, problema respingerii imune a transplantului de celule este, de asemenea, rezolvată. Viitorul apropiat va arăta cât de realiste sunt aceste perspective.

[ 1 ], [ 2 ]

Utilizarea celulelor stem mezenchimale în medicină

În clinică, utilizarea derivatelor de celule stem mezenchimale este asociată în primul rând cu restaurarea defectelor tisulare care apar în cazul leziunilor termice cutanate extinse și profunde. În stadiul preclinic, a fost efectuată o evaluare experimentală a fezabilității utilizării celulelor stem mezenchimale alogene de tip fibroblast pentru tratarea arsurilor profunde. S-a demonstrat că celulele stem mezenchimale de tip fibroblast din măduva osoasă formează un monostrat în cultură, ceea ce face posibilă transplantarea lor pentru a optimiza procesele de regenerare a plăgilor cauzate de arsuri profunde. Autorii notează că fibroblastele embrionare au o proprietate similară, dar utilizarea lor clinică este limitată de problemele etice și juridice existente. O arsură termică profundă cu deteriorarea tuturor straturilor pielii a fost modelată pe șobolani Wistar. Suprafața arsurii a fost de 18-20% din suprafața totală a pielii. Primul grup experimental a inclus șobolani cu arsură termică profundă și transplant de celule stem mezenchimale alogene de tip fibroblast. Al doilea grup a fost format din animale cu arsură termică profundă și transplant de fibroblaste embrionare alogene. Al treilea grup a fost reprezentat de șobolani de control cu arsură termică profundă care nu au fost supuși terapiei celulare. O suspensie de celule stem mezenchimale asemănătoare fibroblastelor și fibroblaste embrionare a fost aplicată pe suprafața plăgii arsurii folosind o pipetă într-o cantitate de 2 x 10⁴ ^.Celule în a 2-a zi după modelarea arsurii și excizia crustei necrotice rezultate. După transplantul de celule, suprafața arsurii a fost acoperită cu un șervețel de tifon umezit cu soluție izotonică de clorură de sodiu cu gentamicină. Celulele din măduva osoasă au fost colectate pentru a obține MSC-uri cu inducerea lor ulterioară într-o linie de celule stem mezenchimale asemănătoare fibroblastelor de la șobolani Wistar adulți din femur. Fibroblastele embrionare au fost obținute din plămânii embrionilor cu vârsta cuprinsă între 14 și 17 zile. Fibroblastele embrionare și celulele din măduva osoasă pentru obținerea MSC-urilor au fost cultivate preliminar în plăci Petri la o temperatură de 37°C într-un incubator cu CO2, într-o atmosferă cu 5% CO2 la o umiditate de 95%. Fibroblastele embrionare au fost cultivate timp de 4-6 zile, în timp ce formarea unui monostrat de MSC a necesitat între 14 și 17 zile. Ulterior, MSC-urile au fost crioconservate ca material sursă pentru celulele stem mezenchimale de tip fibroblast, care au fost obținute prin decongelare și cultivare a MSC-urilor timp de 4 zile. Numărul de celule stem mezenchimale de tip fibroblast formate a fost de peste 3 ori mai mare decât numărul de fibroblaste embrionare formate în aceeași perioadă de cultivare. Pentru a identifica celulele transplantate în plăgile de arsură în stadiul de cultivare, genomul acestora a fost marcat folosind un vector viral transfer bazat pe adenovirus recombinant de tip V care poartă gena 1ac-2 care codifică β-galactozidaza E. coli. Celulele vii la momente diferite după transplant au fost detectate imunohistochimic în criosecții cu adăugarea de substrat X-Gal, care dă o colorație albastru-verzuie caracteristică. Ca urmare a evaluării vizuale, planimetrice și histologice dinamice a stării plăgii de arsură, s-a stabilit că deja în a 3-a zi după transplantul de celule, apar diferențe semnificative în cursul procesului de plagă în grupurile selectate. Această diferență a devenit deosebit de distinctă în a 7-a zi după transplantul de celule. La animalele din primul grup, cărora li s-au transplantat celule stem mezenchimale asemănătoare fibroblastelor, rana a căpătat o culoare roz intensă uniformă, țesutul de granulație a crescut pe întreaga sa suprafață până la nivelul epidermei, iar suprafața arsurii a scăzut semnificativ în dimensiune. Filmul de colagen format pe suprafața plăgii a devenit oarecum mai subțire, dar a continuat să acopere întreaga zonă a arsurii. La animalele din al doilea grup, cărora li s-au transplantat fibroblaste embrionare, țesutul de granulație a crescut până la nivelul epidermei marginilor plăgii, dar numai pe alocuri, în timp ce plasmoreea din rană a fost mai intensă decât în primul grup, iar filmul de colagen format inițial a dispărut practic. La animalele care nu au primit terapie celulară, în a 7-a zi rana arsă era palidă, cu gropițe, cu țesut necrotic acoperit cu fibrină. Plasmorea a fost observată pe întreaga suprafață a arsurii. Histologic, animalele din primul și al doilea grup au prezentat o scădere a infiltrării celulare și a dezvoltării rețelei vasculare.Și aceste semne ale procesului regenerativ incipient au fost mai pronunțate la șobolanii din primul grup. În grupul de control, s-au observat semne de infiltrare celulară a plăgii, modelul histologic al vaselor nou formate a fost absent. În ziua 15-30 de observație, aria suprafeței arsurii la animalele din primul grup a fost semnificativ mai mică decât la șobolanii din celelalte grupuri, iar suprafața de granulație a fost mai dezvoltată. La animalele din al doilea grup, aria suprafeței arsurii a scăzut, de asemenea, în comparație cu dimensiunea plăgilor arsuri la șobolanii din grupul de control, ceea ce a apărut din cauza epitelizării marginale. În grupul de control, suprafața arsurii a rămas palidă pe alocuri cu granulații rare, au apărut asteriscuri vasculare pe ea, au existat insulițe de placă fibrinoasă, plasmoreea moderată a continuat pe întreaga suprafață a arsurii și a rămas o crustă dificil de separat în unele locuri. În general, la animalele din al treilea grup, dimensiunea plăgii a scăzut, dar marginile plăgii au rămas subminate.

Astfel, în timpul unui studiu comparativ al ratei de vindecare a rănilor utilizând celule stem mezenchimale de tip fibroblast și fibroblaste embrionare, precum și fără utilizarea terapiei celulare, s-a observat o accelerare a ratei de vindecare a suprafeței arsurii ca urmare a transplantului de celule stem mezenchimale de tip fibroblast și fibroblaste embrionare. Cu toate acestea, în cazul utilizării celulelor stem mezenchimale alogene de tip fibroblast, rata de vindecare a rănilor a fost mai mare decât în cazul transplantului de fibroblaste embrionare. Acest lucru s-a manifestat prin accelerarea schimbării fazelor procesului regenerativ - termenii de infiltrare celulară au fost reduși, rata de creștere a rețelei vasculare a crescut, precum și formarea țesutului de granulație.

Rezultatele planimetriei dinamice indică faptul că rata de vindecare spontană a plăgii arsuri (fără utilizarea terapiei celulare) a fost cea mai mică. În zilele 15 și 30 după transplantul de celule stem mezenchimale alogene de tip fibroblast, rata de vindecare a plăgilor a fost mai mare decât în cazul transplantului de fibroblaste embrionare. Metoda histochimică pentru detectarea beta-galactozidazei a arătat că, după transplantul de celule stem mezenchimale de tip fibroblast și fibroblaste embrionare, celulele transplantate rămân viabile la suprafața și în profunzimea plăgilor regenerative pe întreaga perioadă de observație. Autorii consideră că rata mai mare de regenerare a plăgilor arsuri cu utilizarea celulelor stem mezenchimale de tip fibroblast se datorează eliberării factorilor de stimulare a creșterii biologic activi de către aceste celule în timpul procesului de maturare.

Transplantul de keratinocite auto- sau alogene și fibroblaste alogene pentru tratamentul arsurilor a fost utilizat și în practica clinică. Trebuie menționat că tratamentul chirurgical al copiilor cu arsuri profunde extinse este o sarcină complexă din cauza naturii traumatice ridicate și a multiplelor intervenții chirurgicale, a pierderilor semnificative de sânge și a diverselor reacții la mediul de perfuzie utilizat. Principalele dificultăți în efectuarea intervențiilor chirurgicale plastice cutanate pentru arsuri profunde extinse, cu o suprafață care depășește 40% din suprafața corporală, se datorează gravității stării victimelor și lipsei de resurse de piele donatoare. Utilizarea transplanturilor de plasă cu un coeficient de perforație ridicat nu rezolvă problema, deoarece celulele formate după perforație se epitelizează foarte lent, iar lambele de piele în sine se lizează sau se usucă adesea. Acoperiri ale arsurilor, cum ar fi xenoskin, alogrefe cadaverice, acoperiri cu pelicule sintetice, nu sunt întotdeauna suficient de eficiente, prin urmare, se dezvoltă noi metode de acoperire a suprafețelor arse cu straturi de keratinocite și fibroblaste cultivate. În special, a fost propusă o metodă de acoperire a suprafețelor arse cu ajutorul alofibroblastelor cultivate, care, atunci când sunt transplantate, au un efect stimulator pronunțat asupra proliferării epidermocitelor conservate în rană în arsurile borderline, precum și a keratinocitelor în septurile transplanturilor de plasă. Lucrarea lui L. Budkevich și a coautorilor (2000) prezintă rezultatele utilizării acestei metode pentru tratarea arsurilor la copii. Studiul a inclus 31 de copii cu traume termice cu vârste cuprinse între 1 an și 14 ani. La trei copii, suprafața totală a arsurilor de gradele IIIA-B - IV a fost de 40%, la 25 - 50-70%, la alți trei - 71-85% din suprafața corporală. Necrectomia chirurgicală precoce a fost combinată cu transplantul de alofibroblaste cultivate și autodermoplastie. Prima etapă a tratamentului a implicat excizia țesuturilor necrotice, a doua etapă a implicat transplantul de alofibroblaste cultivate pe pelicule purtătoare, iar a treia etapă (la 48 de ore după transplantul de alofibroblaste cultivate) a implicat îndepărtarea matricei și autodermoplastie cu lambouri de piele cu un raport de perforație de 1:4. Trei pacienți internați în clinică cu arsuri severe au avut alofibroblaste cultivate transplantate pe plăgi de granulare. Transplantarea de alofibroblaste cultivate a fost efectuată o dată la 18 copii, de două ori la 11 copii și de trei ori la doi pacienți. Suprafața plăgii acoperită cu cultură celulară a variat între 30 și 3500 cm2. Eficacitatea alofibroblastelor cultivate a fost evaluată prin procentul general de grefare cutanată, timpii de vindecare a arsurilor și numărul de decese cauzate de traume termice severe. Grefarea grefei a fost completă la 86% dintre pacienți. Negrefarea parțială a grefelor de piele a fost observată în 14% din cazuri. În ciuda tratamentului, șase (19,3%) copii au decedat. Suprafața totală a leziunilor cutanate la aceștia a variat între 40 și 70% din suprafața corporală.Transplantul de alofibroblaste cultivate nu a fost asociat cu mortalitatea în cazul arsurilor la niciun pacient.

Analizând rezultatele tratamentului, autorii observă că anterior, leziunile termice profunde ale pielii, care acopereau 35-40% din suprafața corpului, erau considerate incompatibile cu viața (pentru copiii mai mici - până la 3 ani - arsurile profunde care acoperă 30% din suprafața corpului sunt critice, pentru copiii mai mari - peste 40% din suprafața corpului). La efectuarea necrectomiei chirurgicale cu transplant de alofibroblaste cultivate și autodermoplastie ulterioară cu lambouri cu un coeficient de perforație ridicat, arsurile de gradul IIIB - IV rămân critice, dar în prezent există perspective de salvare a vieții chiar și a unor astfel de victime în multe cazuri. Necrectomia chirurgicală în combinație cu transplant de alofibroblaste cultivate și autodermoplastie la copiii cu arsuri profunde s-a dovedit a fi deosebit de eficientă la pacienții cu leziuni cutanate extinse, cu o lipsă de locuri donatoare. Tacticile chirurgicale active și transplantul de alofibroblaste cultivate contribuie la stabilizarea rapidă a stării generale a acestor pacienți, la scăderea numărului de complicații infecțioase ale bolii arsurilor, la crearea unor condiții favorabile pentru grefarea transplanturilor, la reducerea timpului de restaurare a pielii pierdute și a duratei tratamentului spitalicesc, la scăderea frecvenței rezultatelor fatale la victimele cu arsuri extinse. Astfel, transplantul de alofibroblaste cultivate cu autodermoplastie ulterioară cu lambouri de piele permite recuperarea la copiii cu arsuri grave, care anterior erau considerați sortiți morții.

În general, este acceptat faptul că obiectivul principal al tratării arsurilor este restaurarea cât mai completă și rapidă a pielii deteriorate pentru a preveni efectele toxice, complicațiile infecțioase și deshidratarea. Rezultatele utilizării celulelor cultivate depind în mare măsură de pregătirea arsurii pentru transplant. În cazurile de transplant de keratinocite cultivate pe suprafața plăgii după necrectomie chirurgicală, o medie de 55% (ca suprafață) din celulele transplantate se grefează, în timp ce în cazul plăgilor granulante rata de grefare scade la 15%. Prin urmare, tratamentul cu succes al arsurilor cutanate profunde și extinse necesită, în primul rând, tactici chirurgicale active. În prezența arsurilor de gradul IIIB-IV, suprafața arsurii este imediat eliberată de țesutul necrotic pentru a reduce intoxicația și a reduce numărul de complicații ale arsurilor. Utilizarea unor astfel de tactici este cheia pentru reducerea timpului din momentul primirii arsurii până la închiderea rănilor și a duratei șederii pacienților cu arsuri extinse în spital și, de asemenea, reduce semnificativ numărul de decese.

Primele rapoarte despre utilizarea cu succes a keratinocitelor cultivate pentru acoperirea suprafețelor arse au apărut la începutul anilor 1980. Ulterior, această manipulare a fost efectuată folosind straturi de keratinocite cultivate, cel mai adesea obținute din autocelule, mult mai rar din alokeratinocite. Cu toate acestea, tehnologia autokeratinocitoplastiei nu permite crearea unei bănci de celule, în timp ce timpul necesar pentru a produce un transplant de keratinocite de o suprafață suficientă este lung și se ridică la 3-4 săptămâni. În această perioadă, riscul de a dezvolta complicații infecțioase și de altă natură ale bolii arsurilor crește brusc, ceea ce prelungește semnificativ timpul total de ședere a pacienților în spital. În plus, autokeratinocitele practic nu prind rădăcini atunci când sunt transplantate pe plăgi de arsură granulante, iar costul ridicat al mediilor speciale de creștere și al stimulatorilor biologic activi ai creșterii keratinocitelor limitează semnificativ utilizarea lor clinică. Alte metode biotehnologice, cum ar fi colagenoplastia, transplantul de xenoskin crioconservat și utilizarea diferitelor acoperiri biopolimerice, cresc eficacitatea tratării arsurilor superficiale extinse, dar nu și a celor profunde. Metoda de acoperire a suprafeței plăgii cu fibroblaste cultivate este fundamental diferită prin faptul că fibroblastele, mai degrabă decât keratinocitele, sunt utilizate ca principală componentă a stratului celular cultivat.

Condiția prealabilă pentru dezvoltarea metodei a fost faptul că pericitele care înconjoară vasele mici sunt celule mezenchimale progenitoare capabile să se transforme în fibroblaste care produc numeroși factori de creștere și asigură vindecarea rănilor datorită unui efect stimulator puternic asupra proliferării și aderenței keratinocitelor. Utilizarea fibroblastelor cultivate pentru închiderea suprafețelor plăgilor a relevat imediat o serie de avantaje semnificative ale acestei metode în comparație cu utilizarea keratinocitelor cultivate. În special, obținerea fibroblastelor în cultură nu necesită utilizarea unor medii nutritive speciale și a unor stimulente de creștere, ceea ce reduce costul transplantului de peste 10 ori față de costul obținerii keratinocitelor. Fibroblastele sunt ușor pasivate, timp în care pierd parțial antigenele de histocompatibilitate de suprafață, ceea ce, la rândul său, deschide posibilitatea utilizării celulelor alogene pentru fabricarea transplanturilor și crearea băncilor acestora. Timpul necesar pentru obținerea transplanturilor gata de utilizare într-o clinică este redus de la 3 săptămâni (pentru keratinocite) la 1-2 zile (pentru fibroblaste). O cultură primară de fibroblaste poate fi obținută prin cultivarea celulelor din fragmente de piele prelevate în timpul autodermoplastiei, iar densitatea de însămânțare celulară pentru obținerea de subculturi de fibroblaste umane este de numai 20 x 10³ ^per 1 ^cm².

Pentru a studia efectul fibroblastelor și al proteinelor lor reglatoare asupra proliferării și diferențierii keratinocitelor, a fost efectuată o analiză comparativă a morfologiei și proliferării keratinocitelor pe substraturi de colagen tipurile I și III, precum și pe fibronectină, într-o cultură comună cu fibroblaste umane. Keratinocitele umane au fost izolate din fragmente de piele de la pacienți cu arsuri, prelevate în timpul autodermoplastiei. Densitatea de însămânțare a keratinocitelor a fost de 50 x 10³ celule pe 1 cm2. Eficacitatea clinică a transplantului de fibroblaste cultivate a fost evaluată la 517 pacienți. Toți pacienții au fost împărțiți în două grupe: Grupa 1 - victime adulte cu arsuri de gradul IIA, B - IV; Grupa 2 - copii cu arsuri profunde de gradul IIIB - IV. Evaluarea dinamicii organizării structurale și funcționale a culturilor de fibroblaste în monostrat, luând în considerare rolul glicozaminoglicanilor, fibronectinei și colagenului în procesele de regenerare, a permis autorilor să determine a 3-a zi ca fiind perioada cea mai favorabilă pentru utilizarea culturilor de fibroblaste în vederea efectuării transplanturilor. Un studiu privind efectul fibroblastelor asupra proliferării și diferențierii keratinocitelor a arătat că fibroblastele in vitro au un efect stimulator pronunțat, în primul rând asupra proceselor de aderență a keratinocitelor, crescând numărul de celule atașate și rata de fixare a acestora de peste 2 ori. Stimularea proceselor de aderență este însoțită de o creștere a intensității sintezei ADN-ului și a nivelului de proliferare a keratinocitelor. În plus, s-a constatat că prezența fibroblastelor și a matricei extracelulare formate de acestea este o condiție necesară pentru formarea aparatului tonofibrilar al keratinocitelor, a conexiunilor intercelulare și, în cele din urmă, pentru diferențierea keratinocitelor și formarea membranei bazale. În tratamentul copiilor cu arsuri profunde, s-a stabilit o eficiență clinică ridicată a transplantului de cultură de alofibroblaste, în special în grupul de pacienți cu leziuni cutanate extinse în condiții de deficit de situs donator. Un studiu morfofuncțional cuprinzător a arătat că fibroblastele transplantate se caracterizează prin sinteza activă a ADN-ului, precum și a colagenului, fibronectinei și glicozaminoglicanilor, care fac parte din matricea extracelulară formată de celule. Autorii indică un procent ridicat de grefare a fibroblastelor transplantate (până la 96%), o reducere bruscă a timpului de recepție (în 24-48 de ore în loc de 2-3 săptămâni în cazul utilizării keratinocitelor), o accelerare semnificativă a epitelizării suprafeței arse, precum și o reducere semnificativă a costului (de 10 ori) al tehnologiei de creștere a unui transplant din fibroblaste în comparație cu transplantul de keratinocite. Utilizarea transplantului de alofibroblaste cultivate face posibilă salvarea vieții copiilor cu arsuri critice - leziuni termice pe mai mult de 50% din suprafața corpului.ceea ce anterior era considerat incompatibil cu viața. Trebuie menționat că, odată cu transplantul de fibroblaste embrionare alogene, s-a dovedit în mod convingător nu numai o regenerare mai rapidă a rănilor și convalescența pacienților cu diferite grade și zone de arsuri, ci și o reducere semnificativă a mortalității acestora.

Fibroblastele autologe sunt utilizate și într-un domeniu atât de complex al chirurgiei plastice, precum corectarea reconstructivă a leziunilor corzilor vocale. În acest scop se utilizează de obicei colagenul bovin, a cărui durată de acțiune este limitată de imunogenitatea sa. Fiind o proteină străină, colagenul bovin este sensibil la colagenaza receptorului și poate provoca reacții imune, pentru a reduce riscul acestora s-au dezvoltat tehnologii pentru obținerea preparatelor de colagen reticulate cu glutaraldehidă. Avantajul lor constă într-o stabilitate mai mare și o imunogenitate mai mică, care și-au găsit aplicații practice în eliminarea defectelor și atrofiei corzilor vocale. Injecțiile cu colagen autolog au fost utilizate pentru prima dată în 1995. Tehnica a asigurat conservarea structurii primare a fibrelor de colagen autologe, inclusiv a legăturilor încrucișate catalizate enzimatic intramoleculare. Cert este că fibrele naturale de colagen sunt mai rezistente la distrugerea de către proteaze decât colagenul reconstituit, în care telopeptidele sunt tăiate. Integritatea telopeptidelor este importantă pentru structura cuaternară a fibrelor de colagen și formarea legăturilor încrucișate între moleculele de colagen adiacente. Spre deosebire de preparatele de colagen bovin, colagenul autolog nu provoacă reacții imune la receptor, dar nu este suficient de eficient ca agent de regenerare. O corecție stabilă poate fi obținută prin producția locală de colagen prin transplantul de fibroblaste autologe. Cu toate acestea, au fost identificate anumite dificultăți în timpul studiului eficacității transplantului autolog de fibroblaste în clinică. În perioada incipientă după transplantul de fibroblaste, efectul clinic a fost mai slab în comparație cu cel de după introducerea colagenului bovin. La cultivarea fibroblastelor autologe, nu poate fi exclusă posibilitatea transformării fibroblastelor normale în unele patologice, așa-numitele miofibroblaste, responsabile de dezvoltarea fibrozei și formarea cicatricilor, evidențiată de contracția gelului de colagen cauzată de interacțiunea specifică dintre fibroblaste și fibrilele de colagen. În plus, după pasaje seriale in vitro, fibroblastele pierd capacitatea de a sintetiza proteine ale matricei extracelulare.

Cu toate acestea, a fost dezvoltată experimental o metodă de cultivare a fibroblastelor umane autologe care elimină deficiențele menționate mai sus și nu are ca rezultat transformarea oncogenă a fibroblastelor normale. Fibroblastele autologe obținute prin această metodă sunt utilizate pentru a restaura defectele din țesuturile faciale moi. Într-un studiu realizat de G. Keller și colab. (2000), au fost tratați 20 de pacienți cu vârste cuprinse între 37 și 61 de ani, cu riduri și cicatrici atrofice. Biopsiile cutanate (4 mm) din regiunea retroauriculară au fost transportate la laborator în eprubete sterile conținând 10 ml de mediu de cultură (mediu Eagle cu antibiotic, micoseptic, piruvat și ser fetal de vițel). Materialul a fost plasat în 3-5 vase de cultură cu diametrul de 60 mm și incubat într-un termostat cu o atmosferă conținând 5% CO2. După 1 săptămână, celulele au fost îndepărtate din vase prin tripsinizare și plasate în flacoane de 25 cm2. Celulele au fost injectate pacienților într-o cantitate de 4 x 107. Un efect clinic semnificativ și persistent a fost observat la pacienți în timpul corectării pliurilor nazolabiale, precum și la pacienții cu cicatrici la 7 și 12 luni după al treilea transplant de fibroblaste autologe. Conform citometriei în flux, fibroblastele cultivate au produs o cantitate mare de colagen de tip I. Studiile in vitro au demonstrat o contractilitate normală a fibroblastelor injectate. La două luni după administrarea subcutanată a fibroblastelor cultivate la o doză de 4 x 107 celule, nu au fost detectate tumori la șoarecii nuzi. Fibroblastele injectate nu au provocat cicatrici sau fibroză difuză la pacienți. Potrivit autorului, fibroblastele autologe grefate sunt capabile să producă constant colagen, ceea ce va oferi un efect cosmetic de întinerire. În același timp, deoarece durata de viață a celulelor diferențiate este limitată, fibroblastele prelevate de la un pacient tânăr sunt mai eficienți decât cele obținute de la persoane în vârstă. În viitor, se presupune că va fi posibilă crioconservarea unei culturi de fibroblaste prelevate de la un donator tânăr pentru a transplanta ulterior propriile celule tinere unui pacient în vârstă. În concluzie, nu este în întregime corect să se concluzioneze că fibroblastele autologe, cu condiția să fie conservate funcțional, reprezintă un mijloc ideal de corectare a defectelor țesuturilor moi ale feței. În același timp, autorul însuși observă că în timpul studiului au apărut unele situații problematice legate de utilizarea sistemului fibroblast-colagen autolog. Efectul clinic a fost adesea mai slab decât în cazul utilizării colagenului bovin, ceea ce a provocat dezamăgire în rândul pacienților.

În general, datele din literatura de specialitate privind perspectivele utilizării clinice a celulelor stem mezenchimale par destul de optimiste. Se fac încercări de a utiliza celule progenitoare mezenchimale multipotente autologe din măduva osoasă pentru tratarea leziunilor articulare degenerative. Se desfășoară primele studii clinice privind utilizarea celulelor progenitoare mezenchimale cultivate în tratamentul fracturilor osoase complexe. Celulele stromale din măduva osoasă mezenchimală auto- și alogene sunt utilizate pentru a crea țesut cartilaginos pentru transplant în corectarea defectelor cartilajului articular datorate traumatismelor sau leziunilor autoimune. Se dezvoltă metode pentru utilizarea clinică a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente pentru a elimina defectele osoase la copiii cu o formă severă de osteogeneză incompletă cauzată de mutații în gena colagenului de tip I. După mieloablație, copiii receptori sunt transplantați cu măduvă osoasă de la donatori sănătoși compatibili cu HLA, deoarece măduva osoasă nefracționată poate conține un număr suficient de celule stem mezenchimale pentru a compensa un defect osos sever. După transplantul de măduvă osoasă alogenă, acești copii au prezentat modificări histologice pozitive ale oaselor trabeculare, o creștere a ratei de creștere și o scădere a incidenței fracturilor osoase. În unele cazuri, un rezultat clinic pozitiv se obține prin transplantul de măduvă osoasă alogenă și osteoblaste strâns înrudite. Transplantul de MSC este, de asemenea, utilizat pentru a trata fragilitatea osoasă congenitală cauzată de un dezechilibru al osteoblastelor și osteoclastelor din țesutul osos. În acest caz, restabilirea formării osoase se realizează prin himerizarea fondului de celule stromale stem și progenitoare din țesutul osos al pacienților.

Îmbunătățirea metodelor de modificare genetică a celulelor stem mezenchimale donatoare în scopul corectării defectelor genetice ale țesuturilor stromale continuă. Se presupune că în viitorul apropiat, celulele progenitoare mezenchimale vor fi utilizate în neurologie pentru himerizarea țintită a celulelor cerebrale și crearea unui grup sănătos de celule capabile să genereze enzime sau factori deficitari responsabili de manifestările clinice ale bolii. Transplantul de celule stem mezenchimale poate fi utilizat pentru restaurarea stromei măduvei osoase la pacienții cu cancer după radio- și chimioterapie și, în combinație cu celule ale măduvei osoase - pentru restaurarea hematopoiezei. Dezvoltarea terapiei de substituție care vizează eliminarea defectelor sistemului musculo-scheletic cu ajutorul MSC este promovată de evoluțiile inginerești în domeniul proiectării biomaterialelor matriceale sau biomimeticelor care formează structuri populate de urmașii celulelor stem mezenchimale.

Surse de celule stem mezenchimale

Principala sursă de celule stem mezenchimale este măduva osoasă, ale cărei celule stem hematopoietice din corpul mamiferelor se diferențiază constant în celule sanguine și ale sistemului imunitar, în timp ce celulele stem mezenchimale sunt reprezentate de o populație mică de celule asemănătoare fibroblastelor din stroma măduvei osoase și contribuie la păstrarea stării nediferențiate a celulelor stem hematopoietice. În anumite condiții, celulele stem mezenchimale se diferențiază în celule cartilaginoase și osoase. Atunci când sunt însămânțate pe un mediu de cultură în condiții de plantare cu densitate scăzută, celulele stromale mononucleare ale măduvei osoase formează colonii de celule adezive, care sunt, de fapt, celule progenitoare mezenchimale multipotente asemănătoare fibroblastelor. Unii autori consideră că în măduva osoasă se depun celule stem mezenchimale neangajate, care, datorită capacității lor de autorenovare și potențialului ridicat de diferențiere, furnizează tuturor țesuturilor corpului precursori mezenchimali ai elementelor stromale pe tot parcursul vieții organismului mamiferului.

În măduva osoasă, elementele celulare stromale formează o rețea care umple spațiul dintre sinusoide și țesutul osos. Conținutul de MSC latente din măduva osoasă a unui adult este comparabil cu cantitatea de celule stem hematopoietice și nu depășește 0,01-0,001%. Celulele stem mezenchimale izolate din măduva osoasă și necultivate sunt lipsite de molecule de adeziune. Astfel de MSC nu exprimă CD34, ICAM, VCAM, colagenul de tipuri I și III, CD44 și CD29. Prin urmare, in vitro, nu celulele stem mezenchimale sunt fixate pe substratul de cultură, ci derivați progenitori mai avansați ai celulelor stem mezenchimale care au format deja componentele citoscheletului și ale aparatului receptor al moleculelor de adeziune celulară. Celulele stromale cu fenotipul CD34 se găsesc chiar și în sângele periferic, deși în măduva osoasă sunt semnificativ mai puține decât celulele mononucleare CD34-pozitive. Celulele CD34 izolate din sânge și transferate în cultură se atașează de substrat și formează colonii de celule asemănătoare fibroblastelor.

Se știe că în perioada embrionară, baza stromală a tuturor organelor și țesuturilor mamiferelor și oamenilor provine dintr-un grup comun de celule stem mezenchimale înainte și în stadiul de organogeneză. Prin urmare, se consideră că într-un organism matur majoritatea celulelor stem mezenchimale ar trebui să se afle în țesutul conjunctiv și osos. S-a stabilit că partea principală a elementelor celulare ale stromei țesutului conjunctiv și osos lax este reprezentată de celule progenitoare dedicate, care, totuși, își păstrează capacitatea de a prolifera și de a forma clone in vitro. Atunci când astfel de celule sunt introduse în fluxul sanguin general, peste 20% din celulele progenitoare mezenchimale sunt implantate printre elementele stromale ale țesutului hematopoietic și organelor parenchimatoase.

O sursă potențială de celule stem mezenchimale este țesutul adipos, printre celulele stem ale căruia au fost identificați precursori adipocitari angajați în grade diferite. Elementele progenitoare cele mai puțin mature ale țesutului adipos sunt celulele stromale-vasculare, care, la fel ca celulele precursoare mezenchimale multipotente ale măduvei osoase, sunt capabile să se diferențieze în adipocite sub influența glucocorticoizilor, a factorului de creștere asemănător insulinei și a insulinei. În cultură, celulele stromale-vasculare se diferențiază în adipocite și condrocite, iar în țesutul adipos de origine a măduvei osoase există celule care formează adipocite și osteoblaste.

Celulele stem stromale au fost găsite și în mușchi. În cultura primară de celule izolate din mușchiul scheletic uman, se detectează celule stelate și miotuburi multinucleate. În prezența serului de cal, celulele stelate proliferează in vitro fără semne de citodiferențiere, iar după adăugarea de dexametazonă în mediul nutritiv, diferențierea lor se caracterizează prin apariția unor elemente celulare cu fenotipul celulelor musculare scheletice și netede, osului, cartilajului și țesutului adipos. Prin urmare, în țesutul muscular uman sunt prezente atât celule progenitoare mezenchimale multipotente, dedicate, cât și necompromise. S-a demonstrat că populația de celule progenitoare prezentă în mușchiul scheletic provine din celulele progenitoare mezenchimale multipotente necompromise din măduva osoasă și diferă de celulele satelit miogene.

Celule stelate adezive corespunzătoare celulelor progenitoare mezenchimale multipotente aflate în potențial de diferențiere au fost găsite și în miocardul șobolanilor nou-născuți, deoarece sub influența dexametazonei acestea se diferențiază în adipocite, osteoblaste, condrocite, celule musculare netede, miotuburi musculare scheletice și cardiomiocite. S-a demonstrat că celulele musculare netede vasculare (pericite) sunt derivate ale celulelor progenitoare mezenchimale multipotente perivasculare nediferențiate. În cultură, celulele stem mezenchimale perivasculare exprimă α-actină din mușchiul neted și receptorul factorului de creștere derivat din trombocite și sunt capabile să se diferențieze cel puțin în celule musculare netede.

Un loc special, din punctul de vedere al rezervelor stemului, îl ocupă țesutul cartilaginos, al cărui potențial reparativ extrem de scăzut se crede că se datorează unui deficit de celule progenitoare mezenchimale multipotente sau de factori de diferențiere și creștere. Se presupune că celulele progenitoare mezenchimale multipotente pre-angajate pentru condro- și osteogeneză pătrund în țesutul cartilaginos din alte surse tisulare.

Originea țesuturilor și condițiile de angajare a celulelor progenitoare mezenchimale în tendoane nu au fost stabilite. Observațiile experimentale indică faptul că în perioada postnatală timpurie, celulele tendonului lui Ahile de iepure din culturile primare și la primul pasaj își păstrează expresia colagenului de tip I și a decorinei, dar odată cu cultivarea ulterioară pierd markerii de diferențiere ai tenocitelor.

Trebuie menționat că nu s-a primit încă răspunsul la întrebarea dacă celulele progenitoare mezenchimale multipotente localizate în diverse țesuturi sunt de fapt prezente constant în stroma lor sau dacă rezerva tisulară de celule stem mezenchimale este alimentată prin migrarea celulelor stem stromale din măduva osoasă.

Pe lângă măduva osoasă și alte zone de țesut mezenchimal ale unui organism adult, sângele din cordonul ombilical poate fi o altă sursă de MSC. S-a demonstrat că sângele din vena cordonului ombilical conține celule care au caracteristici morfologice și antigenice similare cu celulele progenitoare mezenchimale multipotente, sunt capabile de aderență și nu sunt inferioare celulelor progenitoare mezenchimale multipotente de origine din măduva osoasă în ceea ce privește potențialul de diferențiere. În culturile de celule stem mezenchimale din sângele cordonului ombilical, s-au găsit 5 până la 10% de celule progenitoare mezenchimale multipotente neangajate. S-a dovedit că numărul lor în sângele cordonului ombilical este invers proporțional cu vârsta gestațională, ceea ce indică indirect migrarea celulelor progenitoare mezenchimale multipotente către diverse țesuturi în timpul dezvoltării fetale. Au apărut primele informații despre utilizarea clinică a celulelor stem mezenchimale izolate din sângele cordonului ombilical, precum și a celor obținute din biomaterialul embrionar, care se bazează pe capacitatea cunoscută a celulelor stem fetale de a se integra, grefa și funcționa în organele și sistemele tisulare ale receptorilor adulți.

Căutarea de noi surse de celule stem mezenchimale

Utilizarea celulelor stem mezenchimale de origine embrionară, precum și a altor celule fetale, creează o serie de probleme etice, juridice, judiciare și legislative. Prin urmare, căutarea de material celular donator extraembrionar continuă. O încercare de utilizare clinică a fibroblastelor pielii umane a fost nereușită, ceea ce a fost predeterminat nu numai de capacitatea financiară ridicată a tehnologiei, ci și de diferențierea rapidă a fibroblastelor în fibrocite, care au un potențial de proliferare semnificativ mai mic și produc un număr limitat de factori de creștere. Progresele ulterioare în studiul biologiei MSC-urilor și a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente din măduva osoasă ne-au permis să dezvoltăm o strategie pentru utilizarea clinică a celulelor stem mezenchimale autologe. Tehnologia izolării, cultivării, reproducerii ex vivo și diferențierii țintite a acestora a necesitat, în primul rând, studiul spectrului markerilor moleculari ai MSC-urilor. Analiza acestora a arătat că culturile primare de țesut osos uman conțin mai multe tipuri de celule progenitoare mezenchimale multipotente. Fenotipul proosteoblastic a fost detectat în celulele care exprimă markerul celulelor progenitoare stromale STRO-1, dar care nu poartă markerul osteoblastic - fosfataza alcalină. Astfel de celule se caracterizează printr-o capacitate scăzută de a forma matrice osoasă mineralizată, precum și prin absența expresiei receptorilor de osteopontină și hormon paratiroidian. Derivații celulelor STRO-1-pozitive care nu exprimă fosfatază alcalină sunt reprezentați de osteoblaste diferențiate intermediar și complet. S-a constatat că elementele celulare ale liniilor clonate de celule osoase trabeculare umane STRO-1-pozitive sunt capabile să se diferențieze în osteocite și adipocite mature. Direcția de diferențiere a acestor celule depinde de efectul acizilor grași polinesaturați, al citokinelor proinflamatorii - IL-1b și al factorului de necroză tumorală a (TNF-a), precum și al antiinflamatorilor și imunosupresoarelor TGF-b.

Ulterior s-a constatat că celulele progenitoare mezenchimale multipotente nu au un fenotip specific, inerent doar lor, ci exprimă un complex de markeri caracteristici celulelor mezenchimale, endoteliale, epiteliale și musculare în absența exprimării antigenelor imunofenotipice ale celulelor hematopoietice - CD45, CD34 și CD14. În plus, celulele stem mezenchimale produc constitutiv și inductibil factori de creștere hematopoietici și non-hematopoietici, interleukine și chemokine, iar receptorii pentru unele citokine și factori de creștere sunt exprimați pe celulele progenitoare mezenchimale multipotente. Printre celulele matricei stromale a corpului uman s-au găsit celule latente, sau în repaus, cu un imunofenotip aproape identic cu profilul antigenic al celulelor progenitoare mezenchimale multipotente netratate cu 5-fluorouracil - ambele celule exprimă CD117, care marchează celulele stem „adulte”.

Prin urmare, nu a fost încă identificat un marker celular specific celulelor stem mezenchimale. Se presupune că celulele latente reprezintă o populație de celule progenitoare mezenchimale multipotente neangajate, deoarece acestea nu exprimă markeri ai celulelor angajate în osteo- (Cbfa-1) sau adipogeneză (PPAR-y-2). Expunerea prelungită a celulelor latente cu proliferare lentă la serul fetal bovin duce la formarea de progenitori angajați cu diferențiere terminală, caracterizați prin creștere rapidă. Expansiunea clonală a acestor celule stem mezenchimale este susținută de FGF2. Se pare că genomul celulelor stem stromale este destul de strâns „închis”. Există rapoarte despre absența diferențierii spontane în MSC - fără condiții speciale pentru angajare, acestea nu se transformă nici măcar în celule din linia mezenchimală.

Pentru a studia structura populației derivatelor de celule stem mezenchimale, se efectuează o căutare de proteine marker de diferențiere pe linii celulare stromale și în culturi primare. Analiza clonală in vitro a celulelor formatoare de colonii din măduva osoasă a arătat că EGF crește dimensiunea medie a coloniilor și scade expresia clonală a fosfatazei alcaline atunci când este aplicat culturilor primare, în timp ce adăugarea de hidrocortizon activează expresia fosfatazei alcaline, care este un marker al direcției osteogenice a diferențierii MSC. Anticorpii monoclonali împotriva STRO-1 au făcut posibilă separarea și studierea populației de celule adezive STRO-1-pozitive într-un sistem eterogen de culturi Dexter. A fost determinat un spectru de citokine care reglează nu numai proliferarea și diferențierea celulelor hematopoietice și limfoide, ci participă și la formarea, formarea și resorbția țesuturilor scheletice prin mecanisme para-, auto- și endocrine. Eliberarea mediată de receptori a unor mesageri secundari precum cAMP, diacilglicerol, inozitol trifosfat și Ca2+ este, de asemenea, utilizată pentru analiza markerilor diferitelor categorii de celule ale țesutului stromal care exprimă receptorii corespunzători. Utilizarea anticorpilor monoclonali ca markeri a permis stabilirea apartenenței celulelor reticulare ale stromei organelor limfoide la zonele dependente de T și B.

Timp de ceva timp, dezbaterile științifice au continuat în jurul posibilității originii MSC dintr-o celulă stem hematopoietică. Într-adevăr, atunci când suspensiile de celule din măduva osoasă sunt explantate în culturi monostrat, în ele cresc colonii discrete de fibroblaste. Cu toate acestea, s-a demonstrat că prezența precursorilor coloniilor de fibroblaste și a diverșilor germeni de diferențiere a țesutului hematopoietic în măduva osoasă nu constituie o dovadă a originii lor comune dintr-o celulă stem hematopoietică. Folosind analiza discriminantă a celulelor stem din măduva osoasă, s-a stabilit că micromediul în timpul transplantului heterotopic de măduvă osoasă nu este transferat de celulele hematopoietice, ceea ce dovedește existența unei populații de MSC în măduva osoasă care este histogenetic independentă de celulele hematopoietice.

În plus, metoda de clonare selectivă a permis identificarea unei noi categorii de celule progenitoare stromale în culturi monostrat de celule ale măduvei osoase, determinarea numărului acestora și studierea proprietăților, potențialului proliferativ și de diferențiere. S-a constatat că celulele asemănătoare fibroblastelor stromale proliferează in vitro și formează colonii diploide, care, atunci când sunt transplantate înapoi în organism, permit formarea de noi organe hematopoietice. Rezultatele studiului clonelor individuale indică faptul că printre celulele progenitoare stromale există o populație de celule care, prin potențialul lor proliferativ și de diferențiere, pot revendica rolul de celule stem ale țesutului stromal, histogenetic independente de celulele stem hematopoietice. Celulele acestei populații se caracterizează prin creștere auto-susținută și se diferențiază în elemente de celule progenitoare ale osului, cartilajului și țesutului reticular al măduvei osoase.

De mare interes sunt rezultatele studiilor realizate de R. Chailakhyan și coautorilor (1997-2001), care au cultivat celule progenitoare stromale ale măduvei osoase de la iepuri, cobai și șoareci pe mediul nutritiv a-MEM cu adaos de ser fetal de vițel. Autorii au efectuat explantarea cu o densitate inițială de 2-4 x 103 celule de măduvă osoasă la 1 cm2. Celule de măduvă osoasă omoloage sau heteroloage inactivate prin radiații au fost utilizate ca hrănitor într-o doză care a păstrat efectul de hrănire, dar a blocat complet proliferarea lor. Colonii discrete primare de fibroblaste, în vârstă de două săptămâni, au fost tripsinizate pentru a obține tulpini monoclonale. Dovezile originii clonale a coloniilor au fost obținute folosind un marker cromozomial în culturi mixte de măduvă osoasă de cobai masculi și femele, fotografiere time-lapse a culturilor vii și în culturi mixte de măduvă osoasă singenică de șoareci CBA și CBAT6T6. Transplantarea unei suspensii de celule de măduvă osoasă proaspăt izolate sau fibroblaste stromale cultivate in vitro sub capsula renală a fost efectuată în schele poroase din ivalon sau gelatină, precum și în matrice osoasă spongioasă inactivată de iepure. Pentru transplantul de clone într-o teacă osoasă, femururile de cobai au fost curățate de țesut moale și periost, epifizele au fost îndepărtate, iar măduva osoasă a fost spălată bine. Osul a fost tăiat în fragmente (3-5 mm), uscat și iradiat la o doză de 60 Gy. Coloniile individuale de fibroblaste au fost plasate în teci osoase și implantate intramuscular. Pentru transplantul intraperitoneal de fibroblaste stromale cultivate in vitro, s-au utilizat camere de difuzie de tip A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) și O (V=0,15 cm3, h=2 mm).

Studiind dinamica creșterii tulpinilor clonale, R. Chailakhyan și colab. (2001) au descoperit că celulele individuale care formează colonii de fibroblaste, precum și descendenții acestora, au un potențial proliferativ enorm. Până la a 10-a trecere, numărul de fibroblaste în unele tulpini era de 1,2-7,2 x 109 ^celule. În timpul dezvoltării lor, acestea au efectuat până la 31-34 de dublări celulare. În acest caz, transplantul heterotopic de tulpini derivate din măduva osoasă, formate din precursori stromali a câteva zeci de clone, a dus la transferul micromediului măduvei osoase și la formarea unui nou organ hematopoietic în zona de transplant. Autorii au pus întrebarea dacă clonele individuale sunt capabile să transfere micromediul măduvei osoase al celulelor stromale sau dacă este necesară cooperarea mai multor precursori stromali clonogenici diferiți pentru aceasta? Și dacă clonele individuale sunt capabile să transfere micromediul, va fi acesta complet pentru toți cei trei germeni hematopoietici sau clone diferite asigură formarea micromediului pentru diferiți germeni hematopoietici? Pentru a rezolva aceste probleme, a fost dezvoltată o tehnologie pentru cultivarea celulelor progenitoare stromale pe un gel de colagen, permițând îndepărtarea coloniilor de fibroblaste crescute de pe suprafață pentru transplant heterotopic ulterior. Clonele individuale de fibroblaste stromale crescute din celule de măduvă osoasă de șoareci și cobai CBA au fost excizate împreună cu un fragment din stratul de gel și transplantate heterotopic - sub capsula renală a șoarecilor singenici sau în mușchiul abdominal al cobaiilor autologi. Când au fost transplantate în mușchi, coloniile de pe gel au fost plasate în teci osoase.

Autorii au descoperit că, la 50-90 de zile după transplantul coloniilor de fibroblaste de măduvă osoasă, în zona de transplant s-a observat dezvoltarea osului sau a țesutului osos și hematopoietic în zona de transplant în 20% din cazuri. La 5% dintre animalele receptoare, focarele de țesut osos formate conțineau o cavitate umplută cu măduvă osoasă. În interiorul cilindrilor osoși, aceste focare aveau o formă rotunjită și o capsulă construită din țesut osos cu osteocite și un strat osteoblastic bine dezvoltat. Cavitatea măduvei osoase conținea țesut reticular cu celule mieloide și eritroide, a căror relație proporțională nu diferă de cea din măduva osoasă normală. În rinichi, transplantul a fost un organ tipic de măduvă osoasă format în timpul transplantului de măduvă osoasă nativă, capsula osoasă acoperind cavitatea măduvei osoase doar din lateralul capsulei renale. Țesutul hematopoietic includea elemente mieloide, eritroide și megacariocitare. Stroma cavității măduvei osoase avea un sistem sinusal bine dezvoltat și conținea celule adipoase tipice. În același timp, în zona de transplant a unor colonii, sub capsula renală, s-a găsit țesut osos fără semne de hematopoieză. Studiul potențialelor proliferative și de diferențiere ale clonelor individuale a fost continuat pe tulpini monoclonale de măduvă osoasă de iepure, ale căror celule au fost resuspendate într-un mediu nutritiv și într-un burete ivalon separat cu o masă de 1-2 mg, transplantate sub capsula renală a unui donator de măduvă osoasă de iepure. Celulele a 21 de tulpini monoclonale au fost supuse unei astfel de autotransplantări. Rezultatele au fost luate în considerare după 2-3 luni. Autorii au constatat că în 14% din cazuri, tulpinile monoclonale transplantate au format un organ de măduvă osoasă format din țesut osos și o cavitate de măduvă osoasă umplută cu celule hematopoietice. În 33% din cazuri, tulpinile transplantate au format un os compact de dimensiuni variabile, cu osteocite încapsulate în cavități și un strat osteoblastic dezvoltat. În unele cazuri, în bureții cu clone transplantate s-a dezvoltat țesut reticular fără os sau elemente hematopoietice. Uneori, s-a format o stromă reticulară cu o rețea sinusoidală bine dezvoltată, dar nepopulată cu celule hematopoietice. Astfel, rezultatele obținute au fost similare cu datele obținute în timpul transplantului de clone pe gel de colagen. Totuși, dacă transplantul de clone crescute pe substrat a dus la formarea de țesut de măduvă osoasă în 5% din cazuri, țesut osos în 15% și țesut reticular în 80% din cazuri, atunci în cazul transplantului de tulpini monoclonale, formarea de elemente de măduvă osoasă a fost observată în 14% din cazuri, țesut osos în 53% și țesut reticular în 53% din cazuri. Potrivit autorilor, acest lucru indică faptul că condițiile pentru implementarea potențialului proliferativ și de diferențiere al fibroblastelor stromale în timpul transplantului pe schele poroase au fost mai optime decât în timpul transplantării lor în teci osoase și pe un substrat de colagen.Este posibil ca utilizarea unor metode mai avansate de cultivare și transplant invers al clonelor să poată îmbunătăți condițiile pentru realizarea potențialului lor de diferențiere de către clone și să modifice aceste raporturi. Într-un fel sau altul, însă principala semnificație a studiilor efectuate este că unele clone de celule stromale sunt capabile să formeze țesut osos și, simultan, să ofere un micromediu hematopoietic stromal pentru trei germeni de hematopoieză a măduvei osoase: eritroid, mieloid și megacariocitar, creând platforme destul de mari de țesut hematopoietic și o parte din masa osoasă.

Autorii au abordat apoi problema capacității celulelor progenitoare stromale clonogene individuale de a suferi aceste tipuri de diferențiere celulară într-un sistem închis de camere de difuzie. În plus, a fost necesar să se determine dacă clonele individuale posedă polipotență sau dacă manifestarea potențialului de diferențiere necesită interacțiunea cooperativă a mai multor clone cu o trăsătură fixă de citodiferențiere, ale căror raporturi diferite determină formarea preferențială a țesutului osos, reticular sau cartilaginos. Prin combinarea a două abordări metodologice - obținerea de tulpini monoclonale de celule progenitoare stromale din măduva osoasă și transplantarea lor în camere de difuzie - R. Chailakhyan și coautorii (2001) au obținut rezultate care le-au permis să se apropie de înțelegerea organizării structurale a stromei măduvei osoase. Transplantarea tulpinilor monoclonale de celule progenitoare stromale în camere de tip O a dus la formarea atât a țesutului osos, cât și a celui cartilaginos, indicând capacitatea descendenților unei singure celule formatoare de colonii stromale de a forma simultan țesut osos și cartilaginos. Presupunerea că țesutul osos și cartilaginos provin dintr-o celulă progenitoare stromală comună a fost avansată în mod repetat. Totuși, această ipoteză nu a avut o confirmare experimentală corectă. Formarea osului și a cartilajului în camerele de difuzie a fost dovada necesară a existenței unei celule progenitoare comune pentru aceste două tipuri de țesut printre celulele stem stromale ale măduvei osoase.

Apoi, 29 de tulpini clonale din pasajele a doua-treie obținute din culturi primare de măduvă osoasă de iepure au fost plasate în camere de difuzie și implantate intraperitoneal în animale omoloage. Studiile au arătat că 45% din tulpinile monoclonale de măduvă osoasă posedă potențial osteogenic. Nouă camere conțineau exclusiv țesut reticular, dar acesta era prezent împreună cu țesut osos și cartilaginos în încă 13 camere, ceea ce constituia 76% din totalul tulpinilor. În camerele de tip O, unde a fost posibilă diferențierea atât a țesutului osos, cât și a celui cartilaginos, au fost studiate 16 tulpini. În patru camere (25%) s-a format atât țesut osos, cât și cartilaginos. Trebuie remarcat încă o dată faptul că în studiile lui R. Chailakhyan și colab. (2001), celulele progenitoare individuale au suferit 31 până la 34 de dublări în cadrul unei tulpini celulare, iar descendenții lor au cuprins 0,9-2,0 x 109 ^celule. Numărul de mitoze pe care le-au suferit celulele progenitoare ale tulpinilor policlonale a fost practic identic cu cel al tulpinilor monoclonale. Rata de dezvoltare a tulpinilor policlonale, în special în prima fază a formării lor, a depins într-o măsură semnificativă de numărul de colonii utilizate pentru inițierea tulpinilor. Tulpinile diploide de fibroblaste embrionare umane (WI-38), atunci când au fost reclonate la nivelurile de dublare 12-15, au format, de asemenea, colonii care diferă în diametru și conținut celular. Coloniile mari care conțin mai mult de 10³ celule au constituit doar 5-10%. Odată cu creșterea numărului de diviziuni, procentul de colonii mari a scăzut. Tulpinile mono- și policlonale de fibroblaste stromale ale măduvei osoase au păstrat un set diploid de cromozomi după 20 sau mai multe dublări, iar tendința dezvoltării lor a fost comparabilă cu dinamica dezvoltării tulpinilor diploide de fibroblaste embrionare. Analiza potențialului de diferențiere a celulelor progenitoare stromale individuale ale măduvei osoase, efectuată prin transplantarea tulpinilor monoclonale în camere de difuzie, a arătat că jumătate dintre acestea au fost osteogene. Coloniile mari au reprezentat 10% din numărul lor total. Prin urmare, numărul de celule formatoare de colonii osteogene a corespuns la aproximativ 5% din populația lor totală. Masa totală a celulelor progenitoare osteogene identificate de autori a inclus celule capabile să formeze simultan țesut osos și cartilaj. Mai mult, s-a stabilit pentru prima dată că aceste două tipuri de țesut dintr-un organism adult au o celulă progenitoare comună: 25% dintre clonele testate au fost create de astfel de celule, iar numărul lor în populația totală de celule progenitoare a fost de cel puțin 2,5%.

Astfel, transplantul heterotopic de clone individuale de fibroblaste din măduva osoasă a dezvăluit noi aspecte ale organizării structurale a populației de celule progenitoare mezenchimale. S-au descoperit celule progenitoare stromale capabile să transfere un micromediu specific pentru toți germenii hematopoietici simultan, numărul acestora printre clonele mari studiate în diferite modele variază de la 5 la 15% (0,5-1,5% din numărul total de celule progenitoare detectate). Alături de clonele care transferă micromediul complet al măduvei osoase, există celule progenitoare determinate doar de osteogeneză, care, atunci când sunt transferate într-un sistem deschis, formează țesut osos care nu susține dezvoltarea hematopoiezei. Numărul lor din numărul total de celule progenitoare este de 1,5-3%. Unele dintre aceste celule sunt capabile să formeze țesut osos cu o perioadă limitată de auto-întreținere. În consecință, populația de celule progenitoare stromale este eterogenă în potențialul său de diferențiere. Printre acestea, există o categorie de celule care pretind a fi celule stem stromale, capabile să se diferențieze în toate cele trei direcții caracteristice țesutului stromal al măduvei osoase, formând os, cartilaj și țesut reticular. Datele prezentate ne permit să sperăm că, utilizând diverși markeri celulari, va fi posibil să se determine contribuția fiecărui tip de celule stromale la organizarea unui micromediu specific și la susținerea hematopoiezei în culturile Dexter.

Caracteristicile celulelor stem mezenchimale

În ultimii ani, s-a stabilit că în culturile staționare de măduvă osoasă, celulele progenitoare mezenchimale multipotente sunt reprezentate de o populație limitată de celule agranulare mici (celule RS-1) caracterizate printr-o capacitate scăzută de formare a coloniilor și absența expresiei antigenului Ki-67 specific celulelor proliferative. Parametrii antigenici ai celulelor RS-1 latente diferă de spectrul antigenelor celulelor progenitoare stromale angajate cu proliferare rapidă. S-a stabilit că o rată mare de proliferare a celulelor progenitoare angajate se observă doar în prezența celulelor RS-1. La rândul lor, celulele RS-1 își cresc rata de creștere sub influența factorilor secretați de cele mai mature derivate ale celulelor progenitoare mezenchimale multipotente. Se pare că celulele RS-1 sunt o subclasă de MSC-uri neangajate capabile de reciclare. In vitro, celulele progenitoare stromale ale măduvei osoase rezistente la 5-fluorouracil sunt caracterizate printr-un conținut scăzut de ARN și o expresie ridicată a genei ornitin decarboxilază, un marker al celulelor neproliferative.

Proliferarea intensivă a celulelor progenitoare stromale începe după fixarea lor pe substrat. În acest caz, profilul markerilor celulelor slab diferențiate este exprimat: SH2 (receptor TGF-(3)), SH3 (domeniu proteic de semnalizare), colagen tipurile I și III, fibronectină, receptori de adeziune VCAM-1 (CD106) și ICAM (CD54), caderină-11, CD44, CD71 (receptor de transferină), CD90, CD120a și CD124, dar fără exprimarea markerilor caracteristici ai celulelor stem hematopoietice (CD34, CD14, CD45). Creșterea clonală face posibilă trecerea repetată a celulelor stem mezenchimale cu formarea a numeroase celule pluripotente progenitoare stromale genetic omogene în cultură. După 2-3 treceri, numărul acestora ajunge la 50-300 de milioane. Într-o cultură cu densitate suficientă, după oprirea proliferării, celulele progenitoare stromale, spre deosebire de fibroblastele țesutului hematopoietic, se diferențiază în adipocite, miocite, celule cartilaginoase și osoase. O combinație a trei semnale de diferențiere reglatoare, inclusiv 1-metil-izobutilxantina (un inductor al formării intracelulare a cAMP), dexametazona (un inhibitor al fosfolipazelor A și C) și indometacina (un inhibitor al ciclooxigenazei, care reduce și activitatea tromboxan sintazei), transformă până la 95% din celulele mezenchimale progenitoare în adipocite. Formarea adipocitelor din elemente stromale imature este confirmată prin exprimarea genei lipoproteinlipazei, detectarea histochimică a apolipoproteinelor și a receptorilor peroxizomali. Celulele aceleiași clone sub influența TGF-b într-un mediu fără ser creează o populație omogenă de condrocite. Cultura celulară multistrat a acestui țesut cartilaginos este caracterizată printr-o matrice intercelulară dezvoltată, formată din proteoglican și colagen de tip II. Într-un mediu nutritiv cu 10%, efectul unui complex semnal de diferențiere format din b-glicerofosfat (un donor de fosfat anorganic), acid ascorbic și dexametazonă în aceeași cultură de celule progenitoare stromale duce la formarea de agregate celulare. În astfel de celule, se observă o creștere progresivă a activității fosfatazei alcaline și a nivelului de osteopontină, indicând formarea țesutului osos, a cărui mineralizare a celulelor este confirmată de o creștere progresivă a conținutului intracelular de calciu.

Conform unor date, capacitatea celulelor stem mezenchimale de a se diviza și reproduce nelimitat diferite tipuri de celule ale liniei de diferențiere mezenchimale este combinată cu un grad ridicat de plasticitate. Atunci când sunt introduse în ventricule sau în substanța albă a creierului, celulele stem mezenchimale migrează către parenchimul țesutului nervos și se diferențiază în derivate ale liniei celulare gliale sau neuronale. În plus, există informații despre transdiferențierea MSC-urilor în celule stem hematopoietice atât in vitro, cât și in vivo. O analiză mai aprofundată în cadrul unor studii a determinat o plasticitate excepțional de ridicată a MSC-urilor, care se manifestă prin capacitatea lor de a se diferenția în astrocite, oligodendrocite, neuroni, cardiomiocite, celule musculare netede și celule musculare scheletice. O serie de studii privind potențialul de transdiferențiere al MSC-urilor in vitro și in vivo au stabilit că celulele progenitoare mezenchimale multipotente de origine din măduva osoasă se diferențiază terminal în linii celulare care formează țesut osos, cartilaj, muscular, nervos și adipos, precum și tendoane și stromă care susțin hematopoieza.

Cu toate acestea, alte studii nu au reușit să evidențieze semne de restricție a pluripotenței genomului celulelor stem mezenchimale și a populațiilor progenitoare de celule stromale, deși au fost studiate peste 200 de clone de MSC izolate dintr-o cultură primară pentru a testa posibila pluripotență a celulelor stromale. Marea majoritate a clonelor in vitro și-au păstrat capacitatea de a se diferenția în direcții osteogenice, condrogenice și adipogenice. Excluzând probabilitatea migrării celulelor receptoare prin transplantul de celule stem mezenchimale sub capsula renală sau în camere de difuzie, s-a constatat că celulele progenitoare stromale in situ păstrează un fenotip eterogen, ceea ce indică fie absența factorilor de restricție în zona de transplant, fie absența pluripotenței MSC ca atare. În același timp, este admisă existența unui tip rar de celule stem pluripotente somatice, care sunt precursori comuni ai tuturor celulelor stem adulte.

Multipotența, dar nu pluripotența, celulelor stem mezenchimale adevărate, care constituie o proporție foarte mică din celulele măduvei osoase și sunt capabile să prolifereze în anumite condiții în timpul cultivării in vitro fără a se diferenția, este evidențiată prin angajamentul lor indus la celulele osoase, cartilajale, adipose, musculare, precum și la tenocite și elemente stromale care susțin hematopoieza. De regulă, expunerea prelungită la un mediu de cultură cu ser fetal de vițel provoacă eliberarea de MSC-uri în celulele progenitoare stromale angajate, a căror descendență suferă o diferențiere terminală spontană. In vitro, este posibil să se obțină formarea țintită a osteoblastelor prin adăugarea de dexametazonă, β-glicerofosfat și acid ascorbic în mediul de condiționare, în timp ce o combinație de semnale de diferențiere cu dexametazonă și insulină induce formarea de adipocite.

S-a stabilit că, înainte de a intra în stadiul de diferențiere terminală, celulele stem mezenchimale mezenchimale (MSC) din măduva osoasă se diferențiază inițial în celule stem mezenchimale de tip fibroblast, în anumite condiții de cultură. Derivații acestor celule in vivo participă la formarea oaselor, cartilajului, tendoanelor, țesutului adipos și muscular, precum și a stromei care susține hematopoieza. Mulți autori înțeleg termenul „celule progenitoare mezenchimale multipotente” ca însemnând atât MSC-urile în sine, cât și celulele progenitoare stromale dedicate ale măduvei osoase și țesuturilor mezenchimale. Analiza clonală a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente de origine a măduvei osoase a arătat că puțin peste o treime din toate clonele se diferențiază în osteo-, condro- și adipocite, în timp ce celulele clonelor rămase au doar potențial osteogenic și formează doar condro- și osteocite. O clonă de celule progenitoare mezenchimale multipotente, cum ar fi BMC-9, în condiții microambientale adecvate, se diferențiază în celule cu fenotipul și caracteristicile funcționale nu doar ale osteoblastelor, condrocitelor și adipocitelor, ci și ale celulelor stromale care susțin hematopoieza. O clonă de celule RCJ3.1 izolată din măduva osoasă fetală de șobolan se diferențiază în celule mezenchimale cu diverse fenotipuri. Sub acțiunea combinată a acidului ascorbic, b-glicerofosfatului și dexametazonei, elementele celulare ale acestei clone formează mai întâi miocite multinucleare, apoi, secvențial, adipocite, condrocite și insulițe de țesut osos mineralizat. Populația de celule granulare din periostul fetușilor de șobolan corespunde celulelor progenitoare mezenchimale multipotente necompromise, deoarece este caracterizată printr-o rată scăzută de proliferare, nu exprimă markeri de diferențiere și, în condiții de cultură, se diferențiază pentru a forma condro-, osteo- și adipocite, precum și celule musculare netede.

Prin urmare, trebuie recunoscut faptul că problema pluripotenței sau multipotenței genomului celulelor stem mezenchimale rămâne deschisă, ceea ce, în consecință, afectează și ideile despre potențialul de diferențiere al celulelor progenitoare stromale, care, de asemenea, nu a fost stabilit definitiv.

O caracteristică importantă și dovedită experimental a celulelor stem mezenchimale este capacitatea lor de a părăsi nișa tisulară și de a circula în fluxul sanguin general. Pentru a activa programul de diferențiere genetică, astfel de celule stem circulante trebuie să intre în micromediul adecvat. S-a demonstrat că, odată cu introducerea sistematică a MSC-urilor în fluxul sanguin al animalelor receptoare, celulele imature sunt implantate în diverse organe și țesuturi, apoi diferențiendu-se în celule sanguine, miocite, adipocite, condrocite și fibroblaste. În consecință, în zonele tisulare locale, apar interacțiuni de reglare a semnalului între celulele progenitoare stromale neangajate și angajate, precum și între acestea și celulele mature din jur. Se presupune că diferențierea este indusă de factori de reglare paracrini de origine mezenchimală și non-mezenchimală (factori de creștere, eicosanoizi, molecule ale matricei extracelulare), care asigură conexiuni spațiale și temporale în micromediul celulelor progenitoare mezenchimale multipotente. Prin urmare, deteriorarea locală a țesutului mezenchimal ar trebui să ducă la formarea unor zone ale micromediului celulelor progenitoare mezenchimale multipotente, care sunt calitativ diferite de complexul de semnale reglatoare ale țesuturilor intacte, în care au loc procese de regenerare fiziologice mai degrabă decât reparative. Această diferență este extrem de importantă în ceea ce privește specializarea fenotipului celular în micromediul normal și în cel indus de deteriorare.

Conform conceptelor, aici se regăsesc mecanismele diferenței fundamentale dintre cele două procese cunoscute - regenerarea fiziologică și proliferarea inflamatorie. Primul dintre ele se încheie cu restaurarea compoziției celulare specializate a țesutului și a funcției sale, în timp ce rezultatul implementării procesului de proliferare este formarea elementelor de țesut conjunctiv matur și pierderea funcției zonei țesutului deteriorat. Astfel, pentru a dezvolta programe optime de utilizare a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente în medicina regenerativ-plastică, este necesar un studiu amănunțit al caracteristicilor impactului factorilor microambientali asupra diferențierii MSC-urilor.

Dependența structurii compartimentului celulelor stem de regulatorii celulari para- și autocrini, a căror expresie este modulată de semnale externe, este incontestabilă. Printre funcțiile factorilor de reglare, cele mai importante sunt controlul diviziunii asimetrice a MSC-urilor și expresia genelor care determină etapele de angajament și numărul de diviziuni celulare. Semnalele externe, de care depinde dezvoltarea ulterioară a MSC-urilor, sunt furnizate de micromediul lor. Într-o stare imatură, MSC-urile proliferează mult timp, menținând în același timp capacitatea de a se diferenția în linii de adipocite, miofibroblaste, stromă a țesutului hematogen, celule cartilaginoase și osoase. S-a stabilit că o populație limitată de elemente celulare stromale CD34-negative care circulă în sânge se întoarce din fluxul sanguin general în stroma măduvei osoase, unde este transformată în linii de celule stem hematopoietice CD34-pozitive. Aceste observații sugerează că recircularea celulelor mezenchimale progenitoare în fluxul sanguin menține echilibrul tisular al celulelor stem stromale din diferite organe prin mobilizarea unui grup comun de elemente stromale imature ale măduvei osoase. Diferențierea MSC-urilor în celule cu fenotipuri mezenchimale multiple și participarea lor la regenerarea sau repararea osului, cartilajului, țesutului adipos și tendoanelor in vivo a fost demonstrată folosind modele de transfer adoptiv la animale experimentale. Conform altor autori, migrarea la distanță a MSC-urilor de-a lungul patului vascular este combinată cu mișcarea pe distanțe scurte sau locală a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente în interiorul țesutului în timpul reparării cartilajului, regenerării musculare și altor procese de restaurare.

Rezervele locale ale țesutului stromal acționează ca o sursă de celule în procesele de regenerare fiziologică a țesuturilor și sunt completate prin transportul la distanță al MSC-urilor pe măsură ce resursele țesutului stromal sunt consumate. Cu toate acestea, în condițiile necesității mobilizării de urgență a potențialului celular reparativ, de exemplu, în cazul politraumatismelor, întregul eșalon de MSC participă la procesele de regenerare reparativă, iar celulele progenitoare mezenchimale ale măduvei osoase sunt recrutate la periferie prin fluxul sanguin general.

Transplantul de celule stem mezenchimale

Se pot observa anumite paralele între procesele de regenerare fiziologică a țesuturilor și formarea acestora în timpul dezvoltării intrauterine. În embriogeneza umană și la mamifere, formarea diferitelor tipuri de celule specializate are loc din grupul ecto-, mezo- și endodermal al straturilor germinale, dar cu participarea obligatorie a mezenchimului. Rețeaua celulară laxă de țesut mezenchimal embrionar îndeplinește numeroase funcții de reglare, metabolice, de cadru și morfogenetice. Depunerea organelor provizorii are loc numai după condensarea mezenchimului datorită creșterii clonogenetice a celulelor progenitoare, care generează semnalele morfogenetice primare ale organogenezei. Derivatele stromale ale mezenchimului embrionar creează cadrul celular al organelor provizorii și formează baza pentru viitoarea lor alimentare energetică-plastică datorită creșterii vaselor sanguine și limfatice primare. Cu alte cuvinte, elementele stromale ale unității microcirculatorii a organelor fetale apar înainte de formarea unităților lor structurale și funcționale. În plus, migrarea activă a celulelor mezenchimale în timpul organogenezei asigură orientarea spațială a organelor în curs de dezvoltare prin marcarea limitelor lor de volum prin restricționarea tipurilor Hox homeotice. Cadrul stromal servește și ca bază pentru asamblarea unităților structurale și funcționale ale organelor parenchimatoase, care includ adesea celule complet diferite din punct de vedere morfogenetic și funcțional. Prin urmare, în timpul embriogenezei, funcțiile mezenchimului sunt primare și se realizează prin generarea de semnale de reglare care activează proliferarea regională și diferențierea celulelor epiteliale progenitoare. Celulele mezenchimale embrionare produc factori de creștere precum HGF-β, HGF-β, CSF, pentru care celulele progenitoare parenchimatoase au receptori corespunzători. În țesutul matur diferențiat al unui organism adult, rețeaua stromală de celule generează, de asemenea, semnale pentru a menține viabilitatea și proliferarea celulelor progenitoare de origine non-mezenchimală. Cu toate acestea, spectrul semnalelor de reglare stromale în ontogeneza postnatală este diferit (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF etc.) și are ca scop asigurarea regenerării fiziologice sau repararea zonelor tisulare deteriorate. Mai mult, caracteristicile spectrale ale factorilor de reglare stromală în fiecare tip de țesut și chiar în cadrul unui singur organ sunt diferite. În special, hematopoieza și limfopoieza cu proliferarea și diferențierea celulelor hematopoietice și imunocompetente apar doar în anumite organe, în limitele cărora funcționează micromediul stromal, oferind condiții pentru maturarea celulelor hematopoietice și limfoide. Capacitatea celulelor hematopoietice și limfoide de a repopula un anumit organ, de a prolifera și de a se maturiza în nișele sale microstructurale depinde de factorii de reglare ai micromediului.

Printre componentele matricei extracelulare pe care celulele progenitoare mezenchimale multipotente le produc, trebuie menționate fibronectina, laminina, colagenul și proteoglicanii, precum și CD44 (receptorul de hialuronan și osteopontină), care joacă un rol major în organizarea interacțiunilor intercelulare și formarea matricei extracelulare în măduva osoasă și țesutul osos. S-a dovedit că celulele progenitoare mezenchimale multipotente din măduva osoasă creează un micromediu stromal care furnizează semnale inductive și reglatoare nu numai celulelor stem mezenchimale (MSC), ci și progenitorilor hematopoietici și altor celule stem non-mezenchimale din măduva osoasă. Se știe că participarea MSC la hematopoieză este determinată de capacitatea lor de a se diferenția în celule stromale care susțin hematopoieza, iar acest semnal instructiv este recepționat de MSC direct de la celulele stem hematopoietice. Acesta este motivul pentru care, în cultură, rețeaua de celule progenitoare stromale servește drept bază hrănitoare pentru dezvoltarea tuturor clonelor de celule hematopoietice.

Într-un organism matur, intensitatea hemo- și limfopoiezei se află într-o stare de echilibru dinamic cu „cheltuielile” celulelor sanguine mature și ale celulelor sistemului imunitar de la periferie. Deoarece celulele stromale ale măduvei osoase și ale organelor limfoide se reînnoiesc extrem de rar, nu are loc o restructurare semnificativă a structurilor stromale din acestea. Sistemul poate fi scos din echilibrul dinamic prin deteriorarea mecanică a oricăruia dintre organele hemo- sau limfopoiezei, ceea ce duce la modificări secvențiale uniforme care privesc nu numai și nu atât elementele hematopoietice sau limfoide, cât structurile stromale ale organului deteriorat. În procesul de regenerare reparativă, se formează mai întâi baza stromală, care este apoi repopulată de celule hematopoietice sau imunocompetente. Acest fapt cunoscut de mult timp face din regenerarea post-traumatică un model convenabil pentru studierea micromediului stromal al organelor hematopoietice. În special, golirea mecanică a cavității medulare a oaselor tubulare este utilizată pentru a studia regenerarea reparativă a măduvei osoase - chiuretajul, care permite îndepărtarea rapidă și eficientă a țesutului hematopoietic din starea de echilibru dinamic. Studiind procesele de regenerare reparativă a componentelor hematopoietice și stromale ale măduvei osoase după golirea mecanică a cavității medulare a tibiei la cobai, s-a constatat că nu există o corelație directă între indicii de regenerare a celulelor hematopoietice și stromale (numărul de celule hematopoietice, concentrația și numărul de celule progenitoare stromale). În plus, s-a constatat că o creștere a populației de celule progenitoare stromale are loc la un moment mai devreme după chiuretaj, iar fibroblastele stromale însele devin fosfatază-pozitive, ceea ce este tipic țesutului osteogen. De asemenea, s-a stabilit că chiuretajul a 3-5 oase tubulare duce la creșterea acestei populații celulare în măduva osoasă a oaselor neoperate și chiar în splină, care la cobai este un organ exclusiv limfopoietic.

Tabloul morfologic al proceselor reparative din măduva osoasă a tibiilor chiuretate de la cobai corespunde, în general, datelor descrise în literatura de specialitate obținute în experimente pe animale din alte specii, iar dinamica modificărilor care apar după îndepărtarea țesutului hematopoietic este aceeași pentru toate speciile de animale, iar diferența privește doar parametrii de timp. Din punct de vedere morfologic, ordinea fazelor de restaurare a hematopoiezei în cavitatea medulară golită constă în procese succesive de organizare a cheagului de sânge, formarea țesutului osos fibros grosier, resorbția acestuia, dezvoltarea sinusoidelor și formarea stromei reticulare, care este ulterior repopulată cu elemente hematopoietice. În acest caz, numărul de celule hematopoietice progenitoare în procesul de regenerare a țesutului măduvei osoase crește în paralel cu creșterea conținutului de celule stem hematopoietice.

Yu. Gerasimov și coautorii (2001) au comparat modificările numărului de celule hematopoietice și numărul de celule progenitoare stromale în fazele individuale ale procesului de regenerare. S-a constatat că modificările cantitative ale celulelor măduvei osoase din osul chiuretat corespund dinamicii caracteristicilor morfologice ale regenerării. Autorii asociază scăderea conținutului celular din regenerat în primele trei zile cu moartea celulelor hematopoietice din cauza efectului nefavorabil al micromediului creat de țesutul reticular proliferativ în măduva osoasă conservată în regiunea epifizei, precum și cu formarea de focare de țesut osteoid în aceasta din urmă și cu leziuni vasculare în timpul chiuretajului. În ziua 7-12, o creștere a nivelului de celule nucleate coincide cu apariția focarelor individuale de hematopoieză mieloidă în zonele de proliferare a elementelor stromale. În ziua 20, apar zone semnificative de măduvă osoasă regenerată și sinusuri bine dezvoltate, ceea ce este însoțit de o creștere semnificativă a numărului total de celule. Cu toate acestea, numărul de elemente hematopoietice în această perioadă este de 68% din nivelul de control. Acest lucru este în concordanță cu datele publicate anterior, conform cărora numărul de celule hematopoietice după chiuretaj atinge norma abia în ziua 35-40 după operație.

În perioada post-traumatică incipientă, principala sursă pentru restaurarea hematopoiezei sunt elementele celulare locale conservate în timpul chiuretajului. În etapele ulterioare, principala sursă de regenerare a țesutului hematopoietic al măduvei osoase sunt celulele stem care repopulează zonele stromale libere. În ceea ce privește categoriile individuale de celule stromale (endoteliale, reticulare și osteogene), sursele care asigură formarea lor în timpul reorganizării cavității măduvei osoase rămân neclare. Rezultatele studiului realizat de Yu. V. Gerasimov și coautorii (2001) indică faptul că în măduva osoasă conservată după chiuretaj, concentrația celulelor care formează colonii de fibroblaste este semnificativ mai mare decât în măduva osoasă normală. Autorii consideră că chiuretajul are ca rezultat o spălare selectivă mai intensă a celulelor hematopoietice în comparație cu celulele stromale formatoare de colonii, care participă la formarea stromei și sunt mai puternic asociate cu substanța sa principală decât celulele hematopoietice.

Dinamica modificării numărului de celule care formează colonii de fibroblaste se corelează cu intensitatea proceselor de osteogeneză, resorbția ulterioară a trabeculelor osoase și formarea stromei reticulare, care este populată de celule hematopoietice. Majoritatea celulelor progenitoare stromale, în termenii specificați de regenerare, formează țesut osos fibros grosier și stromă reticulară. În cazul fracturilor femurale în condiții de osteosinteză prelungită, în a 5-a zi în zona de regenerare, concentrația și numărul de celule care formează colonii de fibroblaste cresc, iar în perioada de formare osoasă intensivă numărul acestora crește de 6 ori. Se știe că celulele măduvei osoase care formează colonii de fibroblaste au proprietăți osteogenice. Numărul de celule progenitoare stromale crește înainte de așezarea teritoriului măduvei osoase chiuretat de către celulele hematopoietice. Acest lucru este în bună concordanță cu datele conform cărora celulele stromale asigură formarea unui micromediu hematopoietic. Se pare că crearea unui micromediu hematopoietic corespunde unui anumit nivel de regenerare a țesutului stromal, iar numărul de celule hematopoietice crește odată cu extinderea platformei stromale adecvate hematopoiezei.

De cel mai mare interes sunt datele autorilor conform cărora imediat după chiuretaj crește numărul de celule progenitoare stromale din părțile îndepărtate ale scheletului. Începând cu a șasea oră și până în a douăzecea zi inclusiv, se observă o creștere de peste două ori atât a concentrației, cât și a numărului de celule care formează colonii de fibroblaste în tibia contralaterală. Mecanismul acestui fenomen este probabil asociat cu faptul că leziunile masive ale măduvei osoase duce la formarea unui număr mare de cheaguri de sânge cu distrugerea simultană a unui număr semnificativ de trombocite și eliberarea factorului de creștere derivat din trombocite (PDGF) în sânge, despre care se știe că provoacă proliferarea celulelor care formează colonii de fibroblaste situate în organism în afara bazinului proliferativ. În experimentele pe iepuri, administrarea locală de MSC promovează restaurarea țesutului cartilaginos al articulației genunchiului afectate chirurgical, ceea ce poate fi asociat cu formarea de condrocite provenite din MSC-urile injectate. Cu toate acestea, regenerarea reparativă a defectelor osoase la șobolanii de laborator este semnificativ îmbunătățită prin utilizarea celulelor stem mezenchimale închise într-un cadru ceramic. Prin urmare, se poate presupune că, dacă nu RBOC, atunci un alt factor provenit din celulele stromale deteriorate exercită un efect stimulator distal asupra proliferării celulelor progenitoare mezenchimale în zonele intacte ale măduvei osoase și stimulează migrarea acestora către zona defectului măduvei osoase. La rândul său, acest lucru este contrazis de datele din literatura de specialitate din anii precedenți care indică faptul că celulele stromale responsabile de micromediu, spre deosebire de celulele hematopoietice, nu sunt capabile de migrare și provin din surse locale.

Cu toate acestea, rezultatele studiului realizat de Yu. Gerasimov și coautorii (2001) indică faptul că traumatismele mecanice provoacă nu numai o restructurare bruscă a țesutului stromal în osul chiuretat, ci și modificări semnificative ale stromei în oasele intacte aflate la distanță, adică există un răspuns sistemic al țesutului stromal la traumatismul local. Mai mult, atunci când se aplică politraumatisme - chiuretaje multiple - această reacție este accentuată și se observă nu numai în osul operat și în părțile îndepărtate ale scheletului, ci și în organele limfoide, în special în splină. Mecanismul unui astfel de răspuns sistemic al țesutului stromal al măduvei osoase și al splinei la traumatisme și politraumatisme locale rămâne necunoscut. Se presupune că acest proces este asociat cu acțiunea unui factor umoral secretat de stroma mezenchimală a cavității medulare a măduvei osoase. Posibilitatea producerii de către celulele stromale ale măduvei osoase și splinei a unui factor umoral nespecific organului, responsabil de proliferarea celulelor care formează colonii de fibroblaste, este evidențiată de datele privind activitatea lor de stimulare a coloniilor în culturile monostrat de măduvă osoasă.

În acest sens, este demn de remarcat faptul că, prin administrarea sistemică a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente, derivații acestora repopulează nu numai măduva osoasă, ci și alte țesuturi, ceea ce este utilizat, în special, pentru terapia genică. S-a demonstrat că, prin administrarea intravenoasă a unor cantități mari de MSC cu genom de tip sălbatic la șoareci cu o mutație în gena colagenului I, celulele donatoare înlocuiesc până la 30% din celulele din țesutul osos și cartilaj al receptorilor, iar celulele stem mezenchimale de șoarece transfectate care secretă IL-3 umană susțin eficient hematopoieza timp de 9 luni în cazul administrării lor simultane cu celule stem hematopoietice umane la șoareci imunodeficienți.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Modificarea genetică a celulelor stem mezenchimale

Printre succesele modificării genetice experimentale a MSC-urilor, merită menționată transfecția genei factorului IX în MSC-uri umane cu transfer ulterior al celulelor transfectate la șoareci imunodeficienți, ceea ce duce la apariția factorului B antihemofilic în sânge timp de 8 săptămâni după transplant. În acest experiment, modificarea post-translațională a factorului IX prin y-glutamil carboxilază a fost efectuată în celulele transfectate. Transducția MSC-urilor cu un vector retroviral care codifică factorul IX uman a fost mai puțin reușită - administrarea ulterioară a acestor celule la un câine cu hemofilie B a furnizat un nivel terapeutic de factor IX, menținând intensitatea normală a hemostazei de coagulare, timp de doar 12 zile.

Transplantarea de celule stem mezenchimale în parenchimul cerebral al animalelor a demonstrat că celulele imature ale donatorului sunt transformate atât în populații neuronale, cât și gliale. Grefarea derivatelor neuronale din țesutul mezenchimal sănătos al donatorului face teoretic posibilă corectarea anomaliilor genetice ale metabolismului cerebral la pacienții cu boala Gaucher și alte tulburări ale metabolismului lipidic, gangliozidic sau carbohidraților.

Căutarea experimentală a condițiilor pentru transdiferențierea celulelor stem stromale din măduva osoasă în celule progenitoare ale țesutului neuronal și hepatic este în curs de desfășurare. Atenția cercetătorilor este concentrată pe combinații de inductori de diferențiere și medii speciale condiționate. În special, pentru a izola cultura primară a celulelor stromale, celulele din măduva osoasă spălate și resuspendate în mediu de cultură DMEM/F12 (1/1) cu 10% ser fetal de vițel sunt însămânțate la o densitate de 200.000/cm2. După 24 de ore, celulele neaderente sunt îndepărtate, iar celulele asemănătoare fibroblastelor atașate la plastic sunt cultivate timp de o săptămână. Pentru diferențierea celulelor stromale din măduva osoasă în neuroblaste, se utilizează un mediu condiționat obținut prin cultivarea timp de trei zile a culturii primare de fibroblaste embrionare de șoarece, precum și mediu DMEM/F12 (1/1) cu 2% ser fetal de vițel și adăugarea de 20 ng/ml NF sau acid retinoic 10-6 M (neuroinductori utilizați pentru diferențierea neuronală a celulelor stem embrionare de șoarece și uman). Diferențierea celulelor stromale din măduva osoasă în celule precursoare hepatocitare este indusă într-un mediu condiționat creat ca urmare a cultivării timp de trei zile a culturii primare de celule hepatice embrionare de șoarece în mediu DMEM/F12 (1/1) cu adăugarea de 10% ser fetal de vițel.

Aici trebuie remarcat încă o dată faptul că celulele formatoare de colonii din stroma măduvei osoase sunt heteromorfe și pot fi împărțite în două tipuri. Primul tip include celule asemănătoare fibroblastelor care formează filopodii cu nuclei mari și unul sau doi nucleoli. Al doilea tip este reprezentat de celule mici, fusiforme. La cultivarea celulelor de ambele tipuri într-un mediu condiționat obținut pe un strat hrănitor de fibroblaste embrionare primare de șoarece, celule similare neuroblastelor apar în cultură în a 3-a până la a 4-a zi. În această etapă, acestea au cel mai adesea o formă fusiformă, cu unul sau două procese lungi care se termină în filopodii. Mai puțin frecvente sunt celulele piramidale sau stelate cu dendrite scurte. Dendritele unor neuroblaste au expansiuni caracteristice (muguri de creștere) și ramificații în partea lor distală, în timp ce altele au conuri de creștere distincte cu filopodii, prin care cresc dendritele. Caracteristici morfologice similare (muguri și conuri de creștere cu filopodii) inerente neuroblastelor care se diferențiază în neuroni au fost descrise în detaliu în studiile privind neurogeneza. Pe baza acestui fapt, unii autori concluzionează că celulele pe care le-au găsit în cultură sunt neuroblaste. În special, E. Shchegelskaya și coautorii (2002), după ce au cultivat o cultură primară de celule stromale timp de două săptămâni într-un mediu condiționat schimbat la fiecare 3-4 zile, au descoperit că unele dintre celule au proliferat, menținând în același timp o stare nediferențiată. În exterior, astfel de celule semănau cu fibroblastele și au fost detectate în cultură împreună cu neuroblastele în curs de diferențiere. Majoritatea celulelor (aproximativ 80%) se aflau în diferite stadii de diferențiere în celule ale țesutului nervos, în principal în neuroni. Procesele dendritice ale acestor celule erau în contact strâns unele cu altele, astfel încât celulele au format treptat secțiuni ale rețelei nervoase pe substrat sub formă de catene multicelulare lungi. Procesele dendritice ale neuroblastelor au devenit semnificativ mai lungi, unele dintre ele depășind lungimea corpului neuronului în sine de 8-10 ori. Proporția celulelor piramidale și stelate a crescut treptat. Dendritele celulelor stelate s-au ramificat. Conform autorilor, diferențierea ulterioară a celulelor piramidale și stelate, comparativ cu celulele fusiforme, corespunde secvenței etapelor neurogenezei normale la animale. Drept urmare, autorii concluzionează că celulele stem stromale din măduva osoasă suferă neurogeneză indusă, timp în care toate cele trei tipuri principale de neuroni se formează din neuroblaste in vitro. Precursori ai celulelor nervoase au fost, de asemenea, detectați în timpul cultivării celulelor stromale din măduva osoasă timp de 3-4 zile într-un mediu cu 2% ser fetal și 20 ng/ml LIF. Dar, în acest caz, celulele stem s-au divizat foarte lent, diferențierea neuroblastelor a avut loc doar în 30% din cazuri și acestea nu au format rețele neuronale. Folosind acidul retinoic ca unul dintre inductorii diferențierii celulelor nervoase, autorii au obținut până la 25-30% din celulele nervoase din cultură.cu elemente gliale predominant - astrocite și oligodendrocite. Neuronii au constituit doar o treime din totalul celulelor nervoase, deși au fost reprezentați de toate cele trei tipuri: celule fusiforme, piramidale și stelate. În a 6-a zi de cultivare a celulelor stromale într-un mediu cu acid retinoic, celulele nervoase au devenit mai diferențiate, iar axonii au fost găsiți în neuronii piramidali individuali, care în neuroontogeneza normală apar mai târziu decât formarea proceselor dendritice. Potrivit autorilor, în ciuda randamentului scăzut de celule nervoase, metoda de inducție cu acid retinoic are avantajele sale: oligodendrocitele și astrocitele îndeplinesc funcții mielinizante și nutriționale în timpul creșterii dendritelor și axonilor și sunt necesare pentru formarea normală a țesutului nervos. Prin urmare, pentru repararea zonelor deteriorate ale acestuia in vivo, este mai bine să se utilizeze o suspensie de neuroni îmbogățită cu celule gliale.

În a doua serie de experimente, autorii au încercat să inducă diferențierea celulelor stromale din măduva osoasă în celule hepatice. După trei zile de cultivare a celulelor stem stromale din măduva osoasă într-un mediu condiționat obținut prin incubarea hepatocitelor embrionare de șoarece, s-au găsit celule mari, sferice, adesea binucleare, cu incluziuni citoplasmatice de diferite dimensiuni. Aceste celule se aflau în diferite stadii de diferențiere și diferă în ceea ce privește dimensiunea, numărul de nuclei și incluziunile din citoplasmă. Glicogenul a fost detectat în majoritatea acestor celule, pe baza căruia autorii le-au identificat drept celule precursoare ale hepatocitelor. Întrucât în cultură nu s-au găsit celule similare neuroblastelor, s-a concluzionat că mediul condiționat obținut ca urmare a cultivării hepatocitelor embrionare nu conținea factori de diferențiere ai celulelor nervoase și, dimpotrivă, conținea factori care induc diferențierea celulelor stromale din măduva osoasă în celule precursoare ale hepatocitelor. În concluzie, autorii sugerează prezența pluripotenței în celulele stromale din măduva osoasă, deoarece acestea se diferențiază in vitro în celule nervoase sau hepatice, în funcție de mediile condiționate specifice și de inductorii utilizați.

Unele studii au demonstrat într-adevăr corect diferențierea celulelor stromale din măduva osoasă în cardiomiocite, celule cartilaginoase, osoase și nervoase. Există dovezi că printre celulele măduvei osoase există populații de celule stem capabile să se diferențieze în hepatocite. Având în vedere aceste date, rezultatele experimentelor de mai sus pe șoareci pot fi considerate o confirmare suplimentară a prezenței în măduva osoasă a celulelor stem mezenchimale pluripotente capabile să se diferențieze în celule ale diferitelor țesuturi ale unui organism adult.

Transplantul de celule stem mezenchimale

În transplantologia clinică, celulele stem mezenchimale umane pot fi utilizate pentru a asigura extinderea celulelor stem hematopoietice, precum și a descendenților lor pre-angajați timpurii. În special, introducerea celulelor stem hematopoietice autologe și a MSC-urilor la pacienții cu cancer după chimioterapie cu doze mari accelerează restabilirea numărului de neutrofile și trombocite din sângele periferic. Alo- și autotransplanturile de celule stem mezenchimale sunt utilizate pentru a trata mielomul multiplu, anemia aplastică și trombocitopenia spontană - boli asociate cu un defect primar în stroma țesutului hematopoietic. Eficiența terapiei celulare în patologia oncohematologică este în multe cazuri mai mare odată cu introducerea simultană a celulelor stem stromale și hematopoietice, ceea ce se manifestă printr-o reducere a perioadei postoperatorii de restabilire a hematopoiezei, o scădere a numărului de rezultate fatale din cauza distrugerii neselective a celulelor canceroase regionale și circulante, în care mor și propriile celule hematopoietice progenitoare ale pacientului. Perspectivele utilizării MSC și a altor celule progenitoare mezenchimale multipotente în practica clinică se datorează ușurinței relative de obținere a acestora din aspirate de măduvă osoasă, extinderii în cultură și transfecției genelor terapeutice. În același timp, implantarea locală a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente poate fi utilizată pentru a compensa defectele tisulare locale, iar în cazul disfuncțiilor sistemice ale țesuturilor de origine mezenchimală, introducerea lor în fluxul sanguin general nu este exclusă.

Autorii lucrărilor în care perspectivele utilizării MSC-urilor pentru transplant local, sistemic și terapie genică sunt analizate din punctul de vedere al biologiei celulelor stromale sunt mai precauți în raționamentul lor. Măduva osoasă postnatală este considerată în mod tradițional un organ format din două sisteme principale de linii celulare clar definite - țesutul hematopoietic în sine și stroma de susținere asociată acesteia. Prin urmare, celulele stem mezenchimale din măduva osoasă au fost inițial considerate exclusiv o sursă de bază stromală pentru producerea factorilor de reglare ai micromediului hematopoietic. Apoi, atenția cercetătorilor s-a îndreptat către studierea rolului MSC-urilor ca sursă stem de țesuturi scheletice. Cele mai recente date indică un potențial neașteptat pentru diferențierea celulelor stromale din măduva osoasă cu formarea de țesut neural sau muscular. Cu alte cuvinte, celulele stem mezenchimale prezintă plasticitate transgermală - capacitatea de a se diferenția în tipuri de celule fenotipic neînrudite cu celulele țesutului original. În același timp, unele aspecte ale biologiei celulelor stromale ale măduvei osoase rămân neclare și nerezolvate atât în termeni biologici generali, cât și în detalii individuale, inclusiv identificarea, natura, originea, dezvoltarea și funcția in vivo a celulelor stromale ale măduvei osoase, precum și potențialul de diferențiere admisibil ex vivo și posibilitățile de utilizare terapeutică in vivo. Datele obținute privind potențialul MSC-urilor, precum și rezultatele studiilor privind potențialul regenerativ al altor celule stem, sunt în contradicție puternică cu dogmele stabilite în biologie.

Atunci când sunt cultivate la densitate scăzută, celulele stem stromale din măduva osoasă formează colonii distincte, fiecare derivată dintr-o singură celulă progenitoare. Procentul de celule progenitoare stromale din celulele nucleate ale măduvei osoase, determinat de capacitatea de formare a coloniilor, depinde în mare măsură atât de condițiile de cultură, cât și de speciile de MSC. De exemplu, la rozătoare, prezența celulelor hrănitoare iradiate din măduva osoasă și a serului în cultură este absolut necesară pentru a obține numărul maxim de celule progenitoare stromale, în timp ce la om, eficiența de formare a coloniilor de către celulele stem mezenchimale este independentă atât de mediul de hrănire, cât și de mediul de cultură. Numărul de factori mitogenici cunoscuți care stimulează proliferarea celulelor progenitoare stromale este limitat. Aceștia includ PDGF, EGF, FGF, TGF-b și IGF1. În condiții optime de cultură, liniile MSC policlonale pot rezista la peste 50 de diviziuni celulare in vitro, ceea ce face posibilă obținerea de miliarde de celule stromale din măduva osoasă din 1 ml de aspirat.

Cu toate acestea, populația de celule stromale din măduva osoasă este eterogenă, ceea ce se manifestă atât prin variabilitatea dimensiunilor coloniilor, cât și prin ratele diferite de formare a acestora, precum și prin varietatea morfologiei celulare, care acoperă intervalul de la celule fusiforme asemănătoare fibroblastelor până la celule plate mari. În timpul dezvoltării unor astfel de culturi, se observă și heterogenitate fenotipică după 20 de zile. Unele colonii sunt caracterizate prin expresie ridicată a fosfatazei alcaline, altele nu o exprimă deloc, iar coloniile de al treilea tip sunt fosfatază-pozitive în regiunea centrală și fosfatază-negative la periferie. Coloniile individuale formează noduli de țesut osos (debutul mineralizării matricei este marcat prin colorare cu roșu de alizarină sau pentru calciu conform lui Van Koss). În alte colonii, are loc acumularea de grăsime, identificată prin colorare G cu roșu uleios. Mai rar, coloniile de celule stem mezenchimale formează cartilaje colorate cu albastru Alcian.

După transplantul ectopic la animale de experiment, liniile policlonale MGK formează os ectopic cu o stromă reticulară asociată cu mielopoieza și adipocite și, mai rar, cu țesut cartilaginos. Când se transplantează linii monoclonale de celule stromale din măduva osoasă, în unele cazuri se observă himerism, în care osul de novo este format din celule de țesut osos, conține stromă și adipocite de origine donator, în timp ce celulele liniei hematopoietice și ale sistemului vascular sunt derivate de la receptor.

Rezultatele acestor studii confirmă natura stem a celulei progenitoare stromale din măduva osoasă din care a fost derivată linia clonală. De asemenea, acestea indică faptul că nu toate celulele clonogene în cultură sunt cu adevărat celule stem multipotente. Unii cercetători cred, și noi împărtășim opinia lor, că cele mai fiabile informații despre potențialul real de diferențiere al clonelor individuale pot fi obținute doar in vivo după transplant și nu prin determinarea fenotipului derivatelor lor in vitro. Expresia în cultură a markerilor fenotipici ai osteo-, condro- sau adipogenezei (determinată prin ARNm sau prin tehnici histochimice) și chiar producerea de matrice mineralizată nu reflectă gradul de pluripotență al unei clone individuale in vivo. Prin urmare, identificarea celulelor stem într-un grup de celule stromale este posibilă doar a posteriori, în condițiile adecvate ale unui test de transplant biologic. În special, condrogeneza este foarte rar observată în sistemele de transplant deschise, în timp ce formarea cartilajului este departe de a fi neobișnuită în sistemele închise, cum ar fi camerele de difuzie sau culturile de micromasă in vitro ale celulelor stromale, unde se obține o tensiune locală scăzută de oxigen, ceea ce promovează formarea țesutului cartilaginos. Prin urmare, chiar și tehnica de transplantare, precum și condițiile nespecifice de cultură in vitro, afectează semnificativ gama de diferențiere a MSC.

Transplantul experimental în condiții experimentale specificate reprezintă standardul de aur pentru determinarea potențialului de diferențiere al celulelor stromale din măduva osoasă și un element cheie în identificarea acestora. Din punct de vedere istoric, studiile privind transplantul de celule stromale din măduva osoasă sunt asociate cu problema generală a transplantului de măduvă osoasă. S-a stabilit că micromediul hematopoietic este creat prin transplantul de linii celulare stromale din măduva osoasă și asigură dezvoltarea ectopică a țesutului hematopoietic în zona de transplant. Originea micromediului de la donator și a țesutului hematopoietic de la gazdă ne permite să considerăm osul ectopic ca un adevărat transplant de măduvă osoasă „inversat”. Transplantul local de celule stromale din măduva osoasă promovează corectarea eficientă a defectelor osoase, mai pronunțată decât în cazul regenerării reparative spontane. Mai multe studii preclinice pe modele experimentale au demonstrat în mod convingător posibilitatea utilizării transplanturilor de celule stromale din măduva osoasă în ortopedie, deși sunt necesare cele mai atente lucrări și analize pentru a optimiza aceste metode, chiar și în cele mai simple cazuri. În special, condițiile optime pentru extinderea celulelor stromale osteogene ex vivo nu au fost încă stabilite, structura și compoziția purtătorului ideal, precum și numărul de celule necesare pentru regenerarea osoasă volumetrică, rămân nedezvoltate.

Pe lângă utilizarea celulelor stromale din măduvă osoasă expandate ex vivo pentru regenerarea țesuturilor de origine mezenchimală, plasticitatea neortodoxă a MSC-urilor deschide potențiale aplicații pentru regenerarea celulelor neuronale sau pentru livrarea de produse genetice către SNC. În principiu, acest lucru simplifică terapia celulară pentru afectarea sistemului nervos, deoarece nu este nevoie să se obțină celule stem neuronale umane autologe. Au fost raportate potențiale aplicații ale celulelor din măduvă osoasă pentru generarea de cardiomiocite și celule progenitoare miogene, atât de origine stromală adevărată, cât și extrastromală.

Se desfășoară experimente privind transplantul sistemic de celule stromale din măduva osoasă pentru tratamentul bolilor scheletice comune. Nu există nicio îndoială că celulele stromale din măduva osoasă sunt populația responsabilă pentru tulburările genetice din bolile scheletice, ceea ce este bine ilustrat de transferul vectorial al informațiilor genetice folosind aceste celule, ceea ce duce la formarea de țesut osos patologic la animalele de experiment. Cu toate acestea, capacitatea celulelor stromale de a se implanta, grefa, prolifera și diferenția în oasele scheletice după introducerea în fluxul sanguin general nu a fost încă dovedită.

Acest lucru se datorează parțial faptului că în transplantul standard de măduvă osoasă, stroma nu este transplantată împreună cu țesutul hematopoietic, așadar nu au fost încă elaborate criterii stricte pentru evaluarea succesului grefării celulelor stromale administrate sistemic. Trebuie reținut faptul că prezența genelor marker în extractele de țesut sau izolarea celulelor de origine donatoare în cultură nu indică grefarea celulelor, ci doar supraviețuirea lor. Chiar și injectarea intra-arterială a celulelor stromale din măduva osoasă într-un membru de șoarece poate duce la grefare practic zero, în ciuda faptului că celulele de origine donatoare se găsesc în număr mare în microvasculatura măduvei osoase. Din păcate, astfel de celule sunt de obicei descrise ca fiind „grefate” pur și simplu pe baza detectării genelor marker pentru celulele donatoare în cultura ex vivo. În plus, trebuie furnizate dovezi convingătoare ale integrării pe termen lung a celulelor diferențiate și funcțional active de origine donatoare în țesuturile studiate. În multe lucrări publicate care raportează grefarea celulelor stromale din măduva osoasă în schelet, absența unor date clare de acest fel este izbitoare. Totuși, trebuie menționat că unele experimente corecte pe animale au stabilit într-adevăr o grefare limitată, dar reală, a celulelor progenitoare stromale după administrarea lor sistemică.

Aceste date sunt în concordanță cu rezultatele studiilor privind posibilitatea de a livra celule progenitoare miogene din măduva osoasă către mușchi prin intermediul sistemului vascular. Cu toate acestea, nu trebuie uitat faptul că atât țesutul scheletic, cât și cel muscular se formează în timpul dezvoltării și creșterii, pe baza mișcărilor celulare extravasculare care utilizează procese de migrație ce nu implică circulația sângelui. Dacă există o cale circulatorie independentă pentru livrarea celulelor progenitoare către țesuturile în fază solidă, este posibil să se presupună existența unor celule progenitoare mezenchimale circulante fiziologic? Care este originea acestor celule atât în organismul în curs de dezvoltare, cât și în cel postnatal și cum pătrund ele în peretele vascular? Soluționarea acestor întrebări pare absolut necesară și necesită cea mai atentă analiză preclinică. Chiar și după ce se găsesc răspunsuri la aceste întrebări, aspectele cinetice problematice asociate cu creșterea scheletică și remodelarea țesutului conjunctiv vor rămâne nerezolvate. În același timp, tratamentul tulburărilor de osteogeneză prin înlocuirea întregii populații de celule progenitoare scheletice mutate cu elemente stromale sănătoase pare a fi o perspectivă clinică reală. În acest caz, zonele de fractură locale sau deformările datorate osteogenezei patologice, precum și modificările distructive ale țesutului osos, pot fi corectate folosind celule stem stromale cultivate in vitro. Prin urmare, este recomandabil să se concentreze cercetările viitoare asupra problemelor de transformare sau corecție genetică a celulelor progenitoare osteogene mutate autologe ex vivo.

Ingineria genetică a celulelor, pe termen scurt sau permanent, a devenit baza biologiei celulare și moleculare, sursa multor descoperiri științifice privind rolul proteinelor individuale în metabolismul celular in vitro și in vivo. Utilizarea tehnologiilor moleculare pentru corectarea patologiei ereditare și a bolilor umane este foarte promițătoare pentru medicina practică, deoarece proprietățile celulelor stem stromale din măduva osoasă fac posibilă dezvoltarea de scheme unice de transplant pentru corectarea bolilor genetice ale scheletului. În același timp, celulele precursoare mezenchimale pot fi obținute cu ușurință de la viitorul receptor, sunt supuse manipulării genetice și sunt capabile să se multiplice în cantități mari într-o perioadă scurtă de timp. Utilizarea celulelor stem mezenchimale permite evitarea limitărilor și riscurilor asociate cu livrarea de material informațional genetic direct către pacient prin construcții vectoriale intravasculare. O strategie similară este aplicabilă celulelor stem embrionare, dar celulele stromale autologe postnatale din măduva osoasă sunt un material mai preferabil, deoarece introducerea lor exclude posibilele complicații imunologice post-transplant. Pentru a obține un efect pe termen scurt, de exemplu, pentru a accelera regenerarea osoasă, cea mai optimă metodă este modificarea genetică a celulelor stem mezenchimale folosind electroporarea, fuziunea chimică, lipofecția, plasmidele și construcțiile adenovirale. În special, transfecția virală în celule stromale ale măduvei osoase BMP-2 s-a dovedit eficientă în accelerarea regenerării osoase în politraumatismele experimentale. Crearea de construcții vectoriale adenovirale este preferabilă datorită absenței toxicității. Cu toate acestea, modificarea genetică a celulelor stromale ale măduvei osoase în acest caz este caracterizată de o stabilitate extrem de scăzută. În plus, celulele stromale ale măduvei osoase transformate normal necesită utilizarea unor vectori purtători de informații genetice care sunt de 10 ori mai infecțioși decât alte tipuri de celule, ceea ce crește semnificativ procentul de deces al celulelor transfectate.

Tratamentul bolilor recesive cauzate de activitatea biologică scăzută sau zero a anumitor gene necesită modificarea pe termen lung sau permanentă a celulelor stem mezenchimale, ceea ce impune utilizarea de virusuri adeno-asociate, retrovirusuri, lentivirusuri sau himere adeno-retrovirale. Regiunile de transport ale acestor virusuri sunt capabile să transfere transfecții de ADN mari (până la 8 kb). Literatura științifică a raportat deja despre activitatea biologică exogenă a celulelor stromale din măduva osoasă transfectate cu construcții retrovirale care codifică sinteza moleculelor reglatoare și marker - IL-3, CD2, factor VIII, precum și a enzimelor implicate în sinteza L-DOPA. Cu toate acestea, chiar și în aceste studii, autorii evidențiază o serie de limitări care trebuie depășite înainte de aplicarea practică a acestei tehnologii. Prima problemă este optimizarea procesului de modificare a MSC ex vivo. Se știe că proliferarea pe termen lung (3-4 săptămâni) a celulelor stromale din măduva osoasă in vitro reduce transfecția acestora. În același timp, pentru a atinge un nivel ridicat de modificare genetică a MSC-urilor, este necesară efectuarea mai multor cicluri de transfecție. A doua problemă este asociată cu durata expresiei genelor terapeutice, care nu depășește încă patru luni. O scădere naturală a expresiei genelor eficiente se datorează inactivării promotorului și morții celulelor modificate. Având în vedere perspectivele generale de transfer al informațiilor genetice utilizând celule stem mezenchimale, rezultatele studiilor preliminare indică necesitatea unei optimizări suplimentare a metodelor de transfecție ex vivo, a alegerii unui promotor adecvat care să regleze activitatea biologică în direcția dorită și a creșterii capacității celulelor stromale din măduva osoasă modificate de a se auto-întreține in vivo după transplant. Trebuie menționat că utilizarea construcțiilor retrovirale pentru modificarea celulelor stromale din măduva osoasă în direcția dorită nu necesită întotdeauna grefarea lor obligatorie. Celulele stem mezenchimale transfectate pot îndeplini o funcție corectivă pe fondul unei rezidențe stabile și fără încorporarea și funcționarea fizică activă obligatorie în țesutul conjunctiv. În acest caz, ele ar trebui considerate o mini-pompă biologică care produce in vivo un factor, a cărui deficiență determină manifestarea patologiei genetice.

Utilizarea celulelor stromale din măduva osoasă transformate pentru tratamentul patologiei genetice dominante, care se caracterizează prin exprimarea unei gene cu activitate biologică patologică sau anormală, este mult mai problematică, deoarece în acest caz este necesară blocarea transferului sau implementării informațiilor genetice distorsionate. Una dintre metodele ingineriei genetice este recombinarea omoloagă a celulelor stem embrionare pentru a crea animale transgenice. Cu toate acestea, gradul extrem de scăzut de recombinare omoloagă, în combinație cu problemele de identificare, separare și extindere a acestor recombinante, este puțin probabil să contribuie la utilizarea pe scară largă a acestei metode în viitorul apropiat, chiar dacă se vor dezvolta noi metode tehnologice. A doua abordare în terapia genică a patologiei dominante se bazează pe corectarea automată a ADN-ului deteriorat, deoarece mutațiile genetice pot fi corectate prin introducerea de ADN exogen cu secvența dorită (oligonucleotide ADN scurte sau oligonucleotide ARN/ADN himerice), care se leagă de omologii din genomul deteriorat. A treia opțiune implică blocarea transmiterii informațiilor patologice, ceea ce se realizează prin utilizarea unor oligonucleotide special concepute care se leagă de o genă specifică pentru a forma o structură elicoidală ternară ce elimină posibilitatea transcripției.

Deși corectarea unei boli genetice la nivel genomic rămâne cea mai optimă și preferată metodă terapeutică, ARNm este, de asemenea, un vector promițător (posibil chiar mai accesibil) pentru blocarea unei gene negative dominante. Moleculele proteice cu oligonucleotide antisens sau secvențe complete care blochează legarea ARNm la aparatul biosintetic celular au fost utilizate de mult timp pentru a inhiba traducerea și/sau a crește degradarea ARNm. În plus, ARN-ul dublu catenar induce o degradare rapidă a ARNm, al cărei mecanism rămâne neclar. Cu toate acestea, este puțin probabil ca simpla eliminare a ARNm-urilor transcrise dintr-o alelă mutantă cu mutații scurte sau simple să promoveze exprimarea ARNm-ului alelei normale. O alternativă este utilizarea ribosintezelor de tip hammerhead și hairpin, care au capacitatea de a se lega de regiuni extrem de specifice ale ARNm, cu inducerea ulterioară a clivajului și inactivării acestora în timpul traducerii. Posibilitatea utilizării acestei metode în terapia osteogenezei patologice este în prezent studiată. Indiferent de ținta vizată - elemente genomice sau citoplasmatice, succesul noilor tehnologii de terapie genică va fi determinat de eficiența includerii reactivilor în celulele stromale ale măduvei osoase ex vivo, alegerea optimă a unui vector specific și capacitatea stabilă a celulelor stem mezenchimale de a exprima factorii necesari in vivo.

Astfel, descoperirea celulelor stem mezenchimale cu proprietățile lor neașteptate creează o nouă schemă conceptuală pentru dezvoltarea liniilor celulare. Cu toate acestea, sunt necesare cercetări interdisciplinare suplimentare pentru a înțelege rolul biologic al celulelor stem stromale, natura lor, capacitatea lor de a se transdiferenția sau dediferenția, semnificația lor fiziologică în timpul dezvoltării embrionare, creșterii postnatale, maturării și îmbătrânirii, precum și în bolile umane.