Modele experimentale de osteoartrită

Cartilajul este un țesut foarte specializat care conține numai un singur tip de celule (condrocite), caracterizat prin absența vaselor sanguine și limfatice. Nutriția cartilajului se realizează în principal prin absorbția din lichidul sinovial. Metabolismul chondrocitelor este reglementat de un număr de factori solubili produs local de condrocite și țesuturi înconjurătoare. Funcția de condrocite depinde, de asemenea, de compoziția mediului extracelular (tensiunea oxigenului, concentrația de ioni, pH-ul etc.), compoziția VCM, interacțiunea celulară și a matricei, semnalele fizice. Sarcina principală a modeirii experimentale este crearea de culturi în mediul extracelular fără a schimba fenotipul celulelor mature. A doua sarcină este de a crea culturi pentru studierea răspunsului prematur, întârziat, scurt sau pe termen lung al condrocitelor la semnale chimice și / sau fizice. Studiile in vitro oferă , de asemenea , o oportunitate de a studia comportamentul condrocite in osteoartrita. A treia sarcină este dezvoltarea sistemelor co-curative, care permit studierea interacțiunilor diferitelor țesuturi în articulație. A patra sarcină este pregătirea implanturilor cartilaginoase pentru transplantul ulterior. Și, în sfârșit, a cincea sarcină este de a studia factorii de creștere, citokinele sau agenții terapeutici capabili să stimuleze repararea și / sau inhibarea resorbției cartilajului.

De-a lungul ultimelor decenii s-au creat diferite modele de culturi celulare articulare, inclusiv culturi monostrat, culturi suspendate, culturi de chondron, explante, coculturi, culturi de celule nemuritoare. Fiecare cultură are avantajele și dezavantajele sale și fiecare este adecvată pentru studierea unui aspect particular al metabolismului condrocitelor. Astfel, explantele cartilaginoase sunt un model excelent pentru studierea cifrei de afaceri a elementelor matricei, care necesită receptori autentici de suprafață celulară și interacțiuni normale de matrice celulară și matrice-celulă. În același timp, se recomandă efectuarea studiului depozitelor în matrice sau a mecanismelor de reglare a metabolismului condrocitelor pe o cultură a celulelor izolate. Pentru studierea procesului de diferențiere a celulelor este necesară o cultură cu densitate scăzută monostrat. Culturile suspendate într-o matrice naturală sau sintetică sunt un model pentru analizarea răspunsului adaptiv al condrocitelor la stresul mecanic.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Culturi de chondrocite

Atunci când alegeți țesutul de cartilagiu pentru studii in vitro, trebuie luate în considerare câteva aspecte importante. Compoziția matricilor și activitatea metabolică a condrocitelor variază în diferite articulații, iar ultima depinde de adâncimea condrocitelor din țesut. Aceste date au fost obținute în mai multe experimente în care s-au studiat subpopulații izolate de condrocite din zonele cartilajelor de diferite adâncimi. Au fost identificate numeroase diferențe morfologice și biochimice între condrocitele cultivate situate în suprafața și straturile adânci ale cartilajului articular. Celulele de suprafață sintetizează o matrice fibrilară proteoglicană rară, epuizată, în timp ce celulele mai adânci produc o matrice bogată în fibrila și proteoglicani. Mai mult, celulele de suprafață produc proteoglicani mici și agregați relativ mici și acid hialuronic și relativ mai puțin agregan și sulfat de keratan decât condrocitele mai localizate. O altă trăsătură importantă distinctivă a metabolismului condrocitelor izolate din zonele cartilajelor de diferite adâncimi este răspunsul la stimulul exogen. Potrivit lui M. Aydelotte și co-autori, condrocitele de tauri din zona de suprafață a cartilajului au fost mai sensibile la IL-1 decât celulele din zona profundă.

Comportamentul celulelor depinde, de asemenea, de localizarea țesutului. Condrocite cartilaj și ale urechii margini, prelevate din același animal care reacționează diferit la factorii de creștere cum ar fi factorul de creștere fibroblastică (FGF) și TGF-beta. FGF crescută timidinei, prolină și leucină la cultura condrocite coaste , dar nu la ureche. TGF-P a crescut încorporarea timidinei în condrocite cartilaj coaste si ureche, dar nu a avut nici un efect asupra timidinei în condrocite și prolină ureche. Celulele cartilaginoase obținute din zonele cu cea mai mare încărcătură diferă de cele din locurile cu o sarcină scăzută pe cartilaj. De exemplu, condrocite mature ale cartilajului articulației genunchiului din regiunea centrală a oilor articulare suprafață tibială osoase nu sunt acoperite de meniscului, care transporta cea mai mare sarcină in vivo, agrecan mai mici sintetizate, decorin dar mai mare decât celulele din zonele acoperite de meniscului. Autorii subliniază , de asemenea , importanța utilizării cartilajului articulațiilor de zone identice în studiul funcției sintetice a articulațiilor.

Metabolismul condrocitelor și răspunsul lor la factorii de reglementare depind, de asemenea, semnificativ de vârsta donatorului, de dezvoltarea scheletului său și de starea articulațiilor de la care sunt luate celulele. În condrocitele umane, se observă o scădere semnificativă cu vârsta răspunsului proliferativ. Cea mai mare scădere se observă la donatorii cu vârste cuprinse între 40-50 de ani și peste 60 de ani. Mai mult, severitatea răspunsului proliferativ la factorii de creștere (de exemplu, FGF și TGF-beta) scade în timpul îmbătrânirii. Pe lângă schimbările cantitative în proliferarea condrocitelor, există și schimbări calitative. Celulele donatoare tinere (cu vârste cuprinse între 10 și 20 de ani) răspund mai bine la factorul de creștere derivat din plachete (PDGF) decât la TGF-beta, în timp ce contrastul se observă la celulele donatoare adulte. Pentru a explica modificările dependente de vârstă în funcția sintetică a condrocitelor și răspunsul lor la efectul factorilor de creștere, se folosesc mai multe mecanisme. Dintre acestea, o scădere a numărului și afinității receptorilor celulari de suprafață, o schimbare în sinteza și bioactivitatea factorilor de creștere și a citokinelor și modificarea semnalelor postreceptor.

Starea patologică a articulațiilor modifică de asemenea morfologia și activitatea metabolică a condrocitelor. Deci, J. Kouri și colab (1996) au identificat trei subpopulații de condrocite in cartilaj in osteoartrita. Condrocite de la suprafață, și jumătatea superioară a cartilagiului și forma ciorchinii număr mai mare de proteoglicani sintetizate și colagen. TGF-beta și factorul de creștere asemănător insulinei (IGF), poate stimula sinteza proteoglican prin condrocite și parțial neutraliza efectele IL-1 și TNF-a. Explantelor cartilaginoase au fost afectate cu osteoartrita, iar condrocitele izolate din cartilaj de pacienti cu osteoartrita, sunt mai sensibili la stimularea TGF-beta decât condrocitele sănătos cartilajului. Aceste diferențe sunt cel mai probabil asociate cu modificări fenotipice ale condrocitelor în straturile superioare ale cartilajului articular.

Izolarea condrocitelor individuale se realizează prin tratament secvențial cu enzime proteolitice ale ECM. După eliberarea lor din ECM, celulele izolate sunt ideale pentru studierea sintezei componentelor matricei de novo. Unii autori utilizează numai clostridium collagenază, alții pre-incubează cartilajul cu tripsină, pronază, DNază și / sau hialuronidază. Numărul celulelor izolate depinde de enzimele utilizate. Astfel, când se procesează una din 1 g țesut colagenazei se pot obține 1,4T0 ⁶ condrocite, în timp ce atunci când se utilizează pronazei, hialuronidaza și colagenaza - 4,3-10 ⁶. Când se procesează cu colagenază, proteinele aggrecan, IL-6, IL-8 rămân în cultura celulară mult mai mult decât în cazul tratamentului secvențial cu diferite enzime. Există mai multe explicații pentru aceste diferențe între cele două culturi celulare:

• Receptorii celulari deteriorate sau deprimați prin acțiunea enzimelor, TGF-beta inhibă sinteza ADN-ului proteoglicanilor în condrocitelor nou izolate (ziua 1), în timp ce ADN-ul și sinteza proteoglycan condrocitelor cultivate în monostrat (7 zile) stimulate de TGF-beta. Totuși, pentru a reexprima aceste componente ale membranei, este necesară o perioadă adecvată înainte de începerea experimentului.
• Proteazele exogene pot rupe interacțiunea dintre celule și matrice mediată de integrine. Familia de integrine promovează atașarea condrocitelor la moleculele VKM (Shakibaei M. și colab., 1997). Această ruptură poate afecta exprimarea genelor matricei.
• Reziduurile componentelor matricei pot regla funcția sintetică a condrocitelor. Integrinele sunt capabile să recunoască produsele de degradare ale ECM, jucând astfel un rol important în repararea țesuturilor după expunerea la enzimele proteolitice. T. Larsson și coautori (1989) au raportat că adăugarea de pro-teoglicani intacți sau fragmentați la cultura celulară stimulează sinteza proteinelor și proteoglicanilor. Cu toate acestea, un nivel ridicat de acid hialuronic determină o reducere semnificativă a includerii sintezei proteoglicanului sulfat de condrocite condrocite embrion de pui celule mature de porcine și condrosarcom de șobolan. Mai mult, acidul hialuronic - inhibitor al eliberării de proteoglicani din celulele chiar și în prezența IL-lb, TNF-a, FGF, indicând faptul că primul contracarând activitatea biologica a factorilor de creștere și citokine. Mecanismul exact care stă la baza acțiunii acidului hialuronic rămâne neclar; Se știe că condrocitele conțin un receptor pentru acidul hialuronic, asociat cu filamentele actinice ale citozolului. Legarea acidului hialuronic la receptorul său stimulează fosforilarea proteinelor. Astfel, aceste date demonstrează funcții metabolice modularea condrocitelor native sau a proteinelor matricei molecule fragmentate prin activarea receptorilor membranei celulare.
• Stimularea rapidă de către enzime a sintezei proteinelor matricei de către condrocite poate fi o consecință a unei modificări a formei condrocitelor și / sau a reorganizării citoscheletului.
• Unele citokine (de exemplu, IL-8) și factori de creștere (de exemplu, IGF-1, TGF-P) sunt fixați în ECM. Cel mai cunoscut exemplu este legarea TGF-beta cu decore, ceea ce duce la o scădere a capacității primului pacient de a induce creșterea celulară în celulele ovariene la hamsterii chinezi. Datele conform cărora conținutul de decor de cartilagiu crește odată cu vârsta indică o scădere a biodisponibilității TGF-beta la îmbătrânire. Factorii de creștere și citokinele pot fi eliberați din reziduurile de matrice în timpul culturii și apoi pot modula funcția condrocitelor.

[8], [9], [10], [11],

Cultura monolayer a condrocitelor

Fenotipul diferențiat al condrocitelor este caracterizat în primul rând prin sinteza colagenului de tip II și a proteoglicanilor specifici țesutului, precum și printr-un nivel scăzut de activitate mitotică. Există dovezi că cultivarea pe termen lung a celulelor într-un monostrat, și după mai multe pasaje repetate de celule, condrocite își pierd forma sferică, devin de formă alungită,-fibroblast. Cu funcție sintetică, cum fibroblast Metaplazia este celule, caracterizate printr-o scădere progresivă în sinteza colageni II modificat de asemenea, IX și XI tipuri și sinteza îmbunătățită a colagenului I, III și Utipov. Proteoglicanii mici neagregați sunt sintetizați de agregan funcțional. Sintetzatepsina B și L este extrem de scăzută în celule diferențiate, dar în procesul de pierdere a creșterii diferențierii. Collagenaza-1 este exprimată în condrocite diferențiate, cu cultivare prelungită, expresia acesteia scade, în timp ce crește inhibitorii țesuturilor metaloproteinelor (TIMP).

Condrocitele diferențiate reexprimă colagenul fenotipului diferențiat atunci când sunt transferate de la o cultură monostrată la una suspendată. Procesul de diferențiere este probabil legat de forma celulelor. Această proprietate este utilizată în mod regulat de cercetători care studiază transplanturile defecte cu condrocite autologe. Un număr mic de celule obținute dintr-un material de biopsie poate fi multiplicat într-o cultură monostrat și apoi plasat din nou într-o matrice tridimensională înainte de transplantare. Re-exprimarea unui fenotip specific condrocite dediferentiate migrate în cultura de agaroză, pot fi stimulate de hidroxiapatita de acid ascorbic complex și TGF-p-ossein.

Ca răspuns la efectul factorilor de creștere și citokinelor, chondrocitele sunt modificate în timpul procesului de diferențiere. Răspunsul celular la citokine și factorii de creștere diferă între condrocitele nediferențiate și diferențiate. IL-1 stimulează proliferarea fibroblastelor, în timp ce creșterea condrocitelor nediferențiate este inhibată de IL-1. Sinteza ADN este stimulată de IGF-1 în condrodiți alungiți, dar nu aplatizați. În condrocitele diferențiate, efectele stimulative ale IL-1β și TNF-a asupra produselor procollagenazei sunt mai pronunțate decât cele nediferențiate.

Cultivarea condrocitelor

Cultivarea condrocitelor în suspensie într-un mediu lichid sau într-o matrice tridimensională naturală sau sintetică stabilizează fenotipul condrocitelor. Celulele își păstrează forma sferică, sintetizează proteine specifice țesuturilor. O cultură ponderată de condrocite este de obicei recomandată pentru studiul formării unei noi matrici pericelulare. Culturile chondrocyte din polimerii absorbanți naturali sintetici sau naturali sunt utilizați pentru a implanta celulele în defecte de cartilaj pentru a stimula regenerarea țesutului cartilajului articulației. Mediul sintetic sau natural pentru celulele implantabile trebuie să satisfacă o serie de cerințe:

• Implanturile ar trebui să aibă o structură poroasă pentru aderență și creștere celulară,
• nici polimerul însuși, nici produsele degradării sale nu ar trebui să provoace inflamații sau reacții toxice în timpul implantării in vivo,
• purtătorul de transplant ar trebui să fie capabil să se lege de un cartilaj adiacent sau osoasă subchondrală,
• o matrice naturală sau sintetică trebuie să fie capabilă de absorbție, degradarea acesteia trebuie echilibrată prin regenerarea țesuturilor,
• Pentru a facilita repararea cartilajelor, structura chimică și arhitectura matriceală a matricei ar trebui să contribuie la menținerea fenotipului celular codificat de condrocite și sinteza proteinelor specifice țesuturilor,
• în timpul implantării in vivo, este necesar să se studieze proprietățile mecanice ale matricei sintetice sau naturale.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspensia condrocitelor în faza lichidă

Atașarea celulelor vaselor de plastic, în care cultivarea condrocitelor pot fi prevenite acoperite cu o soluție de celuloză de metil, agaroză, hidrogel (poli-2-hidroxietilmetacrilat) sau un amestec de colagen-agaroză pereții lor. În aceste condiții, condrocitele formează clustere și sintetizează în principal coagule aggrecan și țesut specifice (tipuri II, IX, XI). De obicei, se găsesc două tipuri de celule. Celulele situate în centru păstrează o formă sferică înconjurată de un ECM bine dezvoltat, fapt confirmat de studiile histochimice și ultrastructurale. La periferia condrocitelor au contururi discoide, sunt înconjurate de o ECM rară; Se știe puțin despre caracteristicile funcționale ale unor astfel de celule.

Este posibilă cultivarea condrocitelor pe micropurtători susținute în suspensie; ca micropurtători folosind granule de dextran (tsitodeks), granule de dextran acoperite cu colagen (tsitodeks III), microsfere besporovye sunt colagen de tip I (tsellagen). În aceste condiții de cultură, condrocitele se atașează la suprafața micropurtătorului, își păstrează forma sferică și produc un material asemănător matricei. Mai mult, utilizarea colagenului promovează proliferarea condrocitelor și reexprimarea unui fenotip normal. Prin urmare, cultivarea condrocitelor pe microsferele colagenului poate fi utilizată pentru a restabili fenotipul celular înainte de transplant.

O altă metodă de cultivare a unei suspensii de condrocite într-un mediu lichid este cultivarea lor sub formă de granule dense constând din celule (0,5-1 * ^10b ) obținute prin centrifugare. Astfel de condrocite sunt capabile să producă matrice care conține cantități mari de proteoglicani-colagen tip II, dar nu colagenului de tip I, care a fost confirmată prin histologice, imunohistochimice și metode cantitative.

Suspensia condrocitelor într-un ECM natural

Condrocitele pot fi cultivate în suspensie într-o matrice tridimensională (agar moale, agaroză, numesc gene gel sau un burete, acid hialuronic, clei de fibrină, perle de alginat).

Condrocitele cultivate cu agaroză își păstrează fenotipul normal și sintetizează colagenul de tip II și agregatele agregate specifice țesuturilor noi. Când sunt cultivate în agaroză, proteoglicanii sintetizați în celule sunt eliberați în mediu timp de 50 de zile. Pentru comparație - în culturi monostrat, faza celulară este supraîncărcată cu glicozaminoglicani deja în primele 5-6 zile de cultivare; când se cultivă în mediu după intensificarea sintezei și eliberării glicozaminoglicanilor, scaderea dependentă de timp a glicozaminoglicanilor are loc în primele 8-10 zile. Cu toate acestea, comportamentul condrocitelor în timpul cultivării lor în agaroză diferă de cel în condiții in vivo. În agaroză, un număr mare de agregate sintetizate Aggregan conțin molecule mai mici și mai mici decât in vivo. TGF-P stimulează sinteza proteoglicanilor în explant, dar reduce sinteza agreganului în agaroză.

Alginatul este o polizaharidă liniară derivată din alge marine maro. În prezența cationilor divalenți, cum ar fi ^{ionii de} Ca2 ⁺, acest polimer devine un gel. Fiecare condrocitelor prins în alginat, înconjurat de o matrice de polizaharide încărcate negativ, porii , care sunt comparabile cu cele ale cartilajului hialin. Matricea care se formează condrocite în perle de alginat, constând din două segmente - un strat subțire de celule asociate cu matrice corespunzătoare matrici pericelulare și teritoriale ale cartilajului articular și mai matrice la distanță echivalentă interteritoriale în țesutul nativ. In a 30 -a zi de cultură, volum relativ și absolut ocupat de celule, iar fiecare dintre cele două departamente în banda de alginat este aproape complet identice cu cele ale cartilajului nativ. Timp de aproape 30 zile condrocitele își păstrează forma sferică și produc proprietăți agrecan, hidrodinamice care sunt similare cu cele ale moleculelor de agrecan din matricea cartilajului articular și colagen molecula II, IX și XI tipuri. În același timp, ca și alte culturi, suspensii, granule de alginat de pe suprafata celulelor aplatizate sunt prezente , care generează o cantitate mică de colagen tip I molecule, eliberată direct în mediu și care nu sunt incluse în VCR. În bilele de alginat, se observă proliferarea moderată a condrocitelor. După 8 luni de cultivare în condrocite mature gel de alginat nu își pierd activitatea metabolice si continua sa sintetizeze specific țesutului colagen de tip II și agrecan.

N. Tanaka și coautori (1984) au investigat proprietățile de difuzie ale diferitelor molecule naturale din alginat și au descoperit că moleculele mai mari de 70 kD nu difuzează prin alginat. Astfel, cultivarea celulelor din alginat este adecvată pentru studierea reglării biosintezei matricei și a organizării ECM. Disponibilitatea celulelor cultivate în alginat permite investigarea efectului factorilor de reglare a peptidelor și al agenților farmacologici asupra nivelelor transcripționale, posttranscripționale și translaționale.

Condrocitele sunt, de asemenea, cultivate într-o matrice de fibre de colagen I și II. S. Nehrer și co-autori (1997) au comparat funcționarea condrocitelor câinilor în matricele polimerice poroase cu colagen-proteoglican care conțin colagenuri de diferite tipuri. Au constatat diferențe importante în morfologia funcției biosintetice a condrocitelor cultivate în matrice de colagen conținând tipuri de colagen I și II. Celulele din matricea colagenului tip II și-au înfășurat forma sferică, în timp ce în colagenul de tip I au avut o morfologie asemănătoare fibroblastelor. Mai mult, în matricea de colagen de tip II, condrocitele au produs mai multe glicozaminoglicani. J. Van Susante și colaboratorii (1995) au comparat proprietățile condrocitelor cultivate în gelul de alginat și colagenul (tip I). Autorii au descoperit o creștere semnificativă a numărului de celule din gelul de colagen, dar din ziua a 6-a de cultivare, celulele au pierdut un fenotip caracteristic, transformându-se în celule asemănătoare fibroblastelor. În gelul alginat, sa observat o scădere a numărului de celule, dar condrocitele și-au păstrat fenotipul normal. Cantitatea de proteoglicani gel de colagen per celulă au fost semnificativ mai mari decât în alginat, dar scăderea a fost observată în sinteza elementelor matricei de gel pornind de la 6-a zi de cultivare, în timp ce în sinteza alginatul a continuat să crească.

O matrice solidă fibrinică tridimensională este o substanță naturală care susține condrocitele cântărite în ea într-un fenotip diferențiat. Matricea fibrină 3D poate fi, de asemenea, utilizată ca suport pentru transplantul de condrocite. Avantajele fibrinei sunt absența citotoxicității, capacitatea de a umple spațiul, capacitatea de aderență. Prin studii histologice și biochimice Autoren-diografii, microscopie electronica a arătat că condrocitele în geluri de fibrină păstrează morfologia lor, se multiplica si produc matrice chiar după 2 săptămâni de cultivare. Cu toate acestea, G. Homminga și coautorii (1993) au raportat că, după 3 zile de cultivare, începe dezintegrarea fibrinului, dediferențiarea condrocitelor progresează.

Suspensia condrocitelor într-un ECM artificial (sintetic)

Implanturile de cartilagiu pentru chirurgia reconstructivă sau ortopedică pot fi obținute prin creșterea condrocitelor izolate in vitro într-o matrice sintetică biocompatibilă.

Condrocitele de acid poliglicolic cultivate proliferează și mențin morfologia normală și fenotipul în decurs de 8 săptămâni. Complexul de acid condrocit-poliglicolic constă din celule, glicozaminoglicani, colageni și are o capsulă de colagen exterioară. Cu toate acestea, la astfel de implanturi există două tipuri de molecule de colagen - I și II. Implanturile din seria condrocitelor dediferentiate pasajelor au o cantitate mai mare de glicozaminoglicani și colagen decât în implanturi de condrocite primare nediferențiate.

L. Freed și coautorii (1 993b) au comparat comportamentul culturilor de condrocite umane și de taur în acid poliglicolic fibros (HPHC) și în acid polilactic (PPLC). După 6-8 săptămâni de cultivare a condrocitelor de tauri în HSVG sau PPLC, autorii au observat proliferarea celulelor și regenerarea matricei cartilajelor. În HSBC, condrocitele au fost sferice, situate în lacune înconjurate de o matrice cartilaginoasă. După 8 săptămâni de cultură in vitro, țesutul regenerat conține până la 50% substanță uscată (4% din masa celulară, 15% glicozaminoglicani și 31% colagen). În celulele PPLK au fost în formă de arbore, o mică cantitate de glicozaminoglicani și colagen. La HSBC, creșterea celulelor a fost de 2 ori mai intensă decât în PTCA. În condiții in vivo, condrocitele crescute în HPVC și PPLC timp de 1 până la 6 luni au produs un țesut histologic similar cartilajului. Implanturile conțin glicozaminoglicani, colageni de tip I și tip II.

Condrocitele de tauri fetale au fost cultivate în polietilenă hidrofobă poroasă și polietilenă hidrofobă de înaltă densitate. După 7 zile de incubare în ambele substraturi, celulele au păstrat o formă sferică, conținând în principal colagen de tip II. După 21 de zile de cultivare, s-a dovedit că matricea hidrofilă conține mai mult colagen de tip II decât matricea hidrofobă.

Cartea de țesut poate fi de asemenea obținută prin cultivarea într-un monostrat pe filtre Millicell-CM. Pre-acoperirea filtrelor cu colagen este necesară pentru atașarea condroiturilor. Examinarea histologică a culturii demonstrează acumularea de condrocite în proteoglicanii care conțin ECM și colagenul de tip II. Colagenul de tip I într-o astfel de cultură nu este detectat. Condrocitele din țesutul cartilaginos rezultat au o formă sferică, dar pe suprafața țesutului sunt oarecum aplatizate. Grosimea țesutului nou format a crescut cu timpul și depinde de densitatea inițială a monostratului celulelor. În condiții optime de cultură, grosimea țesutului cartilajului a atins 110 μm, organizarea celulelor sale și a colagenului în straturile superficiale și adânci este similară celei a cartilajului articular. VKM conține aproximativ 3 ori mai mult colagen și proteoglicani. După 2 săptămâni de cultivare, sa observat acumularea matricei-sa, ceea ce a făcut posibilă extragerea țesutului din filtru și utilizarea acestuia pentru transplant.

Sims și colaboratorii (1996) au studiat cultivarea condrocitelor într-o matrice polimerică încapsulată de polietilenă-oxid care permite unui număr mare de celule să fie transportate prin injectare. Șase săptămâni după injectarea în țesutul subcutanat de șoareci athymic, a fost formată o nouă cartilagie, care a fost caracterizată morfologic de opalescență albă similară cartilajului hialin. Datele din studiile histologice și biochimice au indicat prezența condrocitelor proliferative active care produc ECM.

Explantare

Examinarea țesutului cartilaginos este folosită pentru a studia procesele de ana- și catabolism în el, homeostazia, resorbția și repararea. Condrocitele din explantele țesutului cartilaginos susțin fenotipul și compoziția normală a ECM, similare celor din cartilajul articular in vivo. După 5 zile de cultivare în prezența serului, se atinge un nivel constant de sinteză și de degradare naturală. Resorbția poate accelera cultura de țesuturi și în cultura principală , cu adăugarea de ser utilizând un număr de agenți, de exemplu, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivați ai acidului retinoic sau radicali de oxigen activ. Pentru a studia repararea cartilajului, deteriorarea sa este indusă de mediatorii solubili ai inflamației (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) sau de ruptura fizică a matricei.

Metoda culturilor organotipice este un model pentru studierea efectelor in vitro ale factorilor externi izolați asupra condrocitelor și a matricei înconjurătoare. In vivo, condrocitele sunt rareori localizate în ECM și nu se contactează reciproc. Cultura cartilajului articular explant păstrează această organizare structurală, precum și interacțiunile particulare între condrocite și mediul lor extracelular înconjurător. Acest model este, de asemenea, folosit pentru a studia efectul stresului mecanic, agenți farmacologici, factori de creștere, citokine, hormoni asupra metabolismului cartilajului.

Un alt avantaj al explantei țesutului cartilaginos este absența leziunii condrocitelor de către enzimele proteolitice sau un factor mecanic, care este inevitabil atunci când celulele sunt izolate. Receptorii și alte proteine și glicoproteine membranare sunt protejate de factori dăunători.

[17], [18], [19], [20], [21]

Cultura chondronelor

Hondron - unitate cartilajului articular structural, functional si metabolic constând din condrocitelor matrice pericelulare și capsula sale filament compact și este responsabil pentru homeostazia matricei. Chondronii sunt extrași mecanic din cartilagiu și colectați de mai multe omogenizări succesive cu viteză mică. Izolat din zonele de diferite adâncimi cartilaj hondrony pot fi împărțite în patru categorii: hondron single, hondrony duble, multiple (trei sau mai multe) hondrony liniar aranjate (hondronov coloana) congestie hondronov.

Chondronii singuri sunt de obicei găsiți în straturile medii ale cartilajului intact, perechi - la marginea straturilor medii și adânci, chondronii multipli localizați liniar sunt tipici pentru straturile adânci de cartilaj intact. În cele din urmă, grupurile de chondroni constau din grupuri aleate de chondronuri singulare și pereche care păstrează starea agregată după omogenizare. Acumularea de chondroni sunt fragmente mari de cartilaj, care conțin, de obicei, mai multe chondroni și fibrile colagenice localizate radial, adică o organizație tipică caracteristică straturilor profunde ale matricei. Chondronii sunt imobilizați într-o agaroză transparentă, care permite studierea structurii, compoziției moleculare și activității metabolice. Sistemul Hondron - considerat agaroza ca un model de micro de cartilaj, care este diferit de sistemul tradițional de condrocite - agaroză care păstrează micromediul naturală, nu este nevoie de a efectua sinteza și asamblarea acestuia. Cultura chondronelor este un model pentru studierea interacțiunilor celulelor și matricei în cartilajul articular în condiții normale și patologice.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Cultura condrocitelor nemuritoare

Pentru a crea linii celulare permanente, se folosesc ADN recombinant sau virusuri care conțin oncogen care pot face celula "nemuritoare". Chondrocitele nemuritoare au capacitatea de a prolifera nesfârșită, menținând un fenotip stabil. F. Mallein-Gerin et al (1995) a arătat că oncogena este proliferarea indusă de SV40T condrocitelor mouse-ului, care, astfel, continuă să-și exprime stabil colageni II, IX și XI tipuri, precum și proteina de legare comună și agrecan. Cu toate acestea, această linie celulară dobândește capacitatea de a sintetiza colagen de tip I prin cultivarea l în cultură monostrat sau într-un gel de agaroză.

W. Horton și coautori (1988) au descris o linie de celule nemuritoare cu un nivel scăzut de exprimare a mRNA de colagen de tip II. Aceste celule au fost obținute prin transformarea acestora cu un retrovirus de șoarece care conține oncogene I-myc- și y-ra. Acest tip de celule este un model unic pentru studierea interacțiunilor matricei articulare în absența colagenului de tip II, precum și a reglării sintezei colagenului de tip II.

Cultura chondropiților cu gene mutate sau șterse este un model convenabil pentru studierea funcției fiziologice. Acest model este potrivit în special pentru studierea rolului moleculelor specifice în organizații ale matricei cartilaginoase sau studierea efectelor diferiților factori de reglementare asupra metabolismului cartilaj. Condrocitele gena la distanță sintetizată de tip colagen fibrile IX colagen mai larg decât în mod normal, ceea ce indică faptul că tipul de colagen IX reglează diametrul fibrilelor. Așa cum am menționat în capitolul 1, recent a găsit mutația genei care codifică COLAI de tip II de colagen in familiile cu osteoartrita primar generalizate. Pentru a studia efectul mutant colagenului de tip II în matricea articular R. Dharmrvaram et al (1997) a efectuat transfecția ( "contaminare" un acid nucleic străin) COL defect ₂ AI (arginină la poziția 519 este înlocuită cu cisteină) în condrocite umane fetale in vitro.

Sistemul de culturi. În articulație, cartilajul interacționează cu alte tipuri de celule conținute în membrana sinovială, fluidul sinovial, ligamentele, osul subchondral. Metabolismul condrocitelor poate fi influențat de diverși factori solubili sintetizați de aceste celule. Deci, artrita cartilajului articular este distrusă de enzimele proteolitice și de radicalii liberi, care sunt produși de celulele sinoviale. Prin urmare, modelele au fost dezvoltate pentru a studia interacțiunile complexe dintre cartilaj și țesuturile înconjurătoare, numite cocultură.

S. Lacombe-Gleise și colab (1995) au fost cultivate condrocite iepure și osteoblaști în sistemul cocultură (COSTAR), în care celulele au fost separate de membrană microporoasă (0,4 microni) permite schimbul între cele două tipuri de celule, fără nici un contact direct. Acest studiu a demonstrat capacitatea osteoblastelor de a stimula creșterea condrocitelor prin mediatori solubili.

AM Malfait și coautori (1994) au investigat relația dintre monocitele sângelui periferic și condrocite. Acest model este convenabil pentru studierea proceselor mediate de citokine în artropatiile inflamatorii (artrita reumatoidă, spondilita seronegativă etc.). Autorii modelului au separat celulele printr-o membrană care leagă proteinele cu diametre de 0,4 μm. Studiul a constatat ca monocite stimulate lipopolizaharide usate iFNO IL-1-a, care inhibă sinteza condrocite agrecan și a contribuit la degradarea agregatelor agrecan deja sintetizate.

K. Tada și colab (1994) a creat un model cocultură in care celulele endoteliale din colagen (tip I) gel au fost puse în camera interioară din camera exterioară separată de aceasta prin condrocite plasate într-un filtru cu o dimensiune a porilor de 0,4 microni. În stare de izolare deplină din camera exterioară a tubului de celule endoteliale umane formate în gel de colagen în prezența EGF sau TGF-a. Cu cultivarea simultană a ambelor tipuri de celule TGF, a fost inhibată formarea dependentă a tuburilor de către celulele endoteliale. Inhibarea condrocitelor acestui procedeu a fost parțial eliminată prin anticorpi anti-TGF-beta. Se poate presupune că TGF-beta produs de condrocite deprimă vascularizarea cartilajului însuși.

S. Groot și coautorii (1994) au cultivat simultan condrocite din zonele hipertrofice și proliferative ale osului unui șoarece făt de 16 zile cu bucăți de țesut cerebral. După 4 zile de cultură, sa observat transdiferențiarea condrocitelor în osteoblaste și debutul formării osteoidelor. După 11 zile de cultivare, o porțiune a cartilajului a fost înlocuită cu țesutul osos, iar matricea osoasă a fost parțial calcificată. Unele neuropeptide și neurotransmițătoare produse de țesutul cerebral, afectează metabolismul osteoblastelor sau au receptori pe ele. Dintre acestea, pot fi izolate norepinefrina, peptida intestinală vasoactivă, peptida asociată cu gena calcitoninei, substanța P și somatostatina. Cultivate cu condrocite, bucăți de țesut cerebral pot produce unii dintre acești factori, care pot induce procesul de transdiferențiere a condrocitelor în osteoblaste.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Influența factorilor externi asupra culturii condrocitelor

Efectul tensiunii oxigenului asupra metabolismului condrocitelor

În majoritatea cazurilor, culturile de condrocite se dezvoltă în condiții de tensiune atmosferică de oxigen. Cu toate acestea, este bine cunoscut faptul că condrocitele in vivo există în condiții hipoxice, iar tensiunea de oxigen variază în funcție de diferitele condiții patologice. În timpul procesului de maturare, se observă modificări semnificative ale aportului de sânge al epifizelor. Deoarece vascularizarea variază în diferite zone ale plăcii de creștere, tensiunea de oxigen în ele variază de asemenea. C. Brighton și R. Heppenstall (1971) au demonstrat că în placa tibiei la iepuri, tensiunea oxigenului din zona hipertrofică este mai mică decât în cartilajul din jur. Măsurătorile unor parametri metabolici au arătat că condrocitele sunt capabile să reacționeze rapid la modificările locale ale concentrației de oxigen. Mai întâi, cu o tensiune scăzută a oxigenului, consumul de condrocite scade. Cu o scădere a tensiunii oxigenului de la 21 la 0,04%, utilizarea glucozei este crescută, activitatea enzimelor de glicoliză și sinteza acidului lactic sunt crescute. Chiar și cu o tensiune scăzută a oxigenului, cantitatea absolută de ATP, ADP și AMP rămâne stabilă. Aceste date indică direcționalitatea metabolismului condrocitelor pentru a maximiza conservarea energiei. Cu toate acestea, activitatea sintetică și, prin urmare, procesele de reparare se schimbă în condiții de hipoxie.

Tensiunea crescută a oxigenului afectează, de asemenea, metabolizarea condrocitelor, determinând o scădere a sintezei proteoglicanilor și a ADN-ului, degradarea matricei cartilajului. Aceste efecte, de regulă, sunt însoțite de producția de radicali liberi de oxigen.

Influența concentrației de ioni și a presiunii osmotice a mediului asupra funcției condrocitelor

În cartilajul nativ, concentrația de ioni diferă semnificativ de cea a altor țesuturi: conținutul de sodiu în mediul extracelular este de 250-350 mmol și osmolaritatea sa este de 350-450 mosmol. Atunci când izolarea condrocite de la un aparat video și incubarea lor într-un mediu standard (DMEM (Minimal Essential Medium Dulbecco - mediu minim esențial Dulbecco) osmolaritate - 250-280,7 mOsm) schimbările care înconjoară brusc mediu al celulei. În plus, concentrația de calciu și potasiu în mediile standard este mult mai scăzută decât în țesutul nativ, iar concentrația anionilor este mult mai mare.

Adăugarea de zaharoză la mediu conduce la o creștere a osmolarității sale și induce o creștere tranzitorie intracelulară a concentrației de H ⁺ și a anionilor de calciu în citozol. Astfel de modificări intracelulare pot influența procesele de diferențiere a condrocitelor și activitatea lor metabolică. J. Urban și colab (1993) au descoperit că includerea ³⁵ 8-sulfat și ³ H-proline condrocite izolate incubate în mediu DMEM standard timp de 2-4 ore, a fost de numai 10% din care in tesutul nativ. Intensitatea sintezei a atins un maxim cu osmolaritatea mediei extracelulare de 350-400 mosmol atât în condrocitele recent izolate cât și în explantele țesutului cartilaginos. Mai mult, volumul condrocitului a crescut cu 30-40% după plasarea celulelor izolate într-un mediu DMEM standard al osmolarității menționate. Cu toate acestea, atunci când condrocitele cultivate sub osmolaritate non-fiziologice timp de 12-16 ore, celulele adaptate la noul mediu prin reducerea intensității de forfecare este proporțională osmolaritate biosinteză a mediului extracelular.

P. Borgetti și colab (1995) au investigat efectul osmolaritatea mediului extracelular asupra creșterii, morfologia și biosinteza condrocite porcine. Autorii au demonstrat trăsături biochimice și morfologice similare ale condrocitelor cultivate în mediu cu osmolaritate de 0,28 și 0,38 mosmol. Când a fost observată 0,48 mOsm osmolaritatea mediului în timpul primelor 4-6 ore de cultură scădere a proliferării celulare și sinteza proteinelor, dar ulterior a apărut restabili acești parametri, care au ajuns în cele din urmă valorile de control. Când cultivarea condrocite într-un mediu cu celule osmolaritate 0.58 mOsm pierd capacitatea de a sprijini procesele proliferative de intensitate fiziologică și după 6 zile numărul de condrocite este redus semnificativ. Cu osmolaritatea mediului, 0,58 mosmol, se observă o inhibare profundă a sintezei proteinelor. În plus, atunci când sunt cultivate în medii cu o osmolaritate mOsm 0,28-0,38 condrocite păstrează fenotip fiziologic la o osmolaritate mai mare (mOsm 0,48-0,58) schimbări semnificative în morfologia celulei, ca pierderea manifestata fenotip caracteristic condrocite conversie în celule asemănătoare fibroblastelor, precum și pierderi de celule, capacitatea de a asambla proteoglicanii de matrice. Rezultatele acestui studiu indică capacitatea condrocitelor de a răspunde oscilațiilor limitate de osmolalitate în mediul extracelular.

Modificarea concentrației altor ioni poate afecta, de asemenea, procesele de biosinteză în condrocite. Astfel, gradul de includere a ^35S (sulfat) crește la jumătate cu o creștere a concentrației de ioni de potasiu de la 5 mmol (concentrație într-un mediu DM DM standard) la 10 mmol (concentrație în VKM in vivo). Concentrația de calciu sub 0,5 mmol a contribuit la producerea de colagen prin condrocite de taur mature, în timp ce o concentrație de 1-2 mmol (corespunzătoare concentrației în mediul DM DM standard) a determinat o reducere semnificativă a sintezei de colagen. Sa observat o creștere moderată a biosintezei la niveluri ridicate de calciu (2-10 mmoli). Diferiți cationi participă la atașarea condrocitelor la proteinele VKM. Astfel, ionii de magneziu și mangan asigură atașamentul la fibronectină și colagenul de tip II, în timp ce ionii de calciu nu participă la atașarea condrocitelor la proteine. Astfel, rezultatele studiilor descrise indică influența schimbărilor în ionii extracelulari de potasiu, sodiu, calciu și osmolaritatea mediului asupra funcției biosintetice a condrocitelor incubate în mediu standard.

Influența stresului mecanic asupra metabolismului condrocitelor

Imobilizarea articulației provoacă o atrofie reversibilă a cartilajului, ceea ce indică necesitatea stimulilor mecanici pentru cursul normal al proceselor metabolice în ECM. În majoritatea cazurilor, modelele de cultură celulară utilizate există în condiții normale de presiune atmosferică. M. Wright și coautorii (1996) au arătat că mediul mecanic afectează metabolismul condrocitelor, răspunsul celulelor depinde de intensitatea și frecvența încărcării prin comprimare. Experimentele cu încărcare pe explante ale cartilajului articular intact au demonstrat in vitro o scădere a sintezei proteinelor și a proteoglicanilor sub acțiunea unei sarcini statice, în timp ce încărcarea dinamică stimulează aceste procese. Mecanismele exacte de realizare a efectului stresului mecanic asupra cartilajului sunt complexe și probabil legate de deformarea celulelor, presiunea hidrostatică, presiunea osmotică, potențialul electric și receptorii celulari de suprafață față de moleculele de matrice. Pentru a studia efectul fiecăruia dintre acești parametri, este necesar să se creeze un sistem în care un parametru poate fi în mod independent variat. De exemplu, o cultură explantă nu este adecvată pentru studierea deformării celulare, dar poate fi utilizată pentru a studia efectul general al presiunii asupra activității metabolice a condrocitelor. Compresia cartilajului conduce la celula de deformare, și de asemenea însoțită de apariția gradientului hidrostatic de presiune, potențial electric și schimbarea fluxului de fluid fizico- factori cum ar fi conținutul de apă în matrice, densitatea sarcinii electrice, nivelul presiunii osmotice. Deformarea celulelor poate fi studiată utilizând condrocite izolate, imersate într-un gel de agaroză sau colagen.

S-au dezvoltat mai multe sisteme pentru a studia efectul stimulării mecanice asupra culturii condrocitelor. Unii cercetători folosesc sisteme în acest scop în care presiunea este aplicată culturii celulare prin faza gazoasă. De exemplu, JP Veldhuijzen și colab (1979) , folosind o presiune peste cea atmosferică de 13 kPa , la o frecvență joasă (0,3 Hz) , timp de 15 minute, a observat o creștere a sintezei AMPc și proteoglicanii și scăderea sintezei ADN. R. Smith și colab (1996) au arătat că expunerea intermitentă a culturilor primare de presiune hidrostatică condrocitelor bull (10 MPa) , la 1 Hz timp de 4 ore , a determinat creșterea sintezei de agrecan și colagen de tip II, în timp ce presiunea constantă a avut nici un efect asupra acestor procese. Folosind un sistem similar M. Wright și colab (1996) au raportat că presiunea ciclică asupra culturii celulare este asociată cu hiperpolarizarea membranei celulare a condrocitelor și activarea Ca ²⁺ canalelor de potasiu dependente. Astfel, efectele presiunii ciclice sunt mediate de canalele ionice, activate prin întindere, în membrana condrocitelor. Răspunsul condrocitelor la presiunea hidrostatică depinde de condițiile culturii celulare și de frecvența sarcinii aplicate. Astfel, presiunea hidrostatică ciclică (5 MPa) reduce încorporarea sulfatului în monostrat condrocitelor la o frecvență de 0,05, 0,25 și 0,5 Hz, în timp ce pentru frecvențe mai mari de 0,5 Hz sulfat de incluziune în cartilaj crește explante.

M. Bushmann și colaboratorii (1992) au raportat că chondrocitele dintr-un gel de agaroză modifică biosinteza ca răspuns la o sarcină mecanică statică și dinamică în același mod ca un organ intact cultivat. Autorii au descoperit că sarcina mecanică generează un stimul hiperosmotic urmat de o scădere a pH-ului în condrocite.

Efectul întinderii mecanice poate fi studiat pe o cultură a celulelor scufundate într-un gel. Forța de întindere poate fi creată utilizând un vacuum controlat de calculator. Atunci când sistemul este într - un anumit grad de vid, fundul unui vas Petri , cu o cultură de celule se extinde cu o cantitate cunoscută, o deformare maximă la marginile de fund cupa și minimă la centru. Stretching-ul este transmis și cultivat într-un vas Petri de condrocite. Cu această metodă, Holm-vall K. și colab (1995) au arătat că cultivate în colagen (tip II) celule condrosarcom gel au mărit expresia ARNm și ₂ -integrina. Un ₂ p _r integrin este capabil de legare la colagen de tip II. Este considerat ca un mecanoreceptor, deoarece interacționează cu proteinele care leagă actina, conectând astfel ECM și citoscheletul.

Efectul pH-ului asupra metabolismului condrocitelor

PH-ul fluidului interstițial al ECM al țesutului cartilaginos este mai acid decât în alte țesuturi. A. Maroudas (1980) a determinat pH-ul cartilajului articular la 6,9. W. Diamant și co-autori (1966) au găsit un pH de 5,5 în condiții patologice. Se știe că condrocitele trăiesc la PO2 scăzut, ceea ce indică rolul important al glicolizei (95% din metabolismul total al glucozei) în metabolismul acestor celule; glicoliza este însoțită de producerea unei cantități mari de acid lactic.

În plus față de acidificarea mediului cu produsele glicolizei, componentele matricei au o importanță deosebită. Un număr mare de sarcini negative fixate pe proteogficanifor extracelular modifică compoziția ionică: există o concentrație mare de cationi liberi ( de exemplu , H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) și concentrație scăzută de anioni ( de exemplu, O2, NPHS). Mai mult, sub acțiunea sarcinii mecanice are loc expulzarea apei din ECM, ceea ce duce la creșterea concentrației de sarcini negative fixe și a atrage mai mulți cationi în matrice. Aceasta este însoțită de o scădere a pH-ului mediului extracelular, care afectează pH-ul intracelular, modificând astfel metabolizarea condrocitelor. R. Wilkin și A. Hall (1995) au studiat efectul pH - ului biosinteza matricei mediului condrocite izolate de bovine extracelulare și intracelulare. Ei au observat o modificare dublă a sintezei matricei cu o scădere a pH-ului. O ușoară scădere a pH - ului (7,4 35 S0 ₄ și ³ H-prolină în condrocite, în timp ce acidifiere mai profundă (pH <7,1) inhibă sinteza cu 75% comparativ cu de control. Crearea aceluiași pH scăzut (6,65) cu ioni de amoniu a determinat o scădere a sintezei matricei cu numai 20%. Rezultatele obținute indică faptul că modificarea pH-ului mediului de sinteză a matricei extracelulare nu poate fi explicată doar prin modificări ale pH-ului mediului intracelular. Mai mult, condrocite posedă capacitatea de a regla pH - ul intracelular de Na ⁺, H ⁺ schimbator, Ca ⁺ -dependente C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS și H ⁺ / ATPaza.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Efectul compoziției mediului pentru cultivare asupra metabolismului condrocitelor

Mediul pentru cultivarea condrocitelor trebuie să corespundă condițiilor experimentale. În ultimii ani, serul de vițel a fost utilizat pentru a optimiza condițiile de cultură. Cu toate acestea, atunci când se utilizează ser, trebuie luate în considerare câteva aspecte importante:

• creșterea externă a celulelor de la periferia țesutului în culturile de organe,
• variabilitatea compoziției serurilor de diferite serii,
• prezența unor componente necunoscute în ele,
• risc crescut de interferență, artefacte în studiul influenței diferiților factori biologici asupra activității metabolice a celulelor.

Un exemplu al ultimului este studiul efectului EGF asupra condrocitelor cartilajului la șobolani. EGF stimulează încorporarea ³ H-timidină și crește conținutul de ADN în cultură. Acest efect a fost mai pronunțat la concentrații plasmatice scăzute (<1%), dar la concentrații mari (> 7,5%) efectul a dispărut.

Este bine cunoscut faptul că nivelurile de sinteză și degradare în DMEM îmbogățit cu ser de vițel sunt semnificativ mai mari comparativ cu condițiile in vivo. Diferențele dintre metabolizarea in vivo și in vitro pot fi cauzate de diferențele dintre fluidul sinovial și mediul în care celulele sunt cultivate. D. Lee și colab (1997) au fost cultivate condrocite taurii tineri agaroză folosind un mediu nutritiv conținând DMEM îmbogățit cu ser de vițel 20% și un număr mare de lichid sinovial normale alogenă. Prezența fluidului sinovial în mediu a determinat o creștere a numărului de proteoglicani, până la 80% din cantitatea totală de lichid sinovial. Rezultatele obținute indică faptul că lichidul sinovial în cultură induce o rată metabolică similară celei in vivo, cu un nivel ridicat de sinteză a glicozaminoglicanilor și un nivel scăzut de diviziune celulară.

G. Verbruggen și colab (1995) au arătat că sinteza ³⁵ S-arrpeKaHa condrocite umane cultivate în agaroză în DMEM fără ser a fost de 20-30% din nivelul sintezei observate în DMEM, suplimentat cu ser de vițel 10%. Autorii determină măsura în care IGF-1, IGF-2, TGF-P sau redus agrecan producției de insulină în mediu fără ser. Autorii au ajuns la concluzia ca 100 ng ml insulină /, IGF-1 sau IGF-2 sinteză parțial redusă a agrecan la 39-53% din nivelurile de control. Cu o combinație a acestor factori, nu au fost identificate fenomene sinergice sau cumulative. În același timp, 10 ng / ml de TGF-P în prezența a 100 insulină ng / ml au stimulat sinteza agrecan până la 90% sau mai mult din nivelul de referință. În cele din urmă, transferinul seric, singur sau în combinație cu insulina, nu a afectat sinteza agreganului. Atunci când serul de vițel a fost înlocuit cu albumină serică bovină, conținutul agregat de agregină a fost semnificativ redus. Mediu de cultură Îmbogățire cu insulina, IGF, sau TGF-P este restabilită parțial capacitatea celulelor de a produce agregate agrecan. În acest caz, IGF-1 și insulina sunt capabili să mențină homeostazia în culturile celulare. După 40 zile de cultură în mediu suplimentat cu 10-20 ng / ml IGF-1, sinteza proteoglicanului a fost menținută la același nivel sau chiar mai mare în comparație cu mediu conținând ser de vițel 20%. Procesele catabolice continuat lent în mediu suplimentat cu IGF-1 decât în mediu suplimentat cu soluție de albumină 0,1%, dar ceva mai rapid în mediu suplimentat cu ser 20%. În culturile de lungă durată, 20 ng / ml IGF-1 menține o stare stabilă a celulelor.

D. Lee și colab (1993) au comparat efectul compoziției mediului de cultură (DMEM, DMEM + 20% ser de vițel, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) asupra sintezei ADN - ului într - o cultură a explantului de cartilaj, cultură monostrat și în suspensie în agaroză . Atunci când se cultivă în agaroză , în prezența autorilor serice a observat o tendință de grupare a condrocite în concentrații mari. Celulele cultivate fără ser și cu IGF1, păstrează o formă circulară în agaroză, au fost colectate în grupuri mici, dar nu au format agregate mari. In monostrat sinteza ADN - ului a fost semnificativ mai mare în mediu conținând ser decât în mediu suplimentat cu IGF-1; Sinteza ADN-ului în acesta din urmă a fost mult mai mare decât în mediul neimportant. Când cultivarea condrocite în suspensie în agaroză în mediu neconcentrată și într - un mediu cu IGF-1, nici o diferență în sinteza ADN - ului. În același timp , suspensia de condrocite în cultura de agaroză în mediu suplimentat cu ser, a fost însoțită de o încorporare crescută radionucleotidelor ³ H-timidina comparativ cu alte medii.

Vitamina C este necesară pentru activarea enzimelor implicate în formarea unei structuri spiralale stabile a fibrilelor de colagen. Condrocitele, deficitare în ceea ce privește acidul ascorbic, sintetizează precursorii subco-hidroxilați non-helicali ai colagenului, care sunt încet secretați. Introducerea acidului ascorbic (50 μg / ml) determină hidroxilarea tipurilor de colagen II și IX și secreția lor în cantități normale. Adăugarea de vitamina C nu a afectat nivelul de sinteză a proteoglicanilor. În consecință, secreția de colagen este reglementată independent de secreția de proteoglicani.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]