Corynebacterium

Difteria este o boală infecțioasă acută, care afectează în principal copiii, și care se manifestă ca o intoxicație profundă a organismului cu toxină difterică și o inflamație fibrinoasă caracteristică la locul localizării agentului patogen. Numele bolii provine din cuvântul grecesc *diphthera* - piele, peliculă, deoarece la locul reproducerii agentului patogen se formează o peliculă densă, gri-albă.

Agentul cauzator al difteriei - Corynebacterium diphtheriae - a fost descoperit pentru prima dată în 1883 de E. Klebs în secțiuni de film și a fost obținut în cultură pură în 1884 de F. Leffler. În 1888, E. Roux și A. Yersin au descoperit capacitatea sa de a produce o exotoxină, care joacă un rol major în etiologia și patogeneza difteriei. Producerea serului antitoxic de către E. Behring în 1892 și utilizarea sa din 1894 pentru tratamentul difteriei au făcut posibilă reducerea semnificativă a mortalității. Un atac cu succes asupra acestei boli a început după 1923 în legătură cu dezvoltarea unei metode de obținere a anatoxinei difterice de către G. Raion.

Agentul cauzator al difteriei aparține genului Corynebacterium (clasa Actinobacteria). Din punct de vedere morfologic, se caracterizează prin faptul că celulele au formă de băț și sunt îngroșate la capete (greacă coryne - băț), formează ramificații, în special în culturile vechi, și conțin incluziuni granulare.

Genul Corynebacterium include un număr mare de specii, care sunt împărțite în trei grupe.

• Corinebacteriile sunt paraziți ai oamenilor și animalelor și patogeni pentru aceștia.
• Corinebacterii patogene pentru plante.
• Corinebacterii nepatogene. Multe specii de corinebacterii sunt locuitori normali ai pielii, membranelor mucoase ale faringelui, nazofaringelui, ochilor, tractului respirator, uretrei și organelor genitale.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Morfologia corinebacteriilor

C. diphtheriae sunt bastonașe drepte sau ușor curbate, nemotile, cu o lungime de 1,0-8,0 μm și un diametru de 0,3-0,8 μm; nu formează spori sau capsule. Adesea au umflături la unul sau ambele capete și conțin adesea granule metacromatice - granule de volutină (polimetafosfați), care capătă o culoare albăstrui-violet atunci când sunt colorate cu albastru de metilen. Pentru detectarea lor a fost propusă o metodă specială de colorare Neisser. În acest caz, bastonașele sunt colorate în galben pai, iar granulele de volutină sunt maro închis și sunt de obicei situate la poli. Corynebacterium diphtheriae se colorează bine cu coloranți anilinici, este gram-pozitivă, dar în culturile vechi se decolorează adesea și are o colorare negativă conform Gram. Se caracterizează printr-un polimorfism pronunțat, în special în culturile vechi și sub influența antibioticelor. Conținutul de G+C în ADN este de aproximativ 60% mol.

Proprietățile biochimice ale corinebacteriilor

Bacilul difteric este un organism aerob sau anaerob facultativ, temperatura optimă pentru creștere fiind de 35-37 °C (limitele de creștere sunt de 15-40 °C), pH-ul optim este de 7,6-7,8. Nu este foarte exigent față de mediile nutritive, dar crește mai bine pe medii care conțin ser sau sânge. Mediile Roux sau Loeffler cu ser coagulat sunt selective pentru bacteriile difterice, creșterea pe ele apare după 8-12 ore sub formă de colonii convexe de mărimea unui cap de ac, de culoare alb-gri sau crem-gălbui. Suprafața lor este netedă sau ușor granulară, la periferie coloniile sunt ceva mai transparente decât în centru. Coloniile nu se îmbină, drept urmare cultura capătă aspectul de piele de șagren. Pe bulion, creșterea se manifestă printr-o turbiditate uniformă, sau bulionul rămâne transparent, iar la suprafața sa se formează o peliculă delicată, care se îngroașă treptat, se sfărâmă și se depune în fulgi pe fund.

O caracteristică a bacteriilor difterioase este creșterea lor bună pe medii de cultură cu sânge și ser care conțin concentrații de teluri de potasiu, astfel încât acestea suprimă creșterea altor tipuri de bacterii. Acest lucru se datorează faptului că C. diphtheriae reduce teluritul de potasiu la telur metalic, care, depus în celulele microbiene, conferă coloniilor o culoare gri închis sau neagră caracteristică. Utilizarea unor astfel de medii crește procentul de însămânțare a bacteriilor difterioase.

Corynebacterium diphtheriae fermentează glucoza, maltoza, galactoza cu formarea de acid fără gaz, dar nu fermentează (de regulă) zaharoza, au cistinază, nu au urează și nu formează indol. Prin aceste caracteristici, ele diferă de bacteriile corineforme (difteroide) care se găsesc cel mai adesea pe membrana mucoasă a ochiului (Corynebacterium xerosus) și nazofaringe (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) și de alte difteroide.

În natură, există trei variante principale (biotipuri) ale bacilului difteric: gravis, intermedins și mitis. Acestea diferă prin proprietăți morfologice, culturale, biochimice și de altă natură.

Împărțirea bacteriilor difterice în biotipuri a fost făcută ținând cont de formele de difterie la pacienții cu care acestea sunt izolate cu cea mai mare frecvență. Tipul gravis este cel mai adesea izolat de la pacienții cu o formă severă de difterie și provoacă focare de grup. Tipul mitis provoacă cazuri mai ușoare și sporadice ale bolii, iar tipul intermedius ocupă o poziție intermediară între acestea. Corynebacterium belfanti, atribuit anterior biotipului mitis, este izolat ca un al patrulea biotip independent. Principala sa diferență față de biotipurile gravis și mitis este capacitatea de a reduce nitrații la nitriți. Tulpinile de Corynebacterium belfanti au proprietăți adezive pronunțate, iar printre acestea se găsesc atât variante toxigene, cât și non-toxigene.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Structura antigenică a corinebacteriilor

Corynebacterium este foarte eterogen și mozaic. Câteva zeci de antigene somatice au fost găsite în toate cele trei tipuri de agenți patogeni difterici, conform cărora aceștia sunt împărțiți în serotipuri. În Rusia, a fost adoptată o clasificare serologică, conform căreia se disting 11 serotipuri de bacterii difterice, dintre care 7 sunt principale (1-7) și 4 sunt serotipuri suplimentare, rar întâlnite (8-11). Șase serotipuri (1, 2, 3, 4, 5, 7) aparțin tipului gravis, iar cinci (6,8,9,10,11) aparțin tipului mitis. Un dezavantaj al metodei de serotipizare este că multe tulpini, în special cele netoxigene, au aglutinare spontană sau poliaglutinabilitate.

[ 11 ]

Tiparea fagică a Corynebacterium diphtheriae

Diverse scheme de tipizare a fagilor au fost propuse pentru diferențierea bacteriilor difterice. Conform schemei lui M. D. Krylova, utilizând un set de 9 fagi (A, B, C, D, F, G, H, I, K), este posibilă tipizarea majorității tulpinilor toxigene și non-toxigene de tip gravis. Luând în considerare sensibilitatea la fagii specificați, precum și proprietățile culturale, antigenice și capacitatea de a sintetiza coricine (proteine bactericide), M. D. Krylova a identificat 3 grupuri independente de corinebacterii de tip gravis (I-III). Fiecare dintre ele conține subgrupuri de analogi toxigeni și non-toxigeni ai agenților patogeni difterici.

Rezistența la Corynebacterium

Corynebacterium diphtheriae prezintă o rezistență ridicată la temperaturi scăzute, dar moare rapid la temperaturi ridicate: la 60 °C - în 15-20 de minute, la fierbere - după 2-3 minute. Toți dezinfectanții (lizol, fenol, cloramină etc.) în concentrația utilizată uzual o distrug în 5-10 minute. Cu toate acestea, agentul patogen difteric tolerează bine uscarea și poate rămâne viabil mult timp în mucus uscat, salivă și particule de praf. Într-un aerosol fin, bacteria difterică rămâne viabilă timp de 24-48 de ore.

Factorii de patogenitate ai corinebacteriilor

Patogenitatea Corynebacterium diphtheriae este determinată de prezența unui număr de factori.

Factorii de aderență, colonizare și invazie

Structurile responsabile de aderență nu au fost identificate, dar fără ele bacilul difteric nu ar putea coloniza celulele. Rolul lor este îndeplinit de unele componente ale peretelui celular al agentului patogen. Proprietățile invazive ale agentului patogen sunt asociate cu hialuronidaza, neuraminidaza și protează.

O glicolipidă toxică conținută în peretele celular al agentului patogen. Este un 6,6'-diester al trehalozei care conține acid corinemicolic (C32H64O3) și acid corinemicolic (C32H62O3) în raporturi echimolare (trehaloză-6,6'-dicorinemicolat). Glicolipida are un efect distructiv asupra celulelor țesuturilor de la locul reproducerii agentului patogen.

Exotoxină, care determină patogenitatea agentului patogen și natura patogenezei bolii. Variantele non-toxigene ale C. diphtheriae nu provoacă difterie.

Exotoxina este sintetizată ca un precursor inactiv - un singur lanț polipeptidic cu o greutate moleculară de 61 kD. Este activată de proteaza bacteriană însăși, care taie polipeptida în două peptide legate prin legături disulfidice: A (gr. 21 kD) și B (gr. 39 kD). Peptida B îndeplinește o funcție de acceptor - recunoaște receptorul, se leagă de acesta și formează un canal intramembranar prin care peptida A pătrunde în celulă și implementează activitatea biologică a toxinei. Peptida A este o enzimă ADP-riboziltransferază, care asigură transferul adenozin difosfat ribozei de la NAD la unul dintre reziduurile de aminoacizi (histidină) ale factorului de elongație proteic EF-2. Ca urmare a modificării, EF-2 își pierde activitatea, iar acest lucru duce la suprimarea sintezei proteinelor de către ribozomi în stadiul de translocație. Toxina este sintetizată numai de acele C. diphtheriae care poartă genele profagului de conversie moderată în cromozomul lor. Operonul care codifică sinteza toxinei este monocistronic, constă din 1,9 mii de perechi de nucleotide și are un promotor toxP și 3 regiuni: toxS, toxA și toxB. Regiunea toxS codifică 25 de reziduuri de aminoacizi ale peptidei semnal (asigură eliberarea toxinei prin membrană în spațiul periplasmic al celulei bacteriene), toxA - 193 de reziduuri de aminoacizi ale peptidei A, iar toxB - 342 de reziduuri de aminoacizi ale peptidei B a toxinei. Pierderea profagului de către celulă sau mutațiile din operonul tox fac celula ușor toxigenă. Dimpotrivă, lizogenizarea C. diphtheriae non-toxigenice de către fagul convertitor le transformă în bacterii toxigene. Acest lucru a fost dovedit fără echivoc: toxigenitatea bacteriilor difterioase depinde de lizogenizarea lor de către corinefagele convertitoare de toxine. Corinefagele se integrează în cromozomul corinebacteriilor folosind mecanismul recombinării specifice locului, iar tulpinile de bacterii difterice pot conține 2 situsuri de recombinare (attB) în cromozomii lor, iar corinefagele se integrează în fiecare dintre ele cu aceeași frecvență.

Analiza genetică a unui număr de tulpini non-toxigene de bacterii difterice, efectuată folosind sonde ADN marcate care poartă fragmente ale operonului tox al corinefagului, a arătat că cromozomii acestora conțin secvențe de ADN omoloage cu operonul tox al corinefagului, dar fie codifică polipeptide inactive, fie se află într-o stare „silențioasă”, adică inactive. În acest sens, se pune o întrebare epidemiologică foarte importantă: se pot transforma bacteriile difterice non-toxigene în toxigene în condiții naturale (în corpul uman), similar cu ceea ce se întâmplă in vitro? Posibilitatea unei astfel de transformări a culturilor non-toxigene de corinebacterii în toxigene folosind conversia fagică a fost demonstrată în experimente pe cobai, embrioni de pui și șoareci albi. Cu toate acestea, nu a fost încă stabilit dacă acest lucru se întâmplă în timpul procesului epidemic natural (și, dacă da, cât de des).

Datorită faptului că toxina difterică din organismul pacienților are un efect selectiv și specific asupra anumitor sisteme (sistemul simpatico-adrenal, inima, vasele de sânge și nervii periferici sunt afectate în principal), este evident că aceasta nu numai că inhibă biosinteza proteinelor în celule, dar provoacă și alte perturbări ale metabolismului acestora.

Următoarele metode pot fi utilizate pentru a detecta toxicitatea bacteriilor difterice:

• Teste biologice pe animale. Infecția intradermică a cobailor cu un filtrat dintr-o cultură de bulion de bacterii difterice provoacă necroză la locul injectării. O doză letală minimă de toxină (20-30 ng) ucide un cobai cu greutatea de 250 g atunci când este injectată subcutanat în a 4-a-5-a zi. Cea mai caracteristică manifestare a acțiunii toxinei este afectarea glandelor suprarenale, care sunt mărite și hiperemice accentuate.
• Infecția embrionilor de pui. Toxina difterică provoacă moartea acestora.
• Infecția culturilor celulare. Toxina difterică provoacă un efect citopatic distinct.
• Un test imunosorbent legat de enzime în fază solidă utilizând antitoxine marcate cu peroxidază.
• Utilizarea unei sonde ADN pentru detectarea directă a operonului tox în cromozomul bacteriilor difterice.

Totuși, cea mai simplă și mai comună metodă de determinare a toxicității bacteriilor difterice este serologică - metoda precipitării pe gel. Esența sa este următoarea. O bandă de hârtie de filtru sterilă cu dimensiunea de 1,5 x 8 cm este umezită cu ser antidifteric antitoxic care conține 500 AE în 1 ml și aplicată pe suprafața mediului nutritiv într-o placă Petri. Placa este uscată într-un termostat timp de 15-20 de minute. Culturile testate sunt însămânțate cu plăci pe ambele părți ale hârtiei. Mai multe tulpini sunt însămânțate pe o placă, dintre care una, evident toxică, servește drept control. Plăcile cu culturile sunt incubate la 37 °C, rezultatele fiind luate în considerare după 24-48 de ore. Datorită contradifuziei antitoxinei și toxinei în gel, se formează o linie clară de precipitare la locul interacțiunii lor, care se contopește cu linia de precipitare a tulpinii toxigene de control. Benzile de precipitare nespecifice (se formează dacă, pe lângă antitoxină, în ser sunt prezenți în cantități mici și alți anticorpi antimicrobieni) apar târziu, sunt slab exprimate și nu se contopesc niciodată cu banda de precipitare a tulpinii de control.

Imunitate post-infecțioasă

Cazuri repetate, puternice, persistente, practic pe tot parcursul vieții, ale bolii sunt observate rar - la 5-7% dintre cei care au avut boala. Imunitatea este în principal de natură antitoxică, anticorpii antimicrobieni fiind de o importanță mai mică.

Testul Schick a fost anterior utilizat pe scară largă pentru a evalua nivelul imunității antidifterice. În acest scop, 1/40 din toxina de cobai a fost injectată intradermic la copii, într-un volum de 0,2 ml. În absența imunității antitoxice, după 24-48 de ore apar roșeață și umflături cu un diametru mai mare de 1 cm la locul injectării. O astfel de reacție Schick pozitivă indică fie o absență completă a antitoxinei, fie că aceasta conține mai puțin de 0,001 AE/ml de sânge. O reacție Schick negativă se observă atunci când conținutul de antitoxină din sânge este mai mare de 0,03 AE/ml. Dacă conținutul de antitoxină este mai mic de 0,03 AE/ml, dar mai mare de 0,001 AE/ml, reacția Schick poate fi fie pozitivă, fie, uneori, negativă. În plus, toxina în sine are o proprietate alergenica pronunțată. Prin urmare, pentru a determina nivelul imunității antidifterice (conținutul cantitativ de antitoxină), este mai bine să se utilizeze RPGA cu un diagnostic eritrocitar sensibilizat cu toxoid difteric.

Epidemiologia difteriei

Singura sursă de infecție este o persoană - o persoană bolnavă, o persoană în convalescență sau un purtător sănătos al bacteriei. Infecția se produce prin picături din aer, praf din aer și prin diverse obiecte folosite de purtătorii bolnavi sau sănătoși: vase, cărți, lenjerie, jucării etc. În cazul contaminării produselor alimentare (lapte, creme etc.), infecția este posibilă pe cale alimentară. Excreția cea mai masivă a agentului patogen are loc în forma acută a bolii. Cu toate acestea, persoanele cu forme latente, atipice ale bolii au cea mai mare importanță epidemiologică, deoarece adesea nu sunt spitalizate și nu sunt detectate imediat. Un pacient cu difterie este contagios pe întreaga perioadă a bolii și o parte a perioadei de recuperare. Perioada medie de purtare a bacteriilor la persoanele în convalescență variază de la 2 la 7 săptămâni, dar poate dura până la 3 luni.

Purtătorii sănătoși joacă un rol special în epidemiologia difteriei. În condiții de morbiditate sporadică, ei sunt principalii distribuitori ai difteriei, contribuind la conservarea agentului patogen în natură. Durata medie de purtare a tulpinilor toxigene este ceva mai scurtă (aproximativ 2 luni) decât a celor netoxigene (aproximativ 2-3 luni).

Motivul formării unui transportor sănătos de bacterii difterice toxigene și netoxigene nu a fost pe deplin dezvăluit, deoarece chiar și un nivel ridicat de imunitate antitoxică nu asigură întotdeauna eliberarea completă a organismului de agentul patogen. Poate că nivelul imunității antibacteriene are o anumită semnificație. De o importanță epidemiologică primară este transportul de tulpini toxigene de bacterii difterice.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Simptomele difteriei

Persoanele de orice vârstă sunt susceptibile la difterie. Agentul patogen poate pătrunde în corpul uman prin membranele mucoase ale diferitelor organe sau prin pielea afectată. În funcție de localizarea procesului, se disting difteria faringelui, nasului, laringelui, urechii, ochilor, organelor genitale și pielii. Sunt posibile forme mixte, de exemplu, difteria faringelui și a pielii etc. Perioada de incubație este de 2-10 zile. În forma clinică a difteriei, la locul localizării agentului patogen se dezvoltă o inflamație fibrinoasă caracteristică a membranei mucoase. Toxina produsă de agentul patogen afectează mai întâi celulele epiteliale, apoi vasele de sânge din apropiere, crescându-le permeabilitatea. Exudatul rezultat conține fibrinogen, a cărui coagulare duce la formarea unui strat pelicular alb-cenușiu pe suprafața membranei mucoase, care este strâns fuzionat cu țesutul subiacent și, atunci când este rupt, provoacă sângerări. Consecința deteriorării vaselor de sânge poate fi dezvoltarea edemului local. Difteria faringiană este deosebit de periculoasă, deoarece poate provoca crup difteritic din cauza edemului membranei mucoase a laringelui și a corzilor vocale, din care 50-60% dintre copiii cu difterie mureau ca urmare a asfixiei. Toxina difterică, care pătrunde în sânge, provoacă intoxicație generală profundă. Aceasta afectează în principal sistemele cardiovascular, simpatico-adrenal și nervii periferici. Astfel, simptomele difteriei constau dintr-o combinație de semne locale, în funcție de localizarea porții de intrare, și simptome generale cauzate de otrăvirea cu toxină și manifestate sub formă de adinamie, letargie, paloare a pielii, hipotensiune arterială, miocardită, paralizie a nervilor periferici și alte afecțiuni. Difteria la copiii vaccinați, dacă este observată, evoluează de obicei într-o formă ușoară și fără complicații. Rata mortalității în perioada anterioară utilizării seroterapiei și antibioticelor era de 50-60%, acum este de 3-6%.

Diagnosticul de laborator al difteriei

Singura metodă de diagnostic microbiologic al difteriei este bacteriologică, cu testarea obligatorie a culturii izolate de corinebacterii pentru toxicitate. Studiile bacteriologice pentru difterie se efectuează în trei cazuri:

• pentru diagnosticarea difteriei la copii și adulți cu procese inflamatorii acute la nivelul faringelui, nasului și nazofaringelui;
• conform indicațiilor epidemiologice ale persoanelor care au fost în contact cu sursa agentului patogen difteric;
• persoanele nou admise în orfelinate, creșe, internate și alte instituții speciale pentru copii și adulți, pentru a identifica printre acestea posibili purtători ai bacilului difteric.

Materialul pentru studiu este mucusul din faringe și nas, pelicula din amigdale sau alte mucoase, care reprezintă punctul de intrare al agentului patogen. Semănatul se face pe mediu seric teluritic sau sanguin și simultan pe mediu ser coagulat Roux (ser coagulat de cal) sau Loeffler (3 părți ser bovin + 1 parte bulion zaharat), pe care creșterea corinebacteriilor apare după 8-12 ore. Cultura izolată este identificată printr-o combinație de proprietăți morfologice, culturale și biochimice, utilizând metode de tipizare sero- și fagică ori de câte ori este posibil. În toate cazurile, este obligatoriu un test de toxicitate utilizând una dintre metodele de mai sus. Caracteristicile morfologice ale corinebacteriilor sunt cel mai bine studiate folosind trei metode de colorare a unui preparat de frotiu: Gram, Neisser și albastru de metilen (sau albastru de toluidină).

Tratamentul difteriei

Un tratament specific pentru difterie este utilizarea serului antitoxic antidifteric care conține cel puțin 2000 UI per 1 ml. Serul se administrează intramuscular în doze de la 10.000 la 400.000 UI, în funcție de severitatea bolii. O metodă eficientă de tratament este utilizarea antibioticelor (peniciline, tetracicline, eritromicină etc.) și a sulfonamidelor. Pentru a stimula producerea propriilor antitoxine, se poate utiliza anatoxina. Pentru a scăpa de transportul bacterian, trebuie utilizate antibiotice la care tulpina dată de corinebacterii este foarte sensibilă.

Profilaxia specifică a difteriei

Principala metodă de combatere a difteriei este vaccinarea planificată în masă a populației. În acest scop, se utilizează diverse opțiuni de vaccinare, inclusiv cele combinate, adică care vizează crearea simultană a imunității împotriva mai multor agenți patogeni. Cel mai răspândit vaccin în Rusia este DPT. Este o suspensie de bacterii ale tusei convulsive adsorbite pe hidroxid de aluminiu, distruse de formalină sau timerosal (20 de miliarde în 1 ml) și conține anatoxină difterică într-o doză de 30 de unități floculare și 10 unități de legare a anatoxinei tetanice în 1 ml. Copiii sunt vaccinați de la vârsta de 3 luni, iar apoi se efectuează revaccinări: prima după 1,5-2 ani, următoarele la vârsta de 9 și 16 ani și apoi la fiecare 10 ani.

Datorită vaccinării în masă, care a început în URSS în 1959, incidența difteriei în țară până în 1966, comparativ cu 1958, a fost redusă de 45 de ori, iar indicatorul acesteia în 1969 a fost de 0,7 la 100.000 de locuitori. Reducerea ulterioară a volumului de vaccinări în anii 1980 a dus la consecințe grave. În perioada 1993-1996, Rusia a fost cuprinsă de o epidemie de difterie. Adulții, în principal cei care nu fuseseră vaccinați, și copiii s-au îmbolnăvit. În 1994, au fost înregistrați aproape 40 de mii de pacienți. În legătură cu aceasta, vaccinarea în masă a fost reluată. În această perioadă, 132 de milioane de oameni au fost vaccinați, inclusiv 92 de milioane de adulți. În perioada 2000-2001, acoperirea copiilor cu vaccinări în perioada stabilită a fost de 96%, iar cu revaccinare - de 94%. Din această cauză, incidența difteriei în 2001 a scăzut de 15 ori față de 1996. Cu toate acestea, pentru a reduce incidența la cazuri izolate, este necesară vaccinarea a cel puțin 97-98% dintre copii în primul an de viață și asigurarea revaccinării în masă în anii următori. Este puțin probabil ca difteria să fie complet eliminată în următorii ani din cauza purtătorului pe scară largă de bacterii difterice toxigene și netoxigene. De asemenea, va fi nevoie de ceva timp pentru a rezolva această problemă.