Celule stem mezenchimale

Dintre celulele stem regionale, celulele stem mezenchimale (MSC) ocupă un loc special, ale cărui derivați constituie matricea stromală a tuturor organelor și țesuturilor corpului uman. Prioritatea cercetării MSC aparține reprezentanților științei biologice ruse.

La mijlocul secolului trecut, o cultură omogenă a celulelor stem din măduva osoasă multipotentă a fost izolată pentru prima oară în laboratorul lui A. Friedenshtein. Celulele stem mezenchimale atașate la un substrat pentru o lungă perioadă de timp a păstrat o rată de proliferare ridicată și culturile la o densitate de însămânțare scăzută după fixare pe un substrat format din clone de celule fibroblast având nici o activitate fagocitară. Oprirea proliferării MSC a fost terminată prin diferențierea lor in vitro spontană în celule osoase, grase, cartilaj, mușchi sau țesut conjunctiv. Studiile ulterioare au făcut posibilă stabilirea potențialului osteogen al celulelor fibroblaste din stroma măduvei osoase de diferite specii de mamifere, precum și activitatea lor de formare a coloniilor. Experimentele in vivo, sa demonstrat că atât transplantul hetero- și ortotopic de celule formatoare de colonii fibroblast este completat os, cartilaj și țesut fibros de grăsime care formează. Deoarece celulele stem din măduva osoasă au o capacitate mare de auto-reînnoire și o varietate de diferențiere într-o singură linie celulară, acestea au fost denumite celule progenitoare mezenchimale multipotent.

Trebuie remarcat faptul că, timp de 45 de ani de cercetare fundamentală a celulelor stem mezenchimale, au fost create condiții reale pentru utilizarea derivaților lor în practica clinică.

Astăzi, nu există nicio îndoială că toate țesuturile corpului uman sunt formate din celulele stem din diferite linii celulare ca urmare a proceselor de proliferare, migrare, diferențiere și maturizare. Cu toate acestea, mai recent, sa crezut că celulele stem din organismul adult sunt specifice țesutului, adică sunt capabile să producă linii celulare specializate numai ale țesuturilor în care sunt situate. Această situație conceptuală a fost respinsă de faptele de transformare a celulelor stem hematopoietice nu numai în elementele celulare ale sângelui periferic, ci și în celulele hepatice ovale. În plus, și celulele stem neurale au putut da naștere atât neuronilor, cât și elementelor gliale, precum și liniilor precoce dedicate celulelor progenitoare hematopoietice. La rândul lor, celulele stem mezenchimale, care produc, de regulă, elemente celulare ale oaselor, cartilajului și țesutului adipos, sunt capabile să se transforme în celule stem neurale. Se presupune că, în procesul de creștere, regenerare tisulară fiziologică și reparativă, celulele progenitoare neangajate sunt generate din rezervele de tulpine specifice țesuturilor. De exemplu, repararea țesutului muscular poate fi realizată prin intermediul celulelor stem mezenchimale care migrează de la măduva osoasă la mușchii scheletici.

Cu toate că astfel de celule stem eco interșanjabilitate recunosc nu toți cercetătorii posibilitatea de utilizare clinica a celulelor stem mezenchimale ca sursă pentru transplant de celule și vector de celule de informatii genetice nu a contestat ca celulele stem stromale multipotente de măduvă osoasă, care poate fi relativ ușor de izolat și propagare in cultura in vitro. În același timp, în literatura de specialitate continuă să apară rapoarte cu privire la potentialul de celule stem pluripotente ale stromei măduvei osoase. Ca protocoalele de cercetare prezentate dovezi, care sub influența inductorilor specifici ai transdifferentiation de MSCs sunt transformate in celule nervoase, cardiomyocytes si hepatocite. Cu toate acestea, unii oameni de știință posibilitatea de a re-activare și expresia genelor în timpul embriogenezei devreme în îndoieli serioase. În același timp, toată lumea înțelege că, dacă se constată condiții pentru a extinde multipotente celulele stem mezenchimale la pluripotența de CSE in medicina regenerativa si plastic rezolvate automat multe probleme de natură etică, morală, religioasă și legală. Mai mult decât atât, deoarece în acest caz sursa stem capacitatea de regenerare a pacientului sunt celule stromale autologe este rezolvat și problema respingerii imune a transplantului de celule. Cât de realiste sunt perspectivele apropiere de viitor va arăta.

[1], [2]

Utilizarea celulelor stem mezenchimale în medicină

Utilizarea clinică a derivaților de celule stem mezenchimale este asociată în primul rând cu reducerea defectelor tisulare cauzate de leziuni termice extinse și profunde ale pielii. Evaluarea preclinică experimentale a oportunității de celule stem mezenchimale fibroblastice alogeni pentru tratarea arsurilor profunde a fost realizat. Este demonstrat ca maduva osoasa celule stem mezenchimale fibroblastice formeaza un monostrat in cultura, ceea ce face posibil să le transplant pentru a optimiza regenerarea rănilor arsuri profunde. Autorii act de faptul că au proprietăți similare fibroblaste embrionare, dar aplicarea clinică a acestuia este limitată la problemele etice și juridice existente. O arsură termică adâncă cu afectarea tuturor straturilor de piele a fost modelată pe șobolani Wistar. Suprafața arsurilor a fost de 18-20% din suprafața totală a pielii. În primul grup experimental a constat din șobolani cu leziuni termice profunde și transplantul de celule stem mezenchimale derivate din fibroblaste alogenic. Cel de-al doilea grup a constat din animale cu arderea termică adâncă și plantarea trans de fibroblaste embrionare alogene. Al treilea grup a fost reprezentat de șobolani de control cu arsură termică profundă, care nu au efectuat terapie celulară. O suspensie de celule stem mezenchimale derivate din fibroblaste și fibroblaste embrionare a fost aplicat pe o suprafață arde rană pipetează într - o cantitate de 2 x 10 ⁴ celule pe a 2 -a zi după excizia modelării arsurilor și escarele necrotic formate. După transplant, celulele de suprafata acoperita cu un tifon îmbibat în soluție de clorură de sodiu izotonică cu gentamicina arde. Celule de măduvă osoasă Gard pentru a obține MSCs cu inducție ulterioară a liniei fibroblast in celulele stem mezenchimale produse la șobolanii Wistar adulți din femurele. Fibroblastele embrionare au fost obținute din plămânii embrionilor în vârstă de 14-17 zile. Fibroblastele embrionare și celule de măduvă osoasă pentru a obține o pre-MSCs au fost cultivate în cutii Petri la 37 ° C într - un iikubatore C02, într - o atmosferă cu 5% CO2 la 95% umiditate. Fibroblastele embrionare sunt cultivate timp de 4-6 zile, în timp ce pentru formarea monostrat MSC necesare între 14 și 17 de zile. MSCs Ulterior întreținute de crioconservare ca materie primă pentru celulele stem mezenchimale derivate din fibroblaste , care au fost preparate prin decongelare și MSCs cultivarea timp de 4 zile. Numărul de celule stem mezenchimale generate fibroblastelor este mai mult de 3 ori numărul de fibroblaste embrionare apărute în cursul aceleiași perioade de cultură. Pentru a identifica celulele din transtslantirovannyh arde răni în genomul lor etapa cultivare marcate folosind vector suveică viral bazat pe un recombinant adenovirus V purtător de tip 1 aS-2 care codifică gena beta-galactozidaza E. Coli. Celulele vii la momente diferite după transplant detectat imunohistochimic în criosectiuni cu substrat adăugat X-Gal, dând culoare albastru-verde caracteristică. Ca rezultat al dinamic vizual, planimetric și starea evaluarea histologică a plăgilor de arsură, sa constatat că , chiar și la a 3 -a zi după transplantul celulelor în grupuri izolate apar diferente semnificative in timpul plagilor procesului de vindecare. Deosebit de distinct, această diferență a devenit în a 7-a zi după transplantul de celule. Animalele din primul grup, care au fost transplantate celule stem mezenchimale fibroblastice, rana dobândită o culoare intensă uniform roz, țesut de granulație a crescut pe întreaga sa suprafață la nivelul epidermei, și arde suprafața este considerabil redusă în dimensiune. Mai multe formate de film de colagen mai subțire la suprafața plăgii, dar ea a continuat să acopere întreaga suprafață a arsurii. Animalele din al doilea grup, care au fost transplantate fibroblastele embrionare, țesut de granulație este ridicată la nivelul epidermei marginilor plăgilor, dar numai în unele locuri, în același plazmoreya timp de rana a fost mai intensă decât la lotul 1 și filmul de colagen format inițial practic a dispărut. La animalele care nu au primit terapia cu celule stem, pe 7 zile rana a fost o arsură fără sâmburi, țesut palid, necrozat, acoperite cu fibrină. Plasmografia a fost observată pe toată suprafața arsurilor. Histologic, animalele din grupele 1 si 2 au prezentat o scădere de infiltrare și dezvoltarea vascularizatia celulare, aceste semne ale procesului de regenerator incipiente au fost mai severe la șobolanii din grupa 1. In grupul de control au prezentat semne de celula plăgilor infiltrare, modelul histologica a vaselor de sânge nou formate absente. 15-30 th zi de observare a animalelor din zona 1 suprafață grup arde a fost semnificativ mai mică decât la șobolanii din alte grupuri și suprafața de granulare a fost mai dezvoltată. La animalele din suprafața de ardere doilea grup este , de asemenea , a scăzut în comparație cu mărimea plăgilor de arsură în grupul de control al șobolanilor care sa datorat epitelizare marginale. În controlul site - urilor de suprafata de ardere grup a ramas granulații pal cu rare, care apar pe acesta vene paianjen, insulele au fost placa fibrinoasă a continuat plazmoreya moderat pe suprafața de ardere, ceea ce este scabia detașabil dificil a rămas. In general, animalele din grupa 3 reduce mărimea rănii, dar rana a rămas margine podrytymi.

Astfel, în timpul unui studiu comparativ al ratelor cicatrizării plăgilor folosind celule stem mezenchimale derivate din fibroblaste și fibroblaste fetale și fără utilizarea terapiei cu celule marcate accelerarea vindecării de suprafață arde ca urmare a transplantului de celule stem mezenchimale derivate din fibroblaste și fibroblaste embrionare. Cu toate acestea, în cazul folosirii celulelor stem mezenchimale alogenice de plagă fibroblastic vitezei de vindecare a fost mai mare decât în transplantul de fibroblaste embrionare. Acest lucru sa manifestat prin accelerarea schimbării fazelor de regenerare a procesului - pentru reducerea perioadelor de infiltrare celulare, crește rata de proliferare a rețelelor vasculare, precum și formarea de țesut de granulație.

Rezultatele planimetriei dinamice indică faptul că rata de vindecare spontană a plăgii de arsură (fără utilizarea terapiei celulare) a fost cea mai mică. Pe 15 și 30-a zi după transplantul de celule stem mezenchimale alogenice ale rănii fibroblastic vitezei de vindecare a fost mai mare decât în transplantul de fibroblaste embrionare. Metoda histochimică pentru detectarea beta-galactozidaza a aratat ca, dupa transplantul de celule stem mezenchimale fibroblastice și fibroblaste embrionare pe parcursul întregii perioade de observație de pe suprafata si rani transplantate celulele se regenerează profunde rămân viabile. Autorii sugereaza ca o rata mai mare de arsuri regenerare folosind celule stem mezenchimale de fibroblast eliberare condiționată de aceste celule în timpul maturării rostostimuliruyushih factorilor bioactivi.

Transplantul de autolog sau alogen keratinocite și fibroblaste alogen pentru tratamentul plăgilor de arsură și utilizate în clinică. Trebuie remarcat faptul că tratamentul chirurgical al copiilor cu arsuri profunde extinse este o sarcină complicată din cauza multitudinii de mare de intervenții chirurgicale și traume, pierderi de sânge semnificative, asupra diferitelor reacții utilizate perfuzie media. Principalele dificultăți în punerea în aplicare a pielii si chirurgie plastica, cu arsuri profunde extinse, zona de peste 40% din suprafața corpului, din cauza gravitatea stării sale și lipsa de resurse ale pielii donatorului. Utilizarea de grefe ochiurilor de plasă cu un raport mare de perforare nu rezolvă problema, deoarece imaginea după perforarea celulei epiteliziruyutsya este foarte lent, și de multe ori fac grefe de piele sunt lizate sau uscate. Astfel de acoperiri arsuri ca ksenokozha, allografts cadaverici, acoperiri de film sintetice nu sunt întotdeauna suficient de eficiente, astfel încât dezvoltarea de noi metode de închidere a straturilor de suprafață arde keratinocitelor cultivate și fibroblaști. În particular, o metodă de închidere suprafețelor de ardere utilizând allofibroblastov cultivate furnizarea în timpul transplantului pronunțat efect stimulator asupra proliferării epidermotsitov păstrată în frontieră rana la arsuri, iar în keratinocitei grefe mesh văluri. In Budkevich L. Et al (2000) prezintă rezultatele aplicării acestei metode pentru tratamentul arsurilor la copii. 31 de copii cu traumatisme termice cu vârsta cuprinsă între 1 și 14 ani erau sub observație. La trei copii suprafață totală arsuri IIIA-B - gradul IV a fost de 40%, 25 - 50-70%, chiar și la trei - 71-85% din suprafața corpului. Necrectomiei chirurgicale precoce combinat cu transplantul de allofibroblastov cultivate și autodermaplasty. In primul tratament etapă a fost realizată excizia țesutului necrozat, al doilea - pe transplantarea filmului purtător allofibroblastov cultivate, a treia (48 de ore după transplant de allofibroblastov cultivate) - îndepărtare a clapelor de matrice și de piele, cu raport perforații autodermoplastie de 1: 4. Trei pacienți internați în spital cu boala severa arde, allofibroblasty cultivate au fost transplantate la granularea rănilor. Transplantul de allo-fibroblaste de cultură a fost efectuat o dată la 18 copii, de două ori la 11 ani și de trei ori la doi pacienți. Suprafața suprafeței plăgii acoperită de cultura celulară a fost de la 30 la 3500 cm2. Eficacitatea allofibroblastov cultivate evaluate de procentul total de grefarea lambourilor de piele, timpul de vindecare a arsurilor și a numărului de decese leziuni termice severe. Emboltarea transplanturilor a fost completă la 86% dintre pacienți. În 14% din cazuri sa constatat o non-apariție parțială a flapsurilor cutanate. În ciuda tratamentului în curs de desfășurare, șase (19,3%) au murit. Suprafața totală a leziunilor cutanate din ele era de la 40 la 70% din suprafața corporală. Transplantul de allofibroblastov cultivate au avut nici o legătură cu moartea leziuni arde un singur pacient.

Analizând rezultatele tratamentului, autorii act de faptul că arde anterioare incompatibile cu viața, pentru a trata leziuni termice profundă a suprafeței pielii de 35-40% din suprafața corpului (pentru copii mici - de până la 3 ani - sunt critice arsuri profunde, cu o suprafață de 30%, pentru copiii mai mari vârstă - peste 40% din suprafața corporală). În cazul în care transplantul chirurgical al autodermaplasty cultivate necrectomiei allofibroblastov și pielea cu arsuri ulterioare grefe mari, factor de perforație IIIB - gradul IV rămân critice, dar în acest moment, există perspective în multe cazuri, pentru a salva viața chiar și astfel de victime. Necrectomiei chirurgicale în asociere cu transplantul de allofibroblastov cultivate și autodermaplasty la copii cu arsuri profunde dovedit a fi deosebit de eficace la pacienții cu leziuni avansate ale pielii, cu un deficit de site-uri donatoare. Tactică chirurgicală activă și transplantarea allofibroblastov cultivate promovează stabilizarea rapidă a stării generale a acestor pacienți, reducerea numărului de complicații infecțioase ale bolii de arsură, crearea condițiilor favorabile pentru grefarea, reduce timpul pentru a restabili pielea a pierdut și durata tratamentului spitalicesc, reducerea incidenței deceselor la pacienții cu arsuri extinse. Astfel, transplantul de allofibroblastov cultivate au urmat lambourilor cutanate autodermaplasty realizeaza recuperare la copii cu arsuri severe, care anterior au fost considerate damnat.

Este larg recunoscut faptul că obiectivul principal al tratării unei boli de arsură este de a maximiza recuperarea completă și rapidă a pielii deteriorate pentru a preveni apariția efectelor toxice, a complicațiilor infecțioase și a deshidratării organismului. Rezultatele aplicării celulelor de cultură depind în mare măsură de pregătirea pentru transplantarea rănirii în sine. In cazurile de transplant keratinocitelor cultivate la suprafața plăgii după necrectomiei chirurgicală prizhivlyaetsya o medie de 55% (prin zona) de celule transplantate, în timp ce la ranile granularea ratei grefării este redusă la 15%. Prin urmare, tratamentul cu succes al arsurilor extinse ale pielii profunde necesită, în primul rând, tactici chirurgicale active. În prezența gradelor IIIB-IV de arsură, suprafața arsurilor este imediat eliberată din țesuturile necrotice pentru a reduce efectele intoxicației și pentru a reduce numărul de complicații ale bolilor arse. Utilizarea unor astfel de tactici este cheia pentru reducerea timpului de timpul de ardere la închiderea rănii și durata de ședere a pacienților cu arsuri extinse într-un spital, dar, de asemenea, reduce semnificativ numărul de decese.

Primele rapoarte privind utilizarea cu succes a keratinocitelor cultivate pentru acoperirea suprafeței de arsură au apărut la începutul anilor optzeci ai secolului trecut. Ulterior, această manipulare a fost efectuată cu ajutorul straturilor de keratinocite cultivate, obținute cel mai adesea de la autostructuri, mult mai puțin frecvent de la allokeratinocite. Cu toate acestea, tehnologia de autokeratinocitoplastie nu permite crearea unei bănci de celule, în timp ce timpul necesar pentru producerea unei grefe suficiente din keratinocite este mare și se ridică la 3-4 săptămâni. În această perioadă, riscul de a dezvolta infecții și alte complicații ale bolii arde crește brusc, ceea ce prelungește în mod semnificativ durata totală de ședere a pacienților în spital. În plus, autoceratinocitele practic nu supraviețui în timpul transplantului în plăci de ardere granulate, iar costul ridicat al mediilor speciale de creștere și stimulentele de creștere a keratinocitelor biologic active limitează semnificativ aplicarea lor clinică. Alte metode biotehnologice, cum ar fi colagenoplastia, transplantul de xenoizi crioconservate și utilizarea diferitelor acoperiri biopolimerice cresc eficacitatea tratării suprafețelor extinse, dar nu și a arsurilor profunde. Metoda de acoperire a suprafeței plăgii cu fibroblastele cultivate este fundamental diferită prin aceea că componenta principală a grupului de celule celulare nu este keratinocitele, ci fibroblastele.

O condiție esențială pentru dezvoltarea metodei a servit ca o dovadă că pericite care înconjoară vasele mici sunt celule pro- genitornymi mezenchimale capabile să se transforme în fibroblaste, care produc mai mulți factori de creștere și asigură vindecarea rănilor , datorită efectului de stimulare puternic asupra proliferării și adeziunea keratinocite. Utilizarea culturilor fibroblastice pentru închiderea plăgilor suprafețele imediat identificat o serie de avantaje semnificative ale acestei metode asupra utilizării keratinocitelor cultivate. În particular, prepararea fibroblastelor în cultură nu necesită utilizarea promotorilor speciale medii de cultură și de creștere, ceea ce reduce costurile de transplant mai mult de 10 ori costul de obținere a keratinocitelor. Fibroblastele sunt ușor supuse la Trecerile, timp în care își pierd parțial antigenele lor histocompatibilitate de suprafață, care la rândul său face posibilă utilizarea , pentru fabricarea de transplanturi alogenice de celule și de a crea băncile lor. Scurtează transplanturi care au primit, gata pentru utilizare într - o clinică, de la 3 saptamani (keratinocite) 1-2 zile (pentru fibroblaști). Culturile primare de fibroblaști pot fi obținute prin cultivarea celulelor din fragmente de piele prelevate la autodermoplastie și însămânțarea cu celule densitate pe subculturi la primirea fibroblaste umane este de numai 20 x 10 ³ per 1 cm ².

Pentru a studia efectul fibroblaștilor și proteinele lor de reglementare în proliferarea și diferențierea keratinocitelor, o analiză comparativă a caracteristicilor și morfologia proliferării de keratinocite pe substraturi de colagen de tip I și III și fibronectină în co-cultura cu fibroblaste umane. Cercinocitele umane au fost izolate din fragmente de piele ale pacienților cu arsuri administrate în timpul operației de autodermoplastie. Densitatea keratinocitelor a fost de 50 x 103 celule / cm2. Eficacitatea clinică a transplantului de fibroblaste de cultură a fost evaluată la 517 pacienți. Toți pacienții au fost împărțiți în două grupuri: 1 - adulți afectați de arsuri IIA, B - IV; Al doilea - copii cu arsuri profunde de grad IIIB - IV. Evaluarea dinamicii de organizare structurală și funcțională a culturii monostrat a fibroblaștilor în ceea ce privește rolul în procesul de regenerare a glicozaminoglicanilor, fibronectina, colagen, și a permis autorilor de a determina a treia zi ca și cele mai bune condiții de utilizare a culturilor de fibroblaste pentru producerea de transplanturi. Investigarea impactului asupra proliferării fibroblaștilor și diferențierii keratinocitelor a arătat că sub fibroblasti in vitro au un efect stimulator pronunțat, în primul rând asupra proceselor de adeziune keratinocite, creșterea numărului de celule aderente și rata de fixare mai mult de 2 ori. Stimularea proceselor de adeziune este însoțită de o creștere a intensității sintezei ADN și a nivelului de proliferare a keratinocitelor. Mai mult, sa constatat că prezența fibroblastelor și a matricei extracelulare format de acestea este o condiție prealabilă pentru formarea tonofibrillyarnogo conexiuni intercelulare aparate de keratinocite și, în cele din urmă, pentru diferențierea keratinocitei și formarea membranei bazale. În tratamentul copiilor cu arsuri profunde stabilite eficacitatea clinică a culturii transplantului allofibroblastov, în special la pacienții cu leziuni extinse ale site-urilor de donatori de piele într-un deficit. Studiul complex morfofunktcionalnoe a aratat ca altoi caracterizat fibroblasti de sinteza ADN-ului activ, precum colagen, fibronectina și glicozaminoglicani, care sunt generate în celulele matricei extracelulare. Autorii sugereaza un procent ridicat de grefarea fibroblasti transplantate (la 96%), o reducere drastică în ceea ce privește prepararea acestora (în decurs de 2-3 ore, în loc de 24-48 săptămâni, în cazul keratinocite), o accelerare substanțială a epitelizarea suprafeței arde, și o reducere semnificativă a prețului (în 10 ori) a tehnologiei de creștere a grefei de fibroblaste în comparație cu transplantul de keratinocite. Utilizarea transplantului de allofibroblastov cultivate face posibilă pentru a salva vietile copiilor cu arsuri critice - leziuni termice de peste 50% din suprafața corpului, despre care se credea anterior incompatibilă cu viața. Este de remarcat că transplantul alogenic de fibroblaste embrionare, de asemenea, demonstrat în mod convingător nu numai regenerarea mai rapidă a rănilor și a pacienților convalescență cu diferite grade de arsură și zona, dar, de asemenea, o reducere substanțială a mortalității.

Fibroblastele autologe sunt, de asemenea, utilizate într-o zonă atât de complexă a chirurgiei plastice, ca corecție restaurativă a leziunilor cordonului vocal. De obicei utilizate pentru colagen bovin acest scop, durata de acțiune, care este limitată de imunogenitatea sa. Fiind o proteină străină, colagen bovin, colagenaza sensibil la receptor și poate provoca reacții imune, pentru a reduce riscul care au fost dezvoltate tehnologia preparatelor de colagen reticulat cu glutaraldehidă. Avantajul lor este mai mare stabilitate și imunogenitate mai scăzută, care a găsit aplicarea practică în eliminarea defectelor și a atrofiei corzilor vocale. Injecțiile de colagen autolog au fost utilizate pentru prima dată în 1995. Metodele furnizate de conservare a structurii primare a fibrelor de colagen autologe, inclusiv reticulări intramoleculare catalizata enzimatic. Faptul că fibrele de colagen naturale sunt mai rezistente la degradare de către proteaze decât telopeptides de colagen reconstituite care taie. Integritatea telopeptides importantă pentru structura cuaternară a fibrelor de colagen și reticulare între moleculele de colagen adiacente. Spre deosebire de preparatele de colagen bovin, colagen autolog nu provoacă răspunsuri imune la destinatar, dar nu este suficient de eficient ca agent umple. Corecția persistentă poate fi realizată prin producerea locală a colagenului prin transplant de fibroblaste autologe. Cu toate acestea, investigarea eficienței transplantului de fibroblaste autologe in clinica a relevat unele dificultăți. In perioada timpurie dupa transplant fibroblast efectul clinic a fost mai slabă comparativ cu cea după administrarea de colagen bovin. Când fibroblaștilor autologe cultivate nu se poate exclude posibilitatea transformării fibroblastelor normale în anormale, așa-numitele miofibroblastele, responsabile pentru dezvoltarea fibrozei și cicatrizare, evidențiată prin reducerea de gel de colagen, datorită interacțiunii specifice a fibroblaștilor și a fibrelor de colagen. Mai mult, după ce Trecerile seriale fibroblastelor in vitro își pierd capacitatea de a sintetiza proteine ale matricei extracelulare.

Cultivare Cu toate acestea, în prezent tehnica experimentală perfecționat de fibroblaste autologe umane, care elimină dezavantajele de mai sus și conduce la transformarea oncogenică a fibroblastelor normale. Fibroblastele autologe obținute prin această metodă sunt utilizate pentru a umple defectele țesuturilor moi ale feței. Într-un studiu realizat de H. Keller și co-autori (2000), au fost tratați 20 de pacienți cu vârste între 37 și 61 de ani cu riduri și cicatrici atrofice. Biopsiile cutanate (4 mm) regiunea BTE am transportat la laborator în tuburi sterile conținând 10 ml de mediu de cultură (Dulbecco mikoseptikom antibiotic, piruvat și ser fetal bovin). Materialul a fost plasat în interiorul a 3-5 plăci de cultură cu un diametru de 60 mm și incubat într-un termostat cu o atmosferă care conține 5% CO2. După o săptămână, celulele au fost îndepărtate din vase prin tripsinizare și plasate în fiole de 25 cm2. Celulele sunt administrate la pacienți într-o cantitate de 4 x 107. Efectul clinic semnificativ și de lungă durată a fost observată la pacienții cu pliuri nazolabiale de corecție, iar la pacientii cu cicatrici, după 7 și 12 luni după a treia transplantarea de fibroblaste autologe. Conform citometriei în flux, fibroblastele cultivate au produs o cantitate mare de colagen de tip I. Studiile in vitro indică contractilitatea normală a fibroblastelor injectabile. Două luni după administrarea subcutanată a fibroblastelor cultivate într-o doză de 4 x 107 celule, șoarecii nudi nu au fost detectați. Fibroblastele injectabile nu au determinat formarea cicatricilor și a fibrozei difuze la pacienți. Potrivit autorului, fibroblastele autologe implantate sunt în măsură să producă în mod constant colagen, care va da efect de întinerire cosmetică. În acest caz, din moment ce durata de viață a celulelor diferențiate este limitată, fibroblastele luate de la un tânăr pacient sunt mai eficiente decât cele obținute la vârstnici. În viitor, se presupune posibilitatea de crioconservare a culturilor fibroblastice prelevate de la donator de tineri pentru a fi transplantate ulterior un pacient în vârstă de propriile sale celule tinere. În concluzie, nu este destul de concluzia corectă că fibroblaste autologe, cu condiția siguranța lor funcționale sunt ideale pentru corectarea defectelor țesuturilor moi faciale. În acest caz, autorul însuși subliniază faptul că, în cursul anchetei au apărut și unele situații problematice legate de utilizarea sistemului de colagen a fibroblastului autolog. Efectul clinic a fost adesea mai slab decât în cazul utilizării colagenului bovin, ceea ce a provocat dezamăgire la pacienți.

În general, datele din literatura de specialitate privind perspectivele utilizării clinice a celulelor stem mezenchimale par destul de optimiste. Se fac încercări pentru utilizarea celulelor progenitoare mezoteliene autonome multipoteni mezenchimale pentru tratamentul leziunilor articulare degenerative. Se efectuează primele studii clinice ale celulelor progenitoare mezenchimale cultivate în tratamentul fracturilor complexe ale osului. Autologe și celule alogenice mezenchimale maduvei osoase stromale utilizate pentru a genera cartilajului țesut pentru transplant în corectarea defectelor cartilajului articular datorate traumatismelor sau leziuni autoimune. Metode de aplicare Practicat clinica a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente pentru corectarea defectelor osoase la copii cu progresul osteogeneză severe cauzate de mutații ale genei de colagen de tip I. După mieloabelyatsii copii-beneficiari de maduva osoasa transplantat de la donator sănătos HLA-compatibil ca măduva osoasă nefractionata poate conține o cantitate suficientă de celule stem mezenchimale pentru a reface defectului osos sever. După transplant, alogen de măduvă osoasă astfel de copii au marcat schimbări histologice pozitive în os trabecular, creșterea ratei de creștere și de reducere a incidenței fracturilor osoase. În unele cazuri, se obține un rezultat clinic pozitiv prin transplantul de măduvă osoasă și osteoblaste alogene. Pentru tratamentul fragilității osoase congenitale datorită unui dezechilibru al osteoblastelor și osteoclastelor în țesutul osos și transplant MSCs folosit. Restaurarea formării osoase în acest caz se realizează datorită chimerizării celulei de celule stromale stem și progenitoare în țesutul osos al pacienților.

Metodele de modificare genetică a celulelor stem mezenchimale donatoare sunt îmbunătățite pentru a corecta defectele genetice ale țesuturilor stromale. Se presupune ca celulele progenitoare mezenchimale vor fi folosite in curand in neurologie pentru celulele creierului himerizare direcțională și de a crea un grup de celule sănătoase, capabile să genereze deficit de enzime sau factor responsabil de manifestările clinice ale bolii. Transplantul de celule stem mezenchimale pot fi folosite pentru a restabili stroma măduvei osoase la pacienții cu cancer după radioterapie și chimioterapie, și în combinație cu celule de măduvă osoasă - pentru restaurarea hematopoieza. Dezvoltarea terapiei de substituție pentru eliminarea defectelor sistemului musculo-scheletice folosind MSCs promova inginerie in biomateriale matrice de proiectare sau biomimics care formează schelete care populează descendența celulelor stem mezenchimale.

Surse de celule stem mezenchimale

Principala sursă de celule stem mezenchimale este de măduvă osoasă de celule stem hematopoietice, care la mamifere este in mod constant diferentia in celule sanguine si sistemul imunitar, în timp ce celulele stem mezenchimale au prezentat populații mici de celule stromale de măduvă osoasă fibroblastice și ajuta la menținerea stării nediferențiată a celulelor stem hematopoietice. În anumite condiții, celulele stem mezenchimale diferentia in celule de cartilaj și os. Când placat pe un mediu de cultură în celulele stromale ale maduvei osoase mononucleare plantare densitate joasă formează colonii de celule aderente, care, de fapt, sunt fibroblaste multipotente celule precursoare mezenchimale. Unii autori au sugerat ca maduva osoasa depozitate celule stem mezenchimale neangajate, care, datorită capacității de a auto-reinnoi și cu potențial ridicat de diferențiere, furnizează toate țesuturile corpului predecesorilor celulelor mezenchimale stromale pe tot parcursul vieții organism mamifer.

În măduva osoasă, elementele de celule stromale formează o rețea care umple spațiul dintre sinusoizi și țesutul osos. Conținutul MSC latente în măduva osoasă a unui adult este comparabil cu numărul de celule stem hematopoietice și nu depășește 0,01-0,001%. Celulele stem mezenchimale izolate din măduva osoasă și care nu sunt supuse cultivării sunt lipsite de molecule adezive. Aceste MSC nu exprimă colagenul CD34, ICAM, VCAM, tipul I și III, CD44 și CD29. Prin urmare, in vitro, celulele stem mezenchimale nu sunt fixate pe substrat de cultură și sușe derivate de celule stem mezenchimale mai avansate, au format componentele citoschelet și aparatul receptor de molecule de adeziune celulară. Celulele stromale cu fenotipul CD34 se găsesc chiar și în sângele periferic, deși sunt mult mai puțin în măduva osoasă decât celulele mononucleare CD34-pozitive. Celulele CD34 izolate din sânge și transferate în cultură se atașează la substrat și formează colonii de celule asemănătoare fibroblastelor.

Se știe că în perioada embrionară, baza stromală a tuturor organelor și țesuturilor mamiferelor și a oamenilor provine dintr-un grup comun de celule stem mezenchimale înainte și în stadiul organogenezei. Prin urmare, se crede că într-un corp matur, majoritatea celulelor stem mezenchimale ar trebui să fie în țesutul conjunctiv și osos. S-a stabilit că majoritatea elementelor celulare ale stratului de țesut conjunctiv și osos loose sunt reprezentate de celule progenitoare comise, care, totuși, păstrează capacitatea de a prolifera și de a forma clone in vitro. Odată cu introducerea unor astfel de celule în fluxul sanguin total, mai mult de 20% dintre celulele progenitoare mezenchimale sunt implantate printre elementele stromale ale țesutului hematopoietic și ale organelor parenchimale.

O sursă potențială de celule stem mezenchimale este tesutul adipos, printre care de celule stem angajate gasite in diferite grade de progenitori adipocite. Elemente precursoare mature cel de tesut adipos - celule stromale vasculare, care este la fel ca progenitoare mezenchimale multipotente ale maduvei osoase se pot diferenția în adipocite sub acțiunea glucocorticoizilor, factorul de creștere asemănător insulinei și a insulinei. In cultura celulelor vasculare stromale se diferențiază în adipocite și condrocite și celule derivate din măduva osoasă a țesutului adipos se formează adipocite și osteoblaști.

În mușchi, s-au găsit și surse de tulpină stromală. Celulele de cultură primare izolate din mușchi scheletic uman, dezvaluie celulele stelate si miotubuli multinucleate. În prezența celulelor stelate din ser de cal prolifera in vitro fara semne de citodiferențiere și după adăugarea de dexametazonă în mediul de cultură al diferențierii se caracterizează prin apariția celulelor elementelor de celule cu fenotipul musculaturii scheletice și netede, oase, cartilagii, si tesutul adipos. În consecință, atât celulele progenitoare mezenchimale mezenchimale comise cât și cele neangajate sunt prezente în țesutul muscular uman. Se arată că o populație de celule progenitoare prezente în mușchii scheletici provine din celule progenitoare mezenchimale neangajate de măduvă osoasă multipotente, și diferă de celulele prin satelit myogenic.

In miocardul șobolanilor nou-născuți a constatat, de asemenea, celulele stelate adezive, potrivite pentru potențialul de diferențiere a celulelor progenitoare mezenchimale multipotente, ca sub influența dexametazonei se diferențiază în adipocite, osteoblaste, condrocite, celule musculare netede, miotuburile ale musculaturii scheletice și miocitele cardiace. S-a arătat că celulele musculare netede vasculare (pericite) sunt derivate multipotente nediferentiata celule precursoare mezenchimale perivascular. In cultura de celule stem mezenchimale perivascular exprima neted actina și receptorul factorului de creștere derivat plachetar și sunt capabili de a diferenția celulele musculare netede, cel puțin.

Un loc special în ceea ce privește rezervele stem ia cartilagii, din care un potențial reparative foarte scăzută se crede a fi din cauza deficienței celulelor progenitoare mezenchimale multipotente sau diferențiere și factori de creștere. Se presupune că celulele progenitoare mezenchimale multipotent pre donate la condro- și osteogeneză intră în țesutul cartilaginos din alte surse de țesut.

Originea țesutului și condițiile pentru comiterea celulelor progenitoare mezenchimale în tendoane nu sunt, de asemenea, stabilite. Observațiile Ekspermentalnye sugerează că în celulele timpurie postnatale tendonul iepure Ahile în culturi primare în primul pasaj și păstrează expresia colagenului de tip I și decorin, dar la cultivare ulterioară ei pierd tenotsitov markeri de diferențiere.

Trebuie remarcat faptul că răspunsul la întrebarea dacă într-adevăr, localizate în diferite țesuturi ale celulelor progenitoare mezenchimale multipotente sunt întotdeauna prezente în stroma lor sau de țesuturi de celule stem mezenchimale este compensată prin migrarea celulelor stem maduvei stromale osoase, este încă așteptată.

De asemenea, măduva osoasă și alte mezenchimale zone de țesut adult altă sursă de MSC-uri poate fi sânge din cordonul ombilical. S-a arătat că sângele din cordonul ombilical vena conține celule care au caracteristici morfologice și antigenice similare cu celule precursoare mezenchimale multipotente sunt capabile de adeziune, și nu inferior multipotent celulelor progenitoare mezenchimale de origine medulară cu potențial de diferențiere. In culturile de celule stem mezenchimale din sângele din cordonul ombilical detectate la 5 la 10% progenitori nealiniate mezenchimale multipotente. Sa dovedit că numărul lor în sângele din cordonul ombilical este invers proporțională cu vârsta gestațională, ceea ce este o dovadă indirectă a migrării celulelor progenitoare mezenchimale multipotente în diferite țesuturi în timpul dezvoltării fetale. Au existat mai întâi informații cu privire la aplicarea clinica a celulelor stem mezenchimale izolate din sângele din cordonul ombilical, precum și embrionare derivate biomaterial, care se bazează pe capacitatea cunoscută a celulelor stem fetale integrează și funcția prizhivlyatsya în organe și sisteme de țesuturi ale beneficiarilor adulți.

Căutarea de noi surse de celule stem mezenchimale

Utilizarea celulelor stem mezenchimale de origine embrionară, ca și alte celule fetale, creează o serie de probleme etice, legale, legale și legislative. Prin urmare, continuă cercetarea materialului donator celular extraembrionic. Încercarea a fost aplicarea clinică fără succes fibroblastelor pielii umane, a fost determinată prin faptul că nu numai capacitatea financiară mare de tehnologie, dar, de asemenea, diferențierea rapidă a fibrocitelor în fibroblaste care au un potențial semnificativ mai puțin de proliferare și care produc un număr limitat de factori de creștere. Progresele ulterioare în studierea biologiei MSK și a precursorilor mezenchimali ai măduvei osoase multipoteni au permis dezvoltarea unei strategii pentru utilizarea clinică a celulelor stem mezenchimale autologe. Tehnologia izolării, cultivării, reproducerii ex vivo și diferențierii direcționate a necesitat, în primul rând, studiul spectrului markerului molecular al MSC. Analiza lor a arătat că în culturile primare ale țesutului osos uman există mai multe tipuri de celule progenitoare mezenchimale multipotent. Fenotipul pro-osteoblast a fost găsit în celulele care exprimă un marker al celulelor precursoare stromale STRO-1, dar care nu poartă un marker de osteoblaste - fosfatază alcalină. Astfel de celule se caracterizează printr-o capacitate scăzută de a forma o matrice osoasă mineralizată, precum și absența expresiei osteopontinei și a receptorului hormonului paratiroidian. Derivații de celule STRO-1 pozitive care nu exprimă fosfatază alcalină sunt reprezentați de osteoblaste intermediare și complet diferențiate. Se constată că elementele celulare ale liniilor clonate ale celulelor STRO-1 pozitive ale oaselor trabeculare umane sunt capabile să se diferențieze în osteocite și adipocite mature. Diferențierea direcția acestor celule depinde de expunerea acizilor grași polinesaturați, citokine proinflamatorii - IL-1b și factorul de necroză tumorală a (TNF-a), precum și anti-inflamatorii și imunosupresoare TGF-b.

Mai târziu, sa constatat că multipotente celule precursoare mezenchimale lipsite specific numai lor fenotip inerente, dar exprimă markeri complexe, caracteristice mezenchimale, endoteliale, celule epiteliale și musculare în absența expresiei antigenelor immunophenotypic celulelor hematopoietice - CD45, CD34 și CD14. In plus, celule stem mezenchimale și produc CONSTITUTIV inductibil hematopoietic și factori de creștere non-hematopoietice, interleukine și chemokine, în celule precursoare mezenchimale multipotente exprimate receptori pentru unii factori de creștere și citokine. Printre celulele stromale elementele de bază ale corpului uman gasit dormantnye sau odihnindu celule cu immunophenotype, aproape identic cu profilul antigenic al celulelor progenitoare mezenchimale multipotente 5-fluorouracil prime - acelea și alte celule exprimă CD117, marcand „adult“ celule stem.

Astfel, un marker de celule unic pentru celulele stem mezenchimale nu a fost încă stabilit. Se presupune că celulele de repaus sunt populații nealiniate de celule precursoare mezenchimale multipotente, deoarece acestea nu exprimă markerii celulari ai angajat la osteoartrita (CBFA-1) sau adipogenesis (PPAR-y-2). Expunerea prelungită a celulelor de repaus lent proliferează la serul de vițel fetal conduce la formarea de precursori diferențiate terminologic, caracterizată printr-o creștere rapidă. Creșterea clonală a acestor celule mezenchimale de tulpină este susținută de FGF2. Se pare că celulele stem stromale derivate genomului „închis“ strans suficient sa raportat despre lipsa diferențierii spontane în MSCs -. Fără condiții speciale pentru comiterea chiar și ele nu sunt transformate în celule din seria mezenchimale.

Pentru a studia structura populației derivate mezenchimale celule stem sunt cautate proteine marker de diferențiere pe liniile de celule stromale și culturi primare. In celulele de măduvă osoasă test colonie clonală in vitro a constatat că atunci când sunt supuse culturi primare de EGF crește dimensiunea medie a coloniilor și reduce exprimarea clonală a fosfatazei alcaline, în timp ce adăugarea de hidrocortizon activează exprimarea fosfatazei alcaline, care este un marker al diferențierii osteogene de orientare MSCs. Anticorpii monoclonali împotriva STRO-1 a făcut posibilă separarea și populațiile de studiu de celule aderente STRO-1 pozitive într-un sistem eterogen culturi Dexter. Spectrul de citokine nu reglementează numai proliferarea și diferențierea celulelor hematopoietice și limfoide, dar, de asemenea, participă la formarea, formarea și resorbția țesutului scheletic prin para-, auto- și mecanismele endocrine. Eliberare mediată de receptor de mesageri secundari, cum ar fi cAMP, diacilglicerol, inositol trifosfat și Ca2 + sunt de asemenea folosite pentru analiza marker diferitelor categorii de țesuturi stromale de celule care exprimă receptorii relevanți. Utilizarea anticorpilor monoclonali ca markeri a permis stabilirea organelor limfoide stromale aparținând celulelor reticular pentru T și zonele B-dependente.

De ceva timp s-au continuat disputele științifice în legătură cu posibilitatea originii MSC din celulele stem hematopoietice. Într-adevăr, prin explantația suspensiei celulelor măduvei osoase în culturi monostrat, coloniile discrete de fibroblaste cresc în ele. Cu toate acestea, sa demonstrat că prezența precursorilor coloniilor fibroblastice și diferențierea diferitelor germeni de tesut hematopoietic, ca parte a maduvei osoase nu este dovada originii lor comune de celule stem hematopoietice. Folosind analiza discriminantă a celulelor stem maduvei osoase a constatat ca micromediul la transplantul heterotopic, celulele hematopoietice ale măduvei osoase este transferat, ceea ce demonstrează existența, în măduva osoasă independentă a populației MSC histogenetic celulelor hematopoietice.

In plus, metoda de donare selectivă a arătat în culturi monostrat de celule de stromă de măduvă osoasă a unei noi categorii de celule precursoare pentru a determina numărul lor, pentru a studia proprietățile lor, potențialul proliferativ și diferențiere. Sa constatat ca celulele stromale fibroblastice in vitro proliferează și formează colonii diploide că atunci când transplantul invers în organism asigură formarea hematopoietice organe noi. Rezultatele studiilor de clone individuale indică faptul că există o populație de celule în potențialul proliferativ și diferențiere capabile de a pretinde rolul de celule stem ale țesutului stromal, Gistogeneticheskaja independent de celule stem hematopoietice in celulele stromale precursoare. Celulele din această populație se caracterizează prin creșterea autoportantă și se diferențiază în celule progenitoare ale țesutului osos, cartilajului și măduvei reticulare.

De mare interes sunt rezultatele studiilor Chailakhyan R. Et al (1997-2001), care au fost cultivate os maduva derivate stromale celule progenitoare iepuri, cobai și șoareci de a-MEM mediu de cultură suplimentat cu ser fetal de vițel. Autorii au efectuat explantația cu o densitate inițială de 2-4 x 103 celule de măduvă osoasă per 1 cm2. Ca alimentator, celulele din măduva osoasă inactivate cu radiație omoloagă sau heterologă au fost utilizate într-o doză care menține acțiunea alimentatorului, dar blocând complet proliferarea lor. Coloniile discrete primare de două săptămâni de fibroblaste au fost tripsinizate pentru a produce tulpini monoclonale. Dovezi colonii origine clonale au fost obținute folosind markeri cromozomiale în culturi mixte de măduvă osoasă de la cobai masculi și femele, culturi vii de fotografiere secventiale, precum și în culturi mixte de măduvă osoasă de la șoareci singenici și CBA SVAT6T6. șlam transplantul de celule de măduvă osoasă proaspăt izolate cultivate in vitro sau stromale fibroblaști sub capsula renală a fost realizată în ivalonovyh schele poroase sau gelatină, precum și inactivată iepure matrice os spongios. Clone de transplant în porcul de guinea coapse capac os curățate de țesut moale și periostul, se taie epifizei si se spala complet maduva osoasa lor. Osul a fost tăiat în fragmente (3-5 mm), uscat și iradiat la o doză de 60 Gy. În capacele osoase, coloniile fibroblaste individuale au fost plasate și implantate intramuscular. Pentru transplantul intraperitoneală a fibroblaștilor stromale, crescute in vitro, am folosit tipuri O cameră de difuzie (V = 0,015 cm 3, h = 0, l mm) și D (V = 0,15 cm3, h = 2 mm).

Studiind dinamica de creștere a tulpinilor clonale Chailakhyan R. și colab (2001) , a constatat că celulele individuale, formatoare de colonii fibroblaști, precum și descendenții lor au un mare potențial proliferativ. Prin pasajul 10, numărul de fibroblaste în unele tulpini a fost de 1,2-7,2 x ¹⁰⁹ celule. În procesul de dezvoltare, au efectuat până la 31-34 duplicări celulare. Transplantul Astfel heterotopic tulpinilor maduvei osoase derivate formate prin precursori stromale câteva zeci de clone a condus la transferul micromediul măduvei osoase și educația în noua zonă , transplantul de organe hematopoietice. Autorii au ridicat problema dacă clone individuale pot tolera celulele osoase micromediul măduvei stromale, sau necesită cooperarea mai multor diferite progenitoare stromale clonogenică? Și dacă clone individuale vor fi în măsură să transfere micromediul, indiferent dacă acesta este plin de toate cele trei sânge germeni, sau diferite clone furnizează formarea de micromediul hematopoietice pentru diferite germeni? Pentru a aborda aceste probleme a fost dezvoltat o tehnologie de celule progenitoare stromale cultivare în gel de colagen , care vă permite să fotografiați de pe suprafața de fibroblaste colonii pentru transplant heterotopice ulterioare cultivate. Clonele individuale fibroblasti stromale, celule de măduvă osoasă de la șoareci CBA crescute și cobai, tăiat împreună cu un fragment al stratului de gel și heterotopic transplantat - sub capsulă de rinichi de șoareci singenici sau autologe cobaii burtă musculare. Când au fost transplantate în mușchi, coloniile de pe gel au fost plasate în capacele osoase.

Am descoperit că de 50-90 de zile după transplant de colonie fibroblaste de măduvă osoasă în 20% din au fost observate în dezvoltarea de os zona de transplant sau a țesutului osos și hematopoietic cazuri. La 5% din animalele receptoare, focarul țesutului osos format conține o cavitate plină cu măduvă osoasă. In interiorul cilindrilor osoase astfel focarele au o formă rotunjită și o capsulă construită țesutului osos, cu osteocite și stratul osteoblaste bine dezvoltat. Cavitatea măduvei osoase conține tesatura reticulară cu celule mieloide și eritroide, proporțiile care nu diferă de cea din măduva osoasă normală. Grefa de rinichi a fost un organism medulare tipic format prin transplant de măduvă osoasă nativă, în cazul în care capsula osoasă acoperă doar cavitatea medulară din capsula renală. Țesutul cu țesut îngust include elemente mieloide, eritroide și megacariocitice. Stroma canalului medular a fost sinusurile bine dezvoltat și a conținut sistemul tipic de celule de grăsime. În același timp, în domeniul transplantului de unele colonii osoase fara semne de hematopoieză sa descoperit sub capsula rinichiului. Studiul eficacității proliferative și diferențierea clone individuale au continuat pe tulpini monoclonali de măduvă osoasă de iepure, celulele sunt resuspendate în mediul de cultură și într-un burete ivalonovoy separat cântărind 1-2 mg ascuns sub capsula rinichiului donatorului de măduvă osoasă de iepure. O astfel de autotransplant a fost supusă celulelor a 21 de tulpini monoclonale. Rezultatele au fost luate în considerare în 2-3 luni. Autorii au constatat ca 14% din tulpinile osoase monoclonali măduvă transplantat corp format compus din cavitatea osului și a măduvei osoase umplut cu celule hematopoietice. În 33% din cazuri de tulpini transplantate format os compact cu diferite cavități de dimensiuni ostootsitami zidite în osteoblaste și stratul dezvoltat. În unele cazuri, bureți transplantate clone dezvoltat reticulul fără os sau celule hematopoietice. Uneori, formarea stromei reticular a avut loc cu o rețea de sinusoide bine dezvoltate, dar nu populat celulele hematopoietice. Astfel, rezultatele obținute au fost similare cu cele obținute prin transplantul de clone de pe gel de colagen. Cu toate acestea, în cazul în care transplantul de clone cultivate pe substrat a dus la formarea de țesut de măduvă este de 5% din os - 15%, iar materialul reticular - in 80% din cazuri, anticorpul monoclonal de transplant tensionează formarea de celule de măduvă osoasă a fost observată la 14% din cazurile de os - în 53% și reticular - în 53% din cazuri. Potrivit autorilor, acest lucru indică faptul că condițiile pentru punerea în aplicare a potențialelor proliferative și diferențierii fibroblasti stromale când transplantate pe schele poroase au fost mai optime decat transplantați lor in oase si acopera substratul de colagen. Nu este exclus faptul că utilizarea unor metode mai avansate de cultivare și transplantul de feedback clone pot îmbunătăți condițiile de punere în aplicare a clonelor sale potențiale de diferențiere și de a schimba aceste relații. Într-un fel sau altul, dar valoarea principală a cercetării constă în faptul că unele dintre clone celule stromale capabile să formeze țesut osos asigurând în același timp micromediul hematopoetice stromale imediat pentru trei muguri de sânge de măduvă osoasă: eritroide, mieloide și megacariocitară, creând o suficient de mare footholds tesut hematopoietic si unele masă osoasă.

Mai mult, autorii au rezolvat problema capacității acestor tipuri de diferențiere celulară a celulelor progenitoare stromale clonale individuale în condițiile unui sistem închis de camere de difuzie. Mai mult, a fost necesar să se determine dacă clone individuale ale exponat pluripotente sau de afișare pentru potențialul de diferențiere necesită interacțiunea cooperativă a mai multor clone cu un citodiferentiere semn fix, raport diferit de ceea ce determină formarea preferențială a oaselor, cartilajelor sau reticular. Prin combinarea a două abordări metodologice - monoclonal izolate celule progenitoare stromale ale măduvei osoase și transplant le în camerele de difuzie, Chailakhyan R. și colab (2001) au obținut rezultate care au permis să se apropie de înțelegerea organizării structurale a stromei măduvei osoase. Transplantul de tulpini monoclonali celule progenitoare stromale în celule de tip O, a dus la formarea atât a țesutului osos și cartilajul, demonstrând capacitatea puilor de un celule stromale care formează colonii ce formează simultan oase si cartilaje. Presupunerea că țesutul osos și cartilaginos provine din celula progenitoare stromală comună a fost repetat exprimată în mod repetat. Cu toate acestea, această ipoteză nu a avut o confirmare experimentală corectă. Oase si formarea cartilajului in camere de difuzie a fost necesară pentru a demonstra existența celulelor stem includ celule precursoare stromale medulare comune acestor două tipuri de țesut.

Apoi , 29 de tulpini clonale doua și a treia treceri, culturile primare derivate din măduva osoasă de iepure au fost plasate în camere de difuzie și implantate intraperitoneal animale omoloage. Studiile au arătat că 45% din tulpinile monoclonale ale măduvei osoase au potențe osteogene. În mod excepțional țesătură reticulară conținea 9 camere, dar cu osul si tesutul cartilaj este încă prezent în camerele 13, ceea ce reprezintă 76% din toate tulpinile. În camerele de tip O, unde a fost posibilă diferențierea atât pentru țesutul osos, cât și pentru cel cartilaginos, au fost studiate 16 tulpini. În patru camere (25%) s-au format atât țesut osos, cât și țesut cartilaginos. Trebuie din nou remarcat faptul că studiile Chailakhyan R. Et al (2001) celule sușe individuale tulpina de celule constând din de la 31 la 34 dublări a suferit, iar progeniturile lor a fost 0.9-2.0 x 10 ⁹ celule. Numărul de mitoze la care s-au expus celulele precursoare ale tulpinilor policlonale a fost practic la fel ca cel al celulelor tulpinilor monoclonale. Astfel , rata de dezvoltare a tulpinilor policlonale, în special în prima fază a formării lor, în mare măsură dependentă de numărul de colonii utilizate pentru a iniția tulpini. Tulpini diploide de fibroblaști embrionare umane (WI-38) pentru 12-15 reklonirovanii th nivelurile de dublare a format colonii diametru diferite și în conținutul lor de celule. Coloniile mari care conțin mai mult de 103 celule au fost numai 5-10%. Odată cu creșterea numărului de diviziuni, procentul de colonii mari a scăzut. Mono și policlonali stromale de măduvă osoasă tulpinile fibroblast reținute un cromozom diploide set după 20 sau mai multe dublări, și tendința de dezvoltare a fost comparabil cu dinamica tulpinilor diploide fibroblaste embrionare. Analiza potențialului diferențierii celulelor progenitoare stromale ale măduvei osoase specifice, efectuate de tulpini monoclonali de transplant în camere de difuzie, a aratat ca jumatate dintre ei osteogenic. Coloniile mari au reprezentat 10% din numărul total. În consecință, numărul celulelor care formează colonia osteogenă a corespuns la aproximativ 5% din populația totală a acestora. În masa totală a celulelor progenitoare osteogene identificate de către autori, au existat celule capabile să formeze simultan țesut osos și cartilaginos. Pentru prima dată a constatat că pentru aceste două tipuri de țesuturi în organismul adult este comună celulei precursoare: 25% dintre clone testate au fost create de celule similare, iar numărul lor în populația generală a celulelor progenitoare nu a fost mai mică de 2,5%.

Astfel, transplantul heterotopic al clonelor individuale ale fibroblastelor din măduva osoasă a deschis noi aspecte ale organizării structurale a populației de celule progenitoare mezenchimale. Celulele stromale găsite precursoare capabile să transfere micromediul specific imediat pentru toate stem hematopoietic care număr printre clonele investigate mai mari pe diferite modele este de la 5 la 15% (0,5-1,5% din numărul total de celule precursoare detectate). Împreună cu clonele, transferul complet micromediul măduvei osoase, sunt celule precursoare, deterministe numai la formarea oaselor, care se formează atunci când transferat într-un sistem deschis, osul care nu sprijină dezvoltarea hematopoieza. Numărul lor din numărul total de celule progenitoare este de 1,5-3%. Unele dintre aceste celule pot forma o țesut osos cu o perioadă limitată de auto-întreținere. În consecință, populația celulelor progenitoare stromale este eterogenă în potențialul său de diferențiere. Printre ei există o categorie de celule, susținând rolul de celule stem stromale capabile de a diferenția în toate cele trei dimensiuni inerente în țesutul osos stromă a măduvei osoase, formarea oaselor, cartilajelor și țesut reticular. Aceste date ne permit să sperăm că, cu ajutorul diferitelor markeri de celule va fi posibil să se determine contribuția fiecărui tip de celule stromale în micromediul organizației specifice și să sprijine hematopoiezei in culturi Dexter.

Caracteristicile celulelor stem mezenchimale

In ultimii ani, a constatat că în culturi staționare de măduvă osoasă mezenchimale celule precursoare multipotente au prezentat o populatie limitat de celule agranular mici (RS-1) celule, caracterizate prin capacitatea redusă de colonizare și absența expresiei antigenului Ki-67 specific pentru celule proliferante. Parametrii antigenici ai celulelor latente RS-1 diferă de spectrul de antigen al celulelor progenitoare stromale proliferează rapid. Sa constatat că o rată ridicată de proliferare a celulelor precursoare angajate a fost observată numai în prezența celulelor RS-1. La rândul său, celulele RS-1 crește rata de creștere sub influența factorilor secretați de cele mai mature celule precursoare multipotent mezenchimale derivate. Se pare că celulele RS-1 sunt o subclasă de MSC-uri neangajate care sunt capabile să recicleze. In rezistente la celulele stromale precursoare 5-fluorouracil ale măduvei osoase caracterizate printr-un conținut scăzut de ARN și un nivel ridicat de exprimare a genei ornitin vitro - marker de celule non-proliferante.

Celulele progenitoare de reproducere stromale intensive începe după fixarea lor pe substrat. Când acest profil este exprimat marker al celulelor slab diferențiate: SH2 (TGFp receptor (3), SH3 (proteina de semnalizare domeniu), colagen de tip I și III, fibronectina, VCAM-1 receptorilor de adeziune (CD106) și ICAM (CD54), caderina-11 , CD44, CD71 (receptor transferină), CD90, CD120a și CD124, dar fără exprimarea markerilor caracteristice celulelor stem hematopoietice (CD34, CD14, CD45). Creștere clonal permite pasate în mod repetat celule stem mezenchimale pentru a produce o cultură a multor omogene genetic pluripotente stromal progenitoare celule. Cerea 2-3 trecerea numărului lor ajunge la 50-300,000,000. În cultura de densitate suficientă după stoparea proliferării celulelor progenitoare stromale, spre deosebire de fibroblaști tisulare hematopoietice se diferențiază în adipocite, miocite, celule de cartilaj, si tesutul osos. Combinarea semnalelor de reglementare trei diferențiere care cuprinde 1-metil-izobutilksantin (inductor al formării cAMP intracelular), dexametazonă (un inhibitor al fosfolipazei a și C) și indometacin (un inhibitor al ciclooxigenazei, activitatea de scădere a tromboxan și) se transformă în adipocite și 95% celule progenitoare mezenchimale. Formarea adipocyte din celulele stromale imature au confirmat exprimarea genei lipoprotein lipazei, identificarea histochimice a apolipoproteine și a receptorilor peroxysomal. Celulele din aceeași clonă influențate de TGF-b în mediu fără ser creează o populație omogenă de condrocite. Cultura celulară multi-strat de matrice extracelulara cartilajul este caracterizat dezvoltat constând din proteoglicanului și colagen de tip II. Mediul nutritiv cu complex de 10% ser fetal semnale efect de diferențiere constând din b-glicerofosfat (donoare fosfat anorganic), acid ascorbic și dexametazonă, în aceleași celule progenitoare progenitoare cultura stromale conduce la formarea agregatelor celulare. In astfel de celule, există o creștere progresivă a activității fosfatazei nivelurilor și osteopontina alcaline, indicând formarea mineralizării osoase care celulele au confirmat o creștere progresivă a calciului intracelular.

Potrivit unora, capacitatea de celule stem mezenchimale de a diviza la nesfârșit și reproducerea diferitelor tipuri de celule filiatie mezenchimale, combinate cu un grad ridicat de plasticitate. Atunci când se administrează în ventricule sau materia alba celule stem mezenchimale migrează în parenchimul țesutului nervos și se diferențiază în linie de celule neuronale sau gliale derivate. În plus, există informații despre MSC transdifferentiation in celulele stem hematopoietice atat in vitro cat si in vivo. O analiză mai aprofundată, în unele studii au determinat ductilitate deosebit de ridicat al MSCs, care se manifestă în capacitatea lor de a se diferenția în astrocite, oligodendrocite, neuroni, cardiomiocite, celulele musculare netede si a celulelor musculare scheletice. Într-o serie de studii transdifferentsirovochnogo potențial de MSCs in vitro și in vivo a constatat ca celulele mezenchimale precursoare multipotente de origine medulară diferentierea terminala in linii de celule care formeaza oase, cartilagii, musculare, nervoase si tesutul adipos, precum tendoanele și stromei care acceptă hematopoieza .

Cu toate acestea, în alte studii, nici un semn de restrictie pluripotency genomului de celule stem mezenchimale și nu au putut fi detectate populații de celule stromale progenitoare, dar pentru a verifica posibile celulele stromale pluripotente a fost investigat mai mult de 200 de clone MSC izolate dintr-o cultură primară. Marea majoritate a clonelor in vitro păstrat capacitatea de a se diferenția în osteogenic, condrogenică și direcții adipogene. Când excluzând probabilitatea de migrare a celulelor primitoare prin transplant de celule stem mezenchimale sub capsula rinichiului sau în camere de difuzie a aparut ca celulele stromale precursoare in situ păstrează fenotip eterogen, ceea ce indică fie absența factori de restricție transplant zonă sau absența singur MSCs pluripotente. În același timp, a permis existența unui tip rar de celule somatice stem pluripotente, care sunt precursori comuni de celule stem adulte.

Pe pluripotente celule stem mezenchimale multi, dar nu este adevărat constituie o foarte mică parte din celule de măduvă osoasă și sunt capabile, în anumite circumstanțe, atunci când sunt cultivate in vitro pentru a prolifera fără a intra în diferențiere, după cum reiese din angajamentul lor descendența induse de celule in oase, cartilaj, grăsime, țesut muscular , precum și în tenocite și elemente stromale care susțin hematopoieza. De obicei, expunerea continuă în mediu de cultură cu ser fetal de vițel provoacă MSCs ieșire în stromale celulelor progenitoare angajate, descendența care suferă diferențierea finală spontană. In vitro, este posibil pentru a realiza formarea osteoblastilor direcțională prin adăugarea la acidul dexametazona condiționat mediu, beta-glicerofosfat și ascorbic, în timp ce combinația de diferențiere semnalelor dexametazonă și insulină induce formarea de adipocite.

A stabilit că înainte de a intra în faza diferențierii terminale a maduvei osoase MSCs pentru a crea anumite condiții de cultură inițial se diferențieze în celule stem mezenchimale-fibroblastice. Derivații acestor celule in vivo sunt implicate în formarea oaselor, cartilajelor, tendoanelor, grăsime și țesut muscular precum și suportul stromale hematopoieza. Mulți autori înțeleg termenul „celule progenitoare mezenchimale multipotente“, ca de fapt MSCs, iar celulele stromale angajate progenitoare și țesuturi mezenchimale de măduvă osoasă. Analiza clonală a celulelor mezenchimale progenitoare multipotente de origine medulară a arătat că puțin mai mult de o treime din clonele diferențiate în osteoartrită, hondro- și adipocite, în timp ce celulele alte clone au potențial osteogenic și o formă numai hondro- și osteocite. Această clonă de celule precursoare mezenchimale multipotente ca DIU-9, în condiții adecvate micromediu diferențiate în celule cu un fenotip caracteristicile funcționale și nu numai de osteoblaste, condrocite și potsitov adice, dar celulele stromale care susțin hematopoieza. Izolat din celule de măduvă osoasă de șobolan fetale clona RCJ3.1 diferentiate celulele mezenchimale ale fenotipuri diferite. Prin acțiunea combinată a acidului ascorbic, b-glicerofosfat, și dexametazonei din elemente celulare ale acestei clone este formată mai întâi miocite multinucleate și apoi, succesiv, adipocite, condrocite și insulițe osul mineralizat. Populația de celule granulare din periostul feții de șobolan corespunde celulelor progenitoare mezenchimale multipotente nealiniate, caracterizată printr-o rată scăzută de proliferare, nu exprimă markeri de diferențiere și diferențiate în condiții de cultură pentru a forma hondro-, osteoartrită și adipocite și celulele musculare netede.

Astfel, trebuie recunoscut faptul că problema genomului plyuri- sau multipotenței de celule stem mezenchimale este în continuare deschis, care afectează, prin urmare, prezentarea potențialului de diferențiere a celulelor progenitoare stromale, care este, de asemenea, nu este complet instalat.

Caracteristica experimentală demonstrată și importantă a celulelor stem mezenchimale este capacitatea lor de a părăsi nișa de țesut și de a circula în fluxul sanguin general. Pentru a activa programul genetic de diferențiere, astfel de celule stem circulante ar trebui să cadă în micromediul adecvat. Se arată că, atunci când este administrată sistemic fluxul sanguin animalelor primitoare celule implantate în CSM diferite organe și țesuturi imatură, apoi diferentiate in sange celule, miocite, adipocite, condrocite și fibroblaști. În consecință, în zonele tisulare locale are loc interacțiunea Signal-reglementare a celulelor stromale precursoare angajate și nealiniate, precum și între acestea și celulele mature din jur. Se presupune că inducerea diferențierii se realizează factori paracrine de reglementare de origine mezenchimală și nemezenhimalnogo (factori de creștere, eicosanoizi, molecule ale matricei extracelulare) care asigură relațiile spațiale și temporale din micromediul progenitoare mezenchimale multipotential. Prin urmare, deteriorarea locală a țesutului mezenchimal ar trebui să ducă la formarea unei zone de micromediu multipotente celule precursoare mezenchimale diferă calitativ de semnale complexe de reglementare țesuturi intacte, în care au loc procese fiziologice in loc de regenerare reparative. Această distincție este esențială în ceea ce privește expertiza în fenotipul celulei pagube normale și induse la micromediul.

Conform ideilor, aici se află mecanismele diferenței fundamentale a două procese cunoscute - regenerarea fiziologică și proliferarea inflamatorie. Prima dintre ele se termină cu restabilirea compoziției țesutului celular specializat și a funcției sale, în timp ce rezultatul procesului de proliferare este formarea elementelor țesutului conjunctiv mature și pierderea funcției zonei țesutului deteriorat. Astfel, pentru dezvoltarea programelor optime de utilizare a celulelor progenitoare mezenchimale multipotent în medicina regenerativ-plastic, este necesar un studiu atent al caracteristicilor influenței factorilor micro-mediu asupra diferențierii MSC.

Dependența structurii compartimentului de celule stem asupra regulatoarelor para- și autocrine celulare, a căror expresie este modulată de semnale externe, nimeni nu se îndoiește. Printre funcțiile factorilor de reglementare, cele mai importante sunt controlul divizării asimetrice a MSC și exprimarea genelor care determină etapele de comision și numărul de diviziuni celulare. Semnalele externe, pe care depinde dezvoltarea ulterioară a MSC, sunt furnizate de micromediul lor. In MSCs imature sa prolifereze timp suficient de lung, menținând în același timp capacitatea de a se diferenția în linia adipocite, miofibroblaste, țesut stromal hematogene, celulelor cartilajului și osului. Se constată că o populație limitată de circulant elemente de celule stromale SB34-negativ din circulația generală este returnată în țesutul stroma măduvei osoase, este transformată într-o linie unde CD34-pozitive celule stem hematopoietice. Aceste observații sugerează că celulele mezenchimale recirculării progenitoare in fluxul sanguin de tesut ofera suport pentru echilibrul celulelor stem stromale in diferite organe prin mobilizarea pool comun de celule stromale de măduvă osoasă imature. Diferențierea in celule MSCs cu mai multe fenotipuri mezenchimale și participarea lor la repararea sau regenerarea oaselor, cartilajelor, tendoanelor si tesutul adipos in vivo au demonstrat prin modele de transfer adoptive la animale experimentale. Potrivit altor autori, migrația îndepărtată a patului vascular MSCs este combinat cu o deplasare locală sau celule mezenchimale precursoare multipotente korotkodistantnym in tesutul la repararea cartilajului, regenerarea musculară, și alte reacții de reducere.

Rezervele locale stem stromale fundații țesuturi joacă un rol sursă de celule într-un fiziologice procesele de regenerare a țesutului și sunt completate de MSCs de transport la distanță ca cheltuielile stromale resursele stem tesut. Cu toate acestea, au nevoie de mobilizare de urgență a capacității reparatorie celulare, cum ar fi traumatisme multiple, în procesele de regenerare participă reparatorii MSCs întregului tren, iar la periferie prin vasele de sange recrutat celule precursoare mezenchimale de măduvă osoasă.

Transplantul de celule stem mezenchimale

Există anumite paralele între procesele de regenerare fiziologică a țesuturilor și formarea lor în timpul perioadei de dezvoltare intrauterină. Embriogenezei oamenilor și a mamiferelor, formarea diferitelor tipuri de celule specializate derivate din ecto, mezo și endodermica germen piscina straturi, dar cu participarea obligatorie a mezenchimului. Rețeaua celulară liberă de țesut mezenchimic embrionic efectuează numeroase funcții de reglementare, metabolice, scheletice și morfogenetice. Organismele provizorii Bookmark se efectuează numai după mezenchimul de condensare în detrimentul celulelor progenitoare de creștere clonogenic care generează semnale morfogenetice primare organogeneză. Derivații stromali ai mezenchimului embrionic creează un cadru celular al organelor provizorii și formează baza pentru aprovizionarea lor cu energie în viitor prin creșterea sângelui primar și a vaselor limfatice. Cu alte cuvinte, elementele stromale ale unității microcirculatorii ale organelor fetale apar înainte de formarea unităților lor structurale-funcționale. În plus, migrația activă a celulelor mezenchimale în timpul organogenezei oferă orientare spațială dezvoltării organelor datorită marcajului limitele lor de volum Restriction mutațional HOX-tepov. Pe schela stromală există, de asemenea, un ansamblu de unități structurale și funcționale de organe parenchimatoase, care adesea conțin celule morfogenetic și complet diferite. În consecință, în embriogeneză, funcțiile mezenchimale sunt primare și se realizează prin generarea de semnale de reglementare care activează proliferarea regională și diferențierea celulelor epiteliale progenitoare. Celulele mezenchimice embrionare produc factori de creștere cum ar fi LEG, HGF-b, CSF, pentru care celulele progenitoare parenchimatoase au receptori corespunzători. În țesutul matur matur al organismului adult, rețeaua celulară stromală generează de asemenea semnale pentru a menține viabilitatea și proliferarea celulelor progenitoare de origine non-mezenchimală. Cu toate acestea, semnalele de reglementare a spectrului stromale în postnatală ontogeneză altele (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF etc.) și vizează asigurarea regenerării fiziologice sau reparării zonelor afectate de țesuturi. În plus, caracteristicile spectrale ale factorilor de reglementare stromali în fiecare tip de țesut și chiar în cadrul aceluiași organ sunt diferite. În special, hematopoeza și lymphopoiesis la multiplicarea și diferențierea hematopoietic și celulelor imunocompetente apare numai în anumite organe, în cadrul cărora acționează micromediului stromal asigurarea condițiilor pentru maturarea celulelor hematopoietice și limfoide. Depinde de factorii de reglementare micromediul depinde de capacitatea celulelor hematopoietice si limfoide pentru a repopula organismului de a prolifera și să se maturizeze în nișe sale de microstructură.

Printre componentele matricei extracelulare, care produc celule mezenchimale precursoare multipotente, trebuie remarcat faptul fibronectina, laminina, colagenul și proteoglicanii, precum și CD44 (hialuronan și receptorul osteopontinul) primind rolul principal în organizarea interacțiunii intercelular și formarea matricei extracelulare în măduva osoasă și os . Este dovedit faptul că mezenchimale de măduvă osoasă, celule multipotente crea micromediul stromale redshestvenniki, care emite semnale inductive și de reglementare nu numai MSC, dar, de asemenea, precursorii hematopoietice și celule stem maduvei osoase nemezenhimalnye. Este cunoscut faptul că MSCs implicate în hematopoieză măsurată prin capacitatea lor de a se diferenția în celule stromale care susțin hematopoieza, în care semnalul activ de orientare MSK obținute direct din celule stem hematopoietice. Acesta este motivul pentru care cultura de celule stromale progenitoare de rețea este baza pentru alimentarea tuturor clonelor de celule hematopoietice.

Într-o intensitate organism matur de hemodializă și lymphopoiesis într-o stare de echilibru dinamic cu „cheltuieli“ de celule sanguine mature si celulele sistemului imunitar la periferie. Deoarece celulele stromale de măduvă osoasă și organele limfoide rareori actualizate, structuri semnificative de restructurare stromale nu se produce în ele. Adu sistemul de echilibru dinamic este posibilă cu ajutorul unor deteriorări mecanice la orice organe hemo sau lymphopoiesis, ceea ce duce la același tip de modificări secvențiale care afectează nu numai și nu atât de mult de celule hematopoietice sau limfoide, ca structuri stromale deteriorate de organe. În procesul de regenerare cadru stromal format în principal reparatoare, care apoi repopularea hematopoietice sau celule ale sistemului imunitar. Acest fapt lung cunoscut face regenerarea posttraumatic modelul convenabil pentru studierea micromediul stromale de organele hematopoietice. În special, pentru investigarea regenerării reparatorie a măduvei osoase este utilizat mecanică golirea cavității medulară a oaselor lungi - chiuretaj, permițând să aducă rapid și eficient țesutul hematopoietic dintr-o stare de echilibru dinamic. Pentru studierea procesului de regenerare reparatorie a componentelor hematopoietice și măduvă stromal osoasă după golirea mecanică a cavității medulare a cobailor tibia constatat că între indicatorii regenerarea celulelor hematopoietice și stromale (numărul de celule hematopoietice, concentrația și cantitatea de celule progenitoare stromale) nu există nici o corelație directă. In plus, sa constatat că creșterea populației celulelor progenitoare stromale are loc la o dată anterioară după chiuretaj, și ei înșiși fibroblasti stromale sunt fosfatazopolozhitelnymi, ceea ce este caracteristic tesut osteogenic. De asemenea, sa stabilit că chiuretaj 3-5 oaselor lungi duce la creșterea populației de celule din măduva osoasă și osul neoperate chiar și în splină, care la cobai este doar corpul lymphopoietic.

Procese imagine reparative morfologici în măduva osoasă kyuretirovannyh tibiale cobailor în general corespunde datelor din literatură obținute în experimente pe animale din alte specii, dinamica schimbărilor care au loc după îndepărtarea țesutului hematopoietic este aceeași pentru toate speciile și diferența se referă numai la parametrii de timp . Morfologic Procedura de fază pentru refacerea hematopoiezei în cavitatea medulară este golit în procesele succesive organizarea formarea cheagurilor de sânge os din fibre grosiere, resorbția sale, sinusoidele și stromei formarea reticular, care repopulată în continuare elemente hematopoietice. Numărul de celule precursoare hematopoietice din măduva osoasă crește procesul de regenerare a țesutului în creștere în paralel a conținutului de celule stem hematopoietice.

Gerasimov Yu et al (2001) au comparat modificările numărului de celule hematopoietice și cantitatea de precursori de celule stromale în fazele individuale ale procesului de regenerare. Sa constatat că modificările cantitative în celulele măduvei osoase în kyuretirovannoy osoase corespunde dinamicii caracteristicilor morfologice de regenerare. Reducerea în timpul primelor trei zile de conținut de celule în autori regenera atribuie pierderea celulelor hematopoietice datorită efectelor adverse ale micromediul, care creează țesut reticular crește în măduva osoasă care rămâne în epifiza și în acesta din urmă pentru a forma osteoid focare si leziuni vasculare cu chiuretaj. 7-12 zi ridicarea th celule yaderosoderzhaschih coincide cu apariția focii individuale în celulele stromale hematopoietice zone de proliferare mieloide. In a 20-a zi, există porțiuni semnificative ale măduvei osoase regenerate și sinusurilor bine dezvoltate, care este însoțită de o creștere semnificativă a numărului total de celule. Cu toate acestea, numărul de elemente hematopoietice în această perioadă este de 68% din nivelul controlului. Acest lucru este în concordanță cu datele publicate anterior care arată că numărul de celule formatoare de sânge după chiuretaj atinge standarde doar 35-40 zile după operație.

În perioada post-traumatică timpurie, principala sursă celulară pentru restabilirea hemopoiezei este cea a elementelor celulare conservate în chiuretaj. Ulterior, principala sursă de regenerare a țesutului hematopoietic al măduvei osoase sunt celulele stem, repopulând zonele stromale libere. În ceea ce privește anumite categorii de celule stromale (endoteliale, reticular și osteogenice), sursele pentru educația în restructurarea cavității medulare, rămân neclare. Rezultatele lui Yu.V. Gerasimova et al (2001) arată că, în osul măduva rămasă după concentrarea celulară chiuretaj formatoare de colonii de fibroblaste semnificativ mai mari decât în măduva osoasă normală. Autorii cred ca chiuretaj este eluarea selectivă mai intensă a celulelor hematopoietice, în comparație cu colonie stromal celule care sunt implicate în formarea stromei și mai ferm legate de substanța de bază decât celulele hematopoietice formare.

Dinamica modificărilor numărului de celule care formează colonii de fibroblaști se corelează cu intensitatea proceselor osteogenezei ulterioare trabecular resorbția osoasă și formarea reticular stromei care populează celulele hematopoietice. Majoritatea celulelor progenitoare stromale formează un țesut osos gros-fibros și o stromă reticulară la timpii de regenerare indicați. Pentru fracturi ale osului femural în condițiile osteosinteză prelungite a 5-a zi, în zona de regenerare crește concentrația de celule și numărul de fibroblaste formatoare de colonii și formarea osoasă la intensiv numărul lor este crescut de 6 ori. Se știe că celulele din măduva osoasă care formează colonii fibroblaste posedă proprietăți osteogene. Numărul celulelor progenitoare stromale crește înainte de colonizarea zonei măduvei osoase cortexate de către celulele hematopoietice. Acest lucru este în acord cu dovezile că celulele stromale asigură formarea unui micromediu hematopoietic. Evident, crearea micromediului hematopoietic corespunde unui anumit nivel de regenerare a țesutului stromal, și crește numărul celulelor hematopoietice asupra stromale de expansiune adecvat pentru cap de pod hematopoieza.

De cel mai mare interes sunt autorii de date pe care imediat după chiuretaj crește numărul de precursori de celule stromale în părți îndepărtate ale scheletului. Pornind de la ceasul al șaselea și de a douăzecea zi inclusiv a tibiei contralateral se observă în mai mult de două ori creșterea concentrațiilor și a numărului de celule care formează colonii de fibroblaști. Mecanismul acestui fenomen este probabil legat de faptul că un prejudiciu masiv maduvei osoase rezultat formarea unui număr mare de cheaguri de sânge în timp ce distruge simultan un număr semnificativ de trombocite și eliberarea în sânge derivat din trombocite factorul de creștere (RBSK), care este cunoscut de a provoca proliferarea celulelor care formează colonii fibroblaste situate în organism în afara bazinului proliferativ. In experimentele pe iepuri administrarea locală MSCs promovează refacerea cartilajului chirurgical deteriorate de genunchi, care poate fi asociată cu formarea de condrocite derivate din MSCs introduse. Totuși regenerarea reparatorie a defectelor osoase la șobolanii de laborator este îmbunătățită în mod semnificativ atunci când se utilizează celule stem mezenchimale închise într-un cadru de ceramică. Prin urmare, putem presupune că, dacă nu RBOK, atunci orice alt factor, derivat din celulele stromale deteriorate, are un efect stimulator îndepărtat asupra proliferării celulelor progenitoare mezenchimale in zonele intacte ale măduvei osoase și stimulează migrarea acestora în zona țesutului măduvei defectului osos. La rândul său, acest lucru contrar datelor din literatură din anii precedenți, care indică faptul că celulele stromale sunt responsabile pentru micromediul, spre deosebire de celulele hematopoietice nu sunt capabile să migreze și să provină din surse locale.

Cu toate acestea, rezultatele studiului Gerasimov Yu et al (2001) sugerează că aplicarea traumei mecanice cauzează nu numai o restructurare accentuată a țesutului stromal în oase kyuretirovannoy, dar, de asemenea, modificări semnificative ale stromei oase îndepărtate intacte, adică, există un răspuns sistemic țesut stromal pentru traume locale. Iar atunci când este aplicat politraumatism - chiuretaj multiple - această reacție este amplificat și a observat nu numai în os operate și părțile îndepărtate ale scheletului, ci și în organele limfoide, în special splina. Mecanismul de un astfel de răspuns al sistemului de țesut stromal al măduvei osoase și splina și politraumatism trauma locală rămâne necunoscută. Se presupune că acest proces este asociat cu acțiunea factorului umoral eliberat stroma mezenchimale osoase medular cavitatea măduvei. Posibilitatea de a face celulele stromale medulare și splină organonespetsificheskogo factor umoral responsabil pentru proliferarea celulelor, formatoare de colonii fibroblastele indică date despre colonia lor stimularea activității în culturi monostrat de măduvă osoasă.

În acest sens, este de remarcat faptul că atunci când se administrează sistemic celule precursoare mezenchimale multipotente repopulată derivații lor nu numai măduva osoasă, dar și alte țesuturi, care este utilizat, în special pentru terapia genică. Se arată că, după administrarea intravenoasă a unor cantități mari de MSCs cu genomul șoarecilor de tip sălbatic cu celule de colagen genei mutante I donator înlocuiesc până la 30% din celulele din os si cartilaj de tesut al destinatarului, iar celulele de șoarece stem mezenchimale transfectate care secretă IL-3 umană, timp de 9 luni sprijinind în mod eficient hematopoezei în cazul administrării simultane a acestora cu celule stem hematopoietice umane în șoareci imunodeficienți.

[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Modificarea genetică a celulelor stem mezenchimale

Succesul experimental suplimentar al modificării genetice trebuie remarcat faptul MSCs transfectarea genei factorului IX în MSCs umane urmată de transferul de celule Transfectante șoareci imunodeficienți, ceea ce duce la apariția în sânge Antihemophilic Factorul B timp de 8 săptămâni după transplant. În acest experiment, s-a efectuat modificarea posttranslațională a factorului IX cu y-glutamil carboxilază în celulele transfectate. Transducția cu MSCs retroviral vector care codifică factorul IX uman, a avut mai puțin succes - introducerea ulterioară a acestor celule cu câine hemofilie la un nivel terapeutic al factorului IX, care susține normale hemostazei de coagulare intensitate, numai timp de 12 zile.

Transplantarea celulelor stem mezenchimale în parenchimul creierului animalelor a arătat că celulele imature donatoare sunt transformate atât în populația neuronilor, cât și în glanda. Grefeze derivati neuronale donator sănătos țesut mezenchimal teoretic face posibila corectarea anomaliilor genetice ale metabolismului cerebral la pacienții cu boala Gaucher și alte tulburări ale metabolismului lipidic, glucidic sau gangliozide.

Continuând condiții de căutare experimentale transdifferentiation a celulelor stem in celule precursoare stromale ale măduvei osoase în țesutul nervos și ficatul. Atenția cercetătorilor este axată pe combinații de inductori de diferențiere și medii de condiționare speciale. În special, pentru izolarea culturii primare cu 10% ser fetal de vițel, celulele osoase stromale spălate și resuspendate în mediu de cultură DMEM / F 12 (1/1) sunt însămânțate la o densitate de 200.000 / cm2. După 24 de ore, celulele neaderente sunt îndepărtate și atașate la celulele fibroblaste din plastic sunt cultivate pentru o săptămână. Pentru diferențierea celulelor stromale medulare la neuroblastele utilizat mediu condiționat obținut prin cultivarea culturii de trei zile de fibroblaste embrionare de șoarece primar, precum și între DMEM / F12 (1/1) cu ser fetal de vițel 2%, și suplimentat cu 20 ng / ml sau 10'6 M LiF acid retinoic (neyroinduktory care sunt aplicate la diferențierea neuronale de șoarece embrionare celule stem si umane). Diferențierea celulelor stromale ale măduvei osoase în celule precursoare în hepatocite a fost indusa de mediu conditionat creat ca urmare a trei zile cultivarea unei culturi primare de celule hepatice de șoarece embrionare în DMEM / F12 (1/1) mediu suplimentat cu ser fetal de vițel 10%.

Aici trebuie remarcat din nou că celulele care formează colonii ale stroma măduvei osoase sunt heteromorfe și pot fi împărțite în două tipuri. Primul tip include celule asemănătoare fibroblastelor care formează celule filopodice cu nuclei mari și unul sau două nucleoli. Al doilea tip este reprezentat de celule mici de formă în formă de ax. In ambele tipuri de culturi celulare din mediul condiționat obținut pe un strat de alimentare de fibroblaste embrionare de șoarece primar, și pe-Z 4-a zi de cultură de celule par Similar cu neuroblasts. În acest stadiu, ele au adesea o formă în formă de ax cu unul sau două procese lungi care se termină cu filopodia. Celulele piramidale sau stelate cu dendrite scurte sunt mai puțin frecvente. Dendrite un neuroblastele au expansiune tipic (creștere rinichi) și ramificarea în porțiunea sa distală, cealaltă - cu conuri de crestere distincte filopodiilor, prin care are loc o creștere dendrite. Caracteristici morfologice similare (conuri de creștere rinichi și filopodiilor a) neuroblastomul inerente, diferentia in neuroni, sunt descrise în detaliu în documentele de neurogeneza. Pe această bază, unii autori concluzionează că celulele pe care le detectează în cultură sunt neuroblasturile. În particular, Schegelskaya E. Et al (2002), după o cultură primară de celule stromale cultivate timp de două săptămâni într-o înlocuibil la fiecare mediu condiționat Z și-a 4 zi a constatat că o parte din celulele proliferative, păstrând starea nediferențiată. În exterior, astfel de celule arătau ca fibroblaste și au fost identificate în cultură împreună cu neuroblasturile diferențiate. Majoritatea celulelor (aproximativ 80%) au fost în diferite stadii de diferențiere în celule ale țesutului nervos, în principal în neuroni. Procesele dendritice ale acestor celule în contact apropiat unul cu celălalt, astfel încât treptat celulele formate pe porțiunile de substrat rețelei neuronale sub forma unor fire lungi multicelulare. Procesele dendritice ale neuroblasturilor au crescut mult mai mult, unele fiind de 8-10 ori mai mari decât lungimea corpului neuronului însuși. Treptat, proporția celulelor piramidale și stelate a crescut. Dendritele celulelor stelate sunt ramificate. Potrivit autorilor, diferențierea ulterioară a celulelor piramidale și stelate în comparație cu cele în formă de arbore corespunde secvenței de etape a neurogenezei normale la animale. Ca urmare, autorii ajung la concluzia ca celulele stem din maduva osoasa celulele stromale sunt expuse neurogeneza induse în care procesul in vitro neuroblastele generate din toate cele trei tipuri majore de neuroni. Precursori de celule neuronale au fost gasite in cultura de celule stromale medulare timp de 3-4 zile în mediu cu ser fetal 2% și 20 ng / ml LIF. Dar în acest caz, celulele stem au fost împărțite foarte lent, diferențierea neuroblasturilor a apărut doar în 30% din cazuri și nu au format rețele neuronale. Folosind ca celula nervoasa inductori de diferentiere acid retinoic, autorii obținute în cultură la 25-30% din celulele nervoase, cu o predominanță de celule gliale - astrocite și oligodendrocite. Neuronii au reprezentat doar o treime din toate celulele nervoase, deși au fost reprezentate de toate cele trei tipuri: celule fusiforme, piramidale și stelate. Pe 6-a zi a celulelor stromale cultivarea in celulele nervoase mediu acid retinoic a devenit mai diferențiate, în timp ce axonii individuale ale neuronilor piramidali au constatat că în neuroontogenesis normală apare formarea ulterioară a proceselor dendritice. Potrivit autorilor, in ciuda randamentului scăzut al celulelor nervoase, metoda de inducere acid retinoic are avantaje: astrocite și oligodendrocite și myelinating funcționează funcțiile furajeri în timpul creșterii axonilor și dendritelor și sunt necesare pentru formarea normală a țesutului nervos. Prin urmare, pentru a repara locurile sale deteriorate in vivo, este mai bine să utilizați o suspensie de neuroni îmbogățită cu celule gliale.

În cea de-a doua serie de experimente, autorii au încercat să inducă diferențierea celulelor stromale ale măduvei osoase în celulele hepatice. După trei zile de cultură a celulelor stem stromale ale măduvei osoase în mediul condiționat obținut prin incubarea de șoarece hepatocite embrionare, celule mari, în formă sferică, au fost găsite, de multe ori, incluziuni citoplasmatice două nucleare cu dimensiuni diferite. Aceste celule au fost în diferite stadii de diferențiere și au variat în mărime, număr de nuclee și incluziuni în citoplasmă. În cele mai multe dintre aceste celule, a fost detectat glicogen, pe baza căruia autorii le-au identificat ca celule progenitoare de hepatocite. Deoarece cultura fără celule au fost detectate Similar cu neuroblastele, urmată de o concluzie că în mediul condiționat obținut prin cultivarea hepatocitelor embrionare, nu există factori de diferențiere a celulelor nervoase și, invers, există factori care induc diferențierea celulelor stromale ale măduvei osoase în celule precursoare hepatocitare . Autorii sugerează prezența celulelor pluripotente din stroma măduvei osoase, așa cum se diferențiază in vitro în celule de țesut hepatic sau neuronale specifice în funcție de mediile condiționate și inductoare.

În unele lucrări, diferențierea celulelor stromale ale măduvei osoase în celule cardiomiocite, cartilaj, os și neuron este într-adevăr corectă. Există informații că printre celulele măduvei osoase există populații de celule stem care se pot diferenția în hepatocite. In lumina acestor rezultate de mai sus experimentării la soareci pot fi considerate ca o altă confirmare a prezenței în celulele stem pluripotente mezenchimale din măduva osoasă având capacitatea de a se diferenția în celule de diferite țesuturi ale organismului adult.

Transplantul de celule stem mezenchimale

In transplantul clinic de celule stem mezenchimale umane pot fi utilizate pentru extinderea celulelor stem hematopoietice și descendenții lor timpurii prekommitirovannyh. În special, introducerea de celule stem hematopoietice autologe și pacienții cu cancer după chimioterapie MSCs de mare accelerează de recuperare în neutrofile și trombocite din sânge periferic. Autologe și transplantul alogenic de celule stem mezenchimale utilizate pentru tratamentul mielomului multiplu, anemia aplastică, trombocitopenie spontană - boli asociate cu defect primar țesut stromal hematopoietic. Eficiența terapiei cu celule în patologii hematologice, în multe cazuri de mai sus, în timp ce introducerea de stromale si celule stem hematopoietice, care a manifestat o reducere a perioadei de recuperare postoperatorie, de sânge, scădere a numărului de decese din cauza distrugerii celulelor canceroase regionale și circulante non-selective, în care matriță și celulele sale proprii progenitoare pacient hematopoietice. MSCs promitatoare aplicatii si alte celule precursoare mezenchimale multipotente în practica clinică datorită ușurinței relative de obținere a aspirate de măduvă osoasă, extinderea în cultură și transfectarea genei terapeutice. Astfel, pentru a compensa defecte tisulare locale pot utiliza o implantare locală de celule precursoare mezenchimale multipotente și în disfuncția sistemică a țesuturilor de origine mezenchimală nu este exclusă introducerea lor în circulația generală.

Mai prudent în argumentele lor autorilor de opere în care perspectivele pentru transplant CSM locale, sistemice și terapia genică sunt analizate din punct de vedere al celulelor stromale biologiei. Măduva osoasă este considerată în mod tradițional postnatala ca un corp compus din două sisteme principale de linii celulare distincte - de fapt, tesut hematopoietic si stromă sale de sprijin asociate. Prin urmare, celulele stem mezenchimale din măduva osoasă inițial privită doar ca o sursă de bază stromale pentru producerea de factori de reglementare micromediul hematopoietice. Apoi atenția cercetătorilor a trecut la studierea rolului MSC ca sursă de tulpină a țesuturilor scheletice. Cele mai recente date indică un potențial neașteptat de diferențiere a celulelor stromale ale măduvei osoase cu formarea unui țesut neural sau muscular. Cu alte cuvinte, celulele stem mezenchimale prezintă transgermalnuyu plasticitate - capacitatea de a se diferenția în tipuri de celule care celulele tesutului fenotipic non-originale. Cu toate acestea, unele aspecte ale biologiei celulelor stromale de măduvă osoasă rămân neclare și nerezolvate în planul biologic general, și în detaliu, inclusiv identificarea, natura, originea și dezvoltarea și funcția în celulele stromale ale măduvei osoase in vivo precum și potențialul diferențierea admisibilă ex vivo și posibilitatea utilizarea terapeutică in vivo. Datele cu privire la posibilele oportunități de MSC-uri, precum și rezultatele studiilor de alte aplicații potențiale de regenerare a celulelor stem, în contrast puternic cu dogma stabilită în biologie.

Când sunt cultivate în condiții de densitate scăzută, celulele stromale ale maduvei osoase formează colonii distincte, fiecare dintre acestea fiind un derivat al unei singure celule precursoare. Procentul de precursori de celule stromale în celulele măduvei osoase nucleate definită prin capacitatea lor de a forma colonii depinde în mare măsură de condițiile de cultură și speciile de care aparțin MSCs. De exemplu, în rozătoare pentru a obține valoarea maximă a celulelor progenitoare stromale este absolut necesară în prezența culturii de alimentare iradiate de celule de măduvă osoasă și ser, în timp ce colonia formarea eficienta a celulelor stem mezenchimale umane este independent de alimentator, sau din mediul de cultură. Numărul de factori mitogeni cunoscuți care stimulează proliferarea celulelor progenitoare stromale este limitat. Acestea includ PDGF, EGF, FGF, TGF-b și, de asemenea, IGF1. În condiții optime, cultivarea MSCs linii policlonale menținute in vitro pentru diviziunile celulare mai mult de 50, ceea ce face posibilă primirea de miliarde de celule de stromă de măduvă osoasă de la 1 ml de aspiratul ea.

Cu toate acestea, populația de celule de stromă de măduvă osoasă este eterogenă, care se manifestă ca o variabilitate în dimensiunile coloniilor, rate diferite de formare a acestora și o varietate de morfologie celulară, care cuprinde o serie de ax-fibroblast la celule plane de mari dimensiuni. Odată cu dezvoltarea acestor culturi după 20 de zile, se observă și o eterogenitate fenotipică. O parte a coloniei se caracterizează prin expresie înaltă a fosfatazei alcaline, altele nu se exprimă, iar al treilea tip coloniile sunt fosfatazopozitivnymi în regiunea centrală și fosfatazonegativnymi la periferie. Coloniile separate formează noduli ai țesutului osos (începutul mineralizării matricei este marcat atunci când este colorat cu roșu alizarină sau cu calciu de Van-Koss). În alte colonii, are loc acumularea de grăsimi, identificată prin colorarea G cu roșu de ulei. Mai rar, coloniile celulelor stem mezenchimale formează cartilaje care sunt colorate cu albastru alcian).

După transplantul ectopice la animale experimentale linii MGK policlonale formeaza stroma osului ectopic cu setchatoobraznoy asociate cu myelopoiesis și adipocitele, precum și, dar rar, cu tesut cartilaginos. In transplantul de linii monoclonal de celule stromale ale măduvei osoase, în unele cazuri chimerism, în care de novo de țesut osos format este compus din celule osoase, adipocite cuprinde stroma și donor de origine, în timp ce liniile de celule ale sistemului hematopoietic și vascular sunt derivate de la beneficiar.

Rezultatele acestor studii confirmă natura tulpinii precursorului stromal al măduvei osoase, din care a fost obținută linia clonală. De asemenea, aceștia arată simultan că nu toate clonarea în celulele de cultură sunt într-adevăr celule stem multipotent. Unii cercetători cred, și împărtășim opinia lor, că informațiile cele mai exacte cu privire la potențialul real al diferențierii clonelor individuale pot fi obținute numai in vivo după transplant, mai degrabă decât prin determinarea fenotipului derivatelor lor in vitro. Exprimarea markerilor de cultură fenotipici osteoartrită hondro- sau adipogenesis (determinat prin ARNm sau prin tehnici histochimice) și chiar producerea matricei mineralizate nu reflectă gradul de pluripotența singure clone in vivo. Prin urmare, identificarea celulelor stem din grupul de celule stromale este posibilă numai posteriori, în condițiile adecvate ale unui test de transplant biologic. În particular, condrogeneza observate foarte rar în sistemele deschise de transplant, în timp ce formarea cartilajului nu este mai puțin frecvente în sisteme închise, cum ar fi camerele de difuzie sau în culturi mikromassnyh de celule stromale in vitro, în care a atins tensiunea locală scăzută de oxigen, contribuie la formarea de cartilaj. Prin urmare, chiar tehnica de transplant, precum și condițiile de cultivare nespecifice in vitro, afectează în mod semnificativ intervalul de diferențiere MSC.

Transplantul experimental cu respectarea condițiilor experimentale date este standardul de aur pentru determinarea potențialului de diferențiere a celulelor stromale din maduva osoasă și elementul-cheie al identificării lor corecte. Din punct de vedere istoric, studiile privind transplantul de măduvă osoasă a măduvei osoase sunt asociate cu o problemă comună a transplantului de măduvă osoasă. Sa constatat că micromediul hemopoietic este creat prin transplantul de celule stromale ale măduvei osoase și asigură dezvoltarea ectopică a țesutului hemopoietic în zona de transplant. Originea micromediul a țesutului donor și hematopoietic - de la gazdă poate fi considerat ca un adevărat os transplant de măduvă osoasă „inversat“ ectopică. Transplantul local al celulelor stromale din măduva osoasă promovează corectarea eficientă a defectelor osoase, mai pronunțată decât în regenerarea reparativă spontană. In mai multe studii preclinice in modele animale au dovedit în mod convingător posibilitatea de transplanturi de celule stromale de măduvă osoasă în ortopedie, deși pentru a optimiza aceste metode, chiar și în cele mai simple cazuri, necesită munca mai atentă și analiză. În particular, condițiile optime pentru extinderea celulelor stromale osteogene ex vivo nu au fost încă stabilite, structura și compoziția purtătorului ideal rămân neutilizate, precum și numărul de celule necesare pentru regenerarea osului în vrac.

În plus față de aplicarea celulelor stromale propagate ex vivo osoasă pentru regenerarea țesutului de origine mezenchimală ductilității neortodoxa MSC deschide utilizarea potențială pentru regenerarea celulelor neuronale, sau livrarea produselor genetice în SNC. În principiu, acest lucru simplifică terapia celulară în înfrângerea sistemului nervos, deoarece nu este necesară obținerea de celule stem neurale autologe de la oameni. Se raportează despre posibilitățile de utilizare a celulelor măduvei osoase pentru generarea de cardiomiocite și a celulelor precursoare miogene ca origine cu adevărat stromală și extrinsecă.

Se desfășoară experimente privind transplantarea sistemică a celulelor stromale ale măduvei osoase pentru tratamentul bolilor scheletice comune. Fără îndoială că celulele stromale de maduva osoasa sunt o populatie responsabile pentru tulburari genetice in boli ale scheletului, care este bine ilustrat prin transferul vectorului folosind informația genetică a celulelor, ceea ce duce la formarea de țesut osos patologic la animale experimentale. Cu toate acestea, capacitatea celulelor stromale de a implanta, crește, multiplica și diferenția în oasele scheletului după introducerea în fluxul sanguin general nu a fost încă dovedită.

Acest lucru se datorează în parte faptului că procedura standard a stromei măduvei osoase nu sunt transplantate cu tesut hematopoietic, criterii stricte atât pentru evaluarea grefarea cu succes de administrare sistemica celule stromale nu au fost încă să fie dezvoltate. Trebuie reamintit faptul că prezența genelor marker în extractele de țesuturi sau izolarea în cultură a celulelor de origine donatoare nu indică însușirea celulelor, ci doar supraviețuirea lor. Chiar și injectarea intraarterială a celulelor stromale ale măduvei osoase la nivelul membrelor mouse-ului poate duce la practic rezultat grefării la zero, in ciuda faptului ca celulele donator-derivate se găsesc în număr mare în cadrul rețelei de măduvă osoasă microvascular. Din nefericire, astfel de celule sunt de obicei descrise ca "încorporate" numai pe baza rezultatelor determinării genelor donor marker în condiții de cultură ex vivo. În plus, este necesar să se furnizeze dovezi convingătoare de integrare pe termen lung în țesuturile celulelor diferențiate și funcțional active de origine donatoare. În numeroase lucrări publicate, în care este raportat despre încorporarea celulelor stromale ale măduvei osoase în schelet, lipsa datelor clare de acest tip este izbitoare. Cu toate acestea, trebuie notat faptul că, în unele experimente corecte pe animale, cu toate acestea, a fost stabilită o gravitate limitată, dar reală, a celulelor progenitoare stromale după administrarea lor sistemică.

Aceste date sunt în concordanță cu rezultatele studiului privind posibilitatea predării celulelor precursoare ale măduvei osoase miogene către mușchi prin sistemul vascular. Cu toate acestea, nu trebuie uitat faptul că ambele țesuturi scheletice și musculare se formează în timpul dezvoltării și creșterii pe baza mișcărilor de celule extravasculare care utilizează procese de migrație care nu implică circulația în sânge. Dacă există într-adevăr o cale independentă de circulație a celulelor precursoare la țesuturile cu fază solidă, este posibil să se permită existența celulelor progenitoare mezenchimale circulante fiziologic? Care este originea acestor celule atât în organismul în curs de dezvoltare, cât și în cel postnatal și cum intră în peretele vascular? Soluția acestor probleme este absolut necesară și necesită cea mai amănunțită analiză preclinică. Chiar și după găsirea răspunsurilor la aceste întrebări, aspectele cinetice problematice asociate cu creșterea scheletului și remodelarea țesutului conjunctiv rămân nesoluționate. În același timp, tratamentul tulburărilor de osteogeneză prin înlocuirea întregii populații de celule precursoare scheletale mutante cu celule stromale sănătoase pare a fi o perspectivă clinică reală. În acest caz, deformarea locală sau fractură din cauza zonei osteogenezei și osoase modificări distructive patologice pot fi corectate prin utilizarea celulelor stem stromale cultivate in vitro. Prin urmare, direcția cercetărilor viitoare ar trebui să se concentreze asupra problemelor transformării sau corecției genetice a celulelor progenitoare osteogene cu mutații autologe ex vivo.

Ingineria genetică a celulelor, temporar sau permanent, a devenit baza de biologie celulara si moleculara, sursa multor descoperiri științifice privind rolul de proteine individuale in metabolismul celular in substante in vitro si in vivo. Utilizarea tehnicilor moleculare pentru a corecta boli ereditare si boli umane este foarte promițătoare pentru medicina practică, deoarece proprietățile celulelor stem maduvei osoase stromale permis dezvoltarea transplantului de circuite unice pentru corectarea bolilor genetice ale scheletului. In acest caz, celulele progenitoare mezenchimale se pot obține destul de ușor de destinatar viitor, acestea pot fi supuse la manipulare genetică și sunt capabile să se înmulțească în număr mare într-o perioadă scurtă de timp. Utilizarea celulelor stem mezenchimale evită limitările și riscurile asociate cu livrarea de materiale de informare genetică direct către pacient prin structuri vectoriale vii. Această strategie se aplică pi celulele stem embrionare, dar celulele stromale postnatale autolog de măduvă osoasă - un material preferat, deoarece administrarea lor exclude complicații posibile posttransplantation imunologice. Pentru a obține un efect pe termen scurt, de exemplu, în scopul de a accelera regenerarea osului, metoda optimă este modificarea genetică a celulelor stem mezenchimale folosind elektroporatsrsh, fuziune chimică, lipofecția, plasmide și construcții adenovirale. În particular, transfecția virală în celulele stromale BMP-2 ale măduvei osoase a fost eficientă în accelerarea regenerării oaselor în politrauma experimentală. Crearea de construcții vectoriale adenovirale este preferabilă din cauza absenței toxicității. Cu toate acestea, modificarea genetică a celulelor stromale ale măduvei osoase în acest caz este caracterizată prin stabilitate extrem de scăzută. In plus, celulele stromale de măduvă osoasă normală transformate necesită utilizarea purtătorilor vector de informatii genetice de 10 ori mai infectios decat alte tipuri de celule, care crește în mod semnificativ procentul de moartea celulelor transfectate.

Pentru tratarea bolilor recesive cauzate de activitatea scăzută sau nulă biologică a unor gene necesare de modificare prelungită sau permanentă a celulelor stem mezenchimale, care necesită utilizarea de asociat adeno-virusuri, retrovirusuri, lentiviruses și himera adenovirusurilor retrovirale. Locurile de transport ale acestor virusuri sunt capabile să transfere transfețe mari de ADN (până la 8 kb). Literatura științifică a apărut deja informații despre activitatea biologică a celulelor exogene ale măduvei osoase stromale transfectate cu constructe retrovirale care codifică sinteza moleculelor de reglementare, și markeri - IL-3, CD2, factorul VIII și enzimele implicate în sinteza L-dopa. Dar chiar și în aceste documente, autorii indică o serie de constrângeri care trebuie depășite înainte de începerea aplicării în practică a acestei tehnologii. Prima problemă este optimizarea procesului de modificare ex vivo a MCK. Este cunoscut faptul că pe termen lung (3-4 saptamani) in proliferarea in vitro a celulelor stromale ale măduvei osoase scade transfectat lor. În același timp, pentru a atinge un nivel înalt de modificare genetică a MSCs este necesar să se efectueze mai multe cicluri transfitsirovadiya. A doua problemă este legată de durata de exprimare a genei terapeutice, care nu depășește încă patru luni. O scădere naturală a expresiei genice eficiente se datorează inactivării promotorilor și moartea celulelor modificate. În transferul perspectivele generale de informatii genetice prin utilizarea celulelor stem mezenchimale rezultatele studiilor preliminare indică necesitatea optimizării în continuare a metodelor de transfecție ex vivo, selectarea unui promotor adecvat care reglementează activitatea biologică în direcția corectă, și de a spori capacitatea celulelor stromale ale măduvei osoase modificate pentru a auto-reînnoi in vivo după transplant. Trebuie remarcat faptul că utilizarea constructelor retrovirale pentru modificarea celulelor stromale de măduvă osoasă în direcția dorită nu necesită întotdeauna grefare lor obligatorie. Celule stem mezenchimale transfectată poate îndeplini o funcție de corecție pe fondul stabil și de ședere, fără a necesita încorporarea fizică activă și funcționează în țesutul conjunctiv. În acest caz, acestea ar trebui să fie considerate ca un mini-pompă biologică, producând în factorul vivo, lipsa care determină manifestarea unei boli genetice.

Utilizarea celulelor stromale ale măduvei osoase transformate pentru tratamentul bolii genetice dominante, care se caracterizează prin expresia genei sau activitatea biologică patologică anormală, este mult mai problematică, deoarece în acest caz, este necesar să se blocheze transferul sau vânzarea informației genetice distorsionate. Una dintre metodele de inginerie genetică - recombinare omoloagă a celulelor stem embrionare pentru a genera animale transgenice. Cu toate acestea, nivelul extrem de scăzut al recombinate omoloage, combinate cu problemele de identificare, separare și extinderea unor astfel de recombinanților este puțin probabil să promoveze utilizarea pe scară largă a acestei tehnici, în viitorul apropiat, chiar dacă dezvoltarea unor noi metode tehnologice. A doua abordare terapia genica se bazeaza pe patologia corectarea automată dominantă a ADN-ului deteriorat ca mutatii genetice pot fi corectate prin introducerea ADN-ului exogen cu secvența dorită (oligonucleotide ADN scurtă sau himerice oligonucleotide ARN / ADN), care se leaga de homologs in genomul deteriorat. Al treilea exemplu de realizare asigură patologica de blocare transmitere a informațiilor, care se realizează prin utilizarea de oligonucleotide proiectate în mod specific care se leagă la o anumită genă pentru a forma structura elicoidală ternară, ceea ce exclude posibilitatea de transcriere.

Deși corectarea bolilor genetice in nivelul genomului este optim și metoda terapeutică preferată, mRNA este, de asemenea, un vector promițător (poate chiar mai accesibil) pentru blocarea unei gene dominantă negativă. Pentru a inhiba traducerea și / sau creșterea degradării ARNm au fost mult timp utilizate cu molecule proteice secvențe de oligonucleotide antisens sau blocarea legării depline a ARNm aparat biosintetic al celulei. De asemenea, ARN dublu catenar induce degradarea ARNm rapidă, mecanismul care nu este încă pe deplin clarificat. Cu toate acestea, este puțin probabil ca simpla eliminare a ARNm transcris dintr-o alelă mutantă cu mutații scurte sau singulare va promova exprimarea ARNm al alelei normale. O alternativă este utilizarea ribozinov și ac de păr ciocan, au capacitatea de a se lega la site-uri foarte specifice de ARNm cu inducerea ulterioară a clivajului și inactivarea acestora în timpul traducerii. În prezent, se studiază posibilitatea utilizării acestei metode în tratamentul osteogenezei patologice. Indiferent de ceea ce este exact tinta - elemente genomice sau citoplasmatice succesul unei noi tehnologii de terapie genica va fi determinată de eficiența includerii reactivilor în celulele stromale ale măduvei osoase ex vivo, alegerea optimă a unui anumit vector și capacitatea stabilă de celule stem mezenchimale care exprimă factorii dorite in vivo.

Astfel, descoperirea celulelor stem mezenchimale cu proprietățile lor neașteptate creează o nouă schemă conceptuală pentru dezvoltarea liniilor celulare. Dar pentru a înțelege rolul biologic al celulelor stem stromale, de natura lor, capacitatea de a transdiferentiate sau dedifferentiation, importanța lor fiziologică în procesul de dezvoltare embrionara, cresterea postnatale, maturizarea și îmbătrânirea populației, precum și în bolile umane necesită cercetări suplimentare interdisciplinare.