Diagnosticarea herpesului

Diagnosticul herpesului se bazează pe izolarea clasică a virusului pe culturi celulare sensibile, metode imunofluorescente și serologice, examen colposcopic și utilizarea metodelor moderne de biologie moleculară (PCR, hibridizare punctuală), ceea ce permite diagnosticarea întregului grup de virusuri herpetice, inclusiv tipurile HHV-6 și HHV-7.

Metode de diagnostic de laborator pentru infecția cu herpes

Principalele metode care vizează izolarea HSV sau detectarea particulelor virale și/sau a componentelor acestora	Metode auxiliare care vizează detectarea anticorpilor împotriva HSV în fluidele biologice ale corpului uman
Izolarea HSV în culturi celulare și animale sensibile Microscopie electronică directă și imună Variante directe și indirecte ale IPA IFA Metode de biologie moleculară Reacția de aglutinare a latexului	Reacție de neutralizare RSC Determinarea anticorpilor împotriva proteinelor nestructurale ale HSV-1,2

S-a demonstrat că la 76% dintre pacienți herpesul genital (GH) este cauzat de HSV-2, iar la 24% - de tipul HSV-1. Mai mult, GH ca monoinfecție a apărut doar la 22% dintre pacienți, în 78% din cazuri fiind detectate asociații microbiene. La 46% dintre indivizi, a fost detectată parazitocenoza cauzată de doi agenți patogeni, inclusiv chlamydia, detectată în 40% din cazuri. Gardnerella, Trichomonas și gonococi au fost detectați mai rar în frotiuri.

La 27% dintre pacienți, parazitocenoza a fost reprezentată de trei agenți patogeni, la 5,2% - de patru agenți patogeni. Mai mult, cel mai des s-a observat o combinație de chlamydia cu gardnerella și ciuperci Candida. Aceste date susțin necesitatea unui examen bacteriologic amănunțit al pacienților cu GH pentru a identifica combinațiile de agenți patogeni, precum și un studiu aprofundat al patogenezei infecțiilor mixte ale tractului urogenital, ceea ce va permite o terapie complexă diferențiată a infecției herpetice.

Materiale studiate pentru izolarea HSV în funcție de localizarea leziunilor herpetice

Localizarea leziunilor	Conținutul veziculelor	Răzuirea celulelor				LCR	Aspirat bronșic	Biopsie	Sânge
		1	2	3	4
Piele	+								+
Ochi			+						+
Genitale				+					+
Anus	+				+				+
Gură	+	+							+
SNC	+					+		+	+
Plămâni		+					+		+
Ficat								+	+
Herpes congenital	+	+	+				+		+

Metode de diagnostic de laborator pentru infecția cu citomegalovirus

Metode	Timpul necesar pentru obținerea rezultatelor	Note
VIROLOGIC
Microscopie electronică	3 ore	Nu foarte accesibil
Izolarea virusului în cultură celulară (VCI)	4-20 de zile	Standard, Lent
Colorarea prin imunofluorescență a AG timpuriu folosind anticorpi monoclonali	6 ore	Mai puțin specific
CITOLOGIC	2-3 ore	Mai puțin specific
SEROLOGIC
RSC	2 zile	Standard
RGA	1 zi	Intensiv în muncă
RECIF	6 ore	Simplu, specific
NRIF	6 ore	Dificil
RIMP	6 ore	Dificil
ELISA (IgM, DO)	6 ore	Rapid, simplu
Imunoblot	6 ore	Scump
BIOLOGICĂ MOLECULARĂ
MG	5-7 zile	Scump, necesită multă forță de muncă
PCR	3 ore	Scump

Metode de diagnosticare a virusului herpes zoster

Metode de diagnostic	Tehnici de laborator
INDIRECT
Selecţie	Cultură de țesuturi, embrioni de pui, animale de laborator, co-cultură cu celule permisive sau virusuri helper
Identificarea izolatelor	Reacție de neutralizare, RSC, IF, PIEF, reacție de precipitare a izolatelor, aglutinare, IF
DIRECT
Citologie	Frotiuri: imunofluorescență color
Histologie	Patomorfologia celulei
Structura	Microscopie embrionară, microscopie imunoelectronică
Determinarea antigenelor	IF, PIEF, RIM, IFA
Determinarea producției locale de anticorpi	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Abordări biologice moleculare	Hibridizare moleculară, PCR

Diagnosticul de laborator al infecțiilor cauzate de virusul herpes zoster

Probleme de diagnostic	Metode	Rezultate așteptate
Infecție primară acută	1	Detectare în 2 ore
	2	Nivelurile de anticorpi cresc lent
	3	Prezent la 3 zile după infecție
Infecție acută reactivată	1	Detectarea UUU după 2 ore
	2	Nivelurile de anticorpi cresc lent
	4	Prezent la 4 zile după apariția erupției cutanate

1. determinarea veziculelor de VEGF în lichid;
2. serologie: CSC, ELISA, pentru detectare
3. serologie: ELISA pentru detectarea IgM;
4. Serologie: ELISA pentru detectarea IgA și IgM.

Metode de indicare a răspunsului imun la infecția cu virusul herpes zoster

Abordare	Metodă
Detectarea unei creșteri a titrului de anticorpi în al doilea ser	RSK, RTGA, RPGA, reacție de neutralizare IF, RIM, ELISA
Detectarea anticorpilor specifici clasei Ig G, Ig A în prima probă de ser	ELISA, IF, RIM, aglutinare cu latex

Interpretarea rezultatelor examenului serologic al serurilor pacienților pentru infecții cu herpesvirus (ELISA)

Numele infecției/markerului	Valori prag medii pentru infecții
	Rezultatele analizei	Interpretare
IgG anti-CMV citomegalie (1-20 U/ml) IgM anti-CMV (100-300%)	Pozitiv 1-6 Pozitiv 6-10 Pozitiv >10 Negativ Pozitiv 100-300 Negativ <90 Îndoielnic 90-100	Remisiune Exacerbarea bolii Faza acută a bolii Fără infecție (boală) Faza acută a bolii Se repetă analiza în 2-3 săptămâni
Herpes simplex serotipuri 1, 2 Anti-HSV 1/2 total (100-900%)	Pozitiv 100-400 Pozitiv 400-800 Pozitiv >800 Negativ <100	Remisiune Exacerbarea bolii Faza acută a bolii Fără infecție (boală)

Tabelul prezintă principalele metode de diagnostic de laborator al infecțiilor cu herpesvirus, precum și materialele biologice recomandate pentru examinare la izolarea HSV, ținând cont de localizarea leziunilor herpetice.

Izolarea fiabilă a virusurilor herpes simplex și CMV prin infectarea culturilor celulare sensibile. Astfel, în timpul examinării virologice a 26 de pacienți în perioada de recidivă, HSV a fost izolat pe o cultură celulară Vero sensibilă în 23 de cazuri (88,4%). Culturile infectate au prezentat o imagine de acțiune citopatică tipică pentru HSV - formarea de celule gigante multinucleate sau o acumulare de celule rotunjite și mărite sub formă de clustere. În 52,1% din cazuri, focarele de acțiune citopatică ale virusului au putut fi detectate deja la 16-24 de ore după infectare. La 48-72 de ore de incubare a culturilor infectate, procentul de materiale care provoacă distrugerea specifică a celulelor a crescut la 87%. Și doar în 13% din cazuri au fost detectate rezultate pozitive la 96 de ore după infectare sau mai mult sau în timpul pasajelor repetate.

Metode de diagnostic de laborator pentru infecția herpetică generalizată

Principalele metode care vizează detectarea (izolarea) virusurilor herpetice, a particulelor acestora și a componentelor acestora

Metode auxiliare care vizează detectarea anticorpilor împotriva virusurilor herpetice în fluidele biologice, detectarea modificărilor enzimatice în serul sanguin

Izolarea virusurilor herpetice pe culturi celulare și animale sensibile Microscopie electronică directă și imună Variante directe și indirecte ale metodei imunoperoxidazei Variante directe și indirecte ale metodei anticorpilor fluorescenți Variante ale imunotestului enzimatic în fază solidă Variante ale metodei de hibridizare moleculară (ADN-ADN) Reacție în lanț a polimerazei Reacție de aglutinare cu latex

Test de neutralizare Test de fixare a complementului Test de aglutinare cu latex Versiune indirectă a metodei cu anticorpi fluorescenți Versiune indirectă a metodei imunoperoxidazei Variante ale testului imunoenzimatic în fază solidă Metoda de imunoblotting Metoda de fixare a complementului radial Determinarea nivelurilor de alanină și aspartat aminotransferază

Metodele serologice sunt utilizate pentru diagnosticarea mononucleozei infecțioase (o infecție cauzată de virusul hepatitei B). Reacția Paul-Bunnell cu eritrocite de berbec, un titru diagnostic de 1:28 sau mai mare într-un singur test de ser sanguin sau o creștere de 4 ori a anticorpilor la examinarea serurilor pereche. Se utilizează reacția Hoff-Bauer cu o suspensie de 4% de eritrocite de cal formalizate. Rezultatul este luat în considerare după 2 minute; în mononucleoza infecțioasă, reacția este foarte specifică.

În prezent, se dezvoltă o metodă imunoenzimatică (EIA) pentru diagnosticarea mononucleozei infecțioase. În acest caz, anticorpii IgG și IgM din serul pacientului sunt determinați prin incubarea acestuia cu limfoblaste infectate cu EBV, urmată de tratamentul cu anticorpi fluorescenți. În perioada acută a bolii, anticorpii împotriva antigenului capsidei virale sunt determinați într-un titru de 1:160 și mai mare.

Atunci când se utilizează o serie de sisteme de testare comerciale importate, testul ELISA poate detecta: anticorpi împotriva anticorpilor de anvelopă EBV, anticorpi împotriva antigenului timpuriu EBV, anticorpi totali împotriva antigenului timpuriu EBV, determinați în faza acută a bolii atât în nucleu, cât și în citoplasma celulară, și anticorpi limitați împotriva antigenului timpuriu EBV, determinați în faza acută a bolii atât în nucleu, cât și în citoplasma celulară, anticorpi limitați împotriva antigenului timpuriu EBV, determinați în punctul culminant al bolii doar în citoplasma celulară și anticorpi împotriva antigenului nuclear EBV. Utilizarea acestor sisteme de testare permite diagnosticul diferențial al unui număr de boli asociate cu EBV.

După un test ELISA pozitiv care relevă anticorpi împotriva EBV, se efectuează o reacție de imunoblotting de confirmare, care determină prezența anticorpilor împotriva proteinelor marker individuale ale EBV (proteine p): p23, p54, p72 (prezența acestei proteine indică posibilitatea reproducerii EBV), p 138. Metodele de laborator menționate mai sus sunt, de asemenea, utilizate pentru a monitoriza eficacitatea tratamentului.

Sensibilitatea metodelor virologice este de 85-100%, specificitatea este de 100%, timpul de studiu este de 2-5 zile. Metoda de imunofluorescență directă (DIF) cu anticorpi policlonali sau monoclonali împotriva HSV-1 și HSV-2 este adesea utilizată în lucrările practice. Metoda DIF este destul de ușor reproductibilă într-un laborator clinic obișnuit, nu este costisitoare, sensibilitatea este peste 80%, specificitatea este de 90-95%. Microscopia cu imunofluorescență a relevat prezența incluziunilor citoplasmatice, caracteristici morfologice, procentul de celule infectate în frotiurile-rașchete din uretră, canal cervical, col uterin, rect.

Metoda PIF oferă o idee despre proprietățile morfologice ale celulelor și modificările în localizarea antigenelor HSV. Pe lângă semnele directe ale afectării celulare de către virusurile herpetice (detectarea luminescenței specifice), există semne indirecte ale infecției herpetice conform datelor PIF:

• agregarea materiei nucleare, desprinderea cariolemei;
• prezența așa-numiților nuclei „găuri”, când din nucleul celular rămâne o singură cariolemă;
• prezența incluziunilor intranucleare - corpi Cowdry.

În timpul efectuării PIF, medicul primește nu doar o evaluare calitativă, ci și cantitativă a stării celulelor infectate, pe care am folosit-o pentru a evalua eficacitatea terapiei antivirale cu aciclovir (AC). Astfel, 80 de pacienți cu herpes genital simplu (GH) au fost examinați folosind metoda PIF în dinamică. S-a demonstrat că, dacă înainte de tratamentul cu aciclovir, 88% dintre pacienți aveau un procent ridicat de celule infectate (50-75% și mai mare) în frotiuri, atunci după o singură cură de aciclovir, celule sănătoase au fost detectate în frotiurile la 44% dintre pacienți, în 31% din cazuri s-au observat celule infectate singulare, iar la 25% dintre pacienți au existat până la 10% celule infectate.

Conținutul de celule infectate în frotiuri (reacție PIF) la pacienți cu herpes genital tratați cu aciclovir

Perioade de boală	Conținut procentual în frotiuri
	Celule infectate					Celule normale
	Peste 75%	50-75%	40-50%	10%	Celule individuale în câmpul vizual
Recidivă (înainte de tratament)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remisie (după tratament)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Folosind PIF și metoda de hibridizare punctuală timp de mulți ani, s-a observat că rezultatele studiului coincid în aproape 100% din cazuri. Trebuie menționat că, pentru a crește fiabilitatea diagnosticului de herpes, în special în cazurile de forme subclinice și cu manifestare redusă, se recomandă utilizarea a 2-3 metode de diagnostic de laborator în cadrul lucrării, în special la examinarea femeilor însărcinate, a femeilor cu antecedente obstetricale nefavorabile și a persoanelor cu diagnostic ginecologic nespecificat.

Astfel, în diagnosticul PCR al infecțiilor virale și bacteriene ale tractului urogenital, este necesar să se evalueze rezultatele pozitive obținute, luând în considerare anamneza, prezența (sau absența) simptomelor clinice specifice bolii. Dacă se detectează chlamydia prin PCR, atunci în acest caz există o probabilitate mare de infecție, iar problemele terapeutice pot fi rezolvate în consecință. În cazul detectării micoplasmelor (ureaplasme), care sunt microorganisme oportuniste, sunt necesare studii culturale suplimentare pentru confirmarea diagnosticului, adică însămânțarea materialului de la pacient pe culturi celulare sensibile. Numai dacă se obțin rezultate pozitive în analiza culturală putem vorbi despre confirmarea de laborator a diagnosticului de micoplasmoză. Aceeași metodă va permite, dacă este necesar, determinarea sensibilității micoplasmelor izolate la formele farmaceutice utilizate frecvent (antibiotice, fluorochinolone etc.).

Infecția simultană cu mai multe virusuri din familia Herpesviridae este posibilă. Am detectat adesea infecția unui pacient cu virusuri HSV-1, HSV-2 și CMV. Pacienții cu manifestări clinice și de laborator ale IDS secundar (pacienți oncohematologici, oncologici, infectați cu HIV) au fost semnificativ mai des infectați cu mai multe virusuri herpetice. Astfel, s-a demonstrat că tulburările clinice și imunologice care progresează în infecția cu HIV sunt însoțite de o creștere a numărului de virusuri herpetice detectate prin metoda hibridizării moleculare. În acest caz, cea mai semnificativă din punct de vedere prognostic poate fi considerată detectarea simultană complexă a ADN-ului de tip HSV-1, CMV și HHV-6.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]