Diagnosticul de laborator al tuberculozei

Tuberculoza este o boală ușor de diagnosticat în condițiile moderne și cu realizările științifice. Diagnosticul de laborator al tuberculozei ocupă un loc central printre alte metode de diagnostic, fiind al doilea după metodele de examinare cu raze X.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Test clinic de sânge

La pacienții cu tuberculoză, modificările analizelor sanguine generale nu sunt patognomonice. În formele limitate și slab active de tuberculoză, este caracteristică hipocromia eritrocitelor cu un număr normal. În infiltratele masive sau pneumonia cazeoasă, cu limfadenită cazeoasă extinsă, leziuni intestinale specifice, precum și cu hemoragii pulmonare mari sau postoperatorii, se observă eritropenie și microcitoză, oligocromazie, policromazie. Macrocitoza, și în special poikilocitoza, se întâlnesc mult mai rar, de obicei cu anemie severă. Numărul de reticulocite în stadiul compensat al tuberculozei variază de la 0,1 la 0,6%, în stadiul subcompensat - de la 0,6 la 1,0%, iar pentru stadiul decompensat, 1% din reticulocite sunt caracteristice.

În unele cazuri de tuberculoză se poate observa leucocitoză moderată (până la 15 mii de leucocite), mai rar leucopenie, care apare în 2-7% din cazuri la pacienții cu forme limitate și ușoare ale procesului și în 12,5% în tuberculoza pulmonară distructivă și progresivă.

Cel mai adesea, apar modificări ale formulei leucocitare. Se observă atât neutrofilie relativă, cât și absolută, o deplasare moderată a formulei leucocitare spre stânga, către promielocite. Mielocitele sunt foarte rar întâlnite în cazurile de tuberculoză necomplicată. O creștere a numărului de neutrofile cu granularitate patologică în hemograma unui pacient cu tuberculoză indică întotdeauna durata procesului: la pacienții cu tuberculoză severă, aproape toate neutrofilele conțin granularitate patologică. Când un focar de tuberculoză dispare, deplasarea nucleară revine la normal relativ repede. Granularitatea patologică a neutrofilelor persistă de obicei mai mult timp decât alte modificări ale hemogramei.

Conținutul de eozinofile din sângele periferic fluctuează, de asemenea, în funcție de faza procesului și de starea alergică a organismului. Numărul lor scade până la aneozinofilie în puseele severe și prelungite ale bolii și, dimpotrivă, crește în timpul resorbției infiltratelor și a revărsatului pleural, precum și în formele incipiente de tuberculoză primară.

Majoritatea formelor de tuberculoză primară sunt însoțite de limfopenie, care se observă uneori timp de mai mulți ani chiar și după cicatrizarea unor modificări specifice. Tuberculoza secundară în faza acută, în funcție de severitatea procesului, poate fi însoțită fie de un număr normal de limfocite, fie de limfopenie.

Printre testele de evaluare a procesului tuberculos, un loc special îl ocupă determinarea ratei de sedimentare a eritrocitelor (VSH), care este importantă în evaluarea evoluției procesului tuberculos și identificarea formelor sale active. O creștere a VSH indică prezența unui proces patologic (infecțios și inflamator, purulent, septic, hemoblastoză, limfogranulomatoză etc.) și servește ca indicator al severității acestuia, însă valorile normale ale VSH nu indică întotdeauna absența patologiei. Accelerarea sedimentării eritrocitare este facilitată de creșterea conținutului de globuline, fibrinogen, colesterol din sânge și de scăderea vâscozității sângelui. Încetinirea sedimentării eritrocitare este caracteristică afecțiunilor însoțite de hemoconcentrație, creșterea conținutului de albumine și acizi biliari.

Hemograma pacienților cu tuberculoză se modifică în timpul tratamentului. Cu cât intervenția terapeutică este mai eficientă, cu atât modificările hematologice dispar mai repede. În același timp, trebuie avut în vedere efectul diferitelor medicamente antibacteriene asupra hematopoiezei. Acestea provoacă adesea eozinofilie, în unele cazuri - leucocitoză, iar mai des leucopenie până la agranulocitoză și reacție limfoid-reticulară. Monitorizarea hematologică sistematică și analiza corectă a datelor obținute sunt esențiale pentru evaluarea stării clinice a pacientului, a dinamicii procesului și a eficacității tratamentului.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Analiza clinică a urinei

În cazul tuberculozei tractului urinar, analiza urinei este principala metodă de diagnostic de laborator. Se pot observa leucociturie, eritrociturie, proteinurie, hipoizostenurie, micobacteriurie tuberculoasă, bacteriurie nespecifică.

Leucocituria este cel mai frecvent simptom al tuberculozei tractului urinar înainte de chimioterapia specifică și lipsește doar în cazuri excepționale, cum ar fi obliterarea completă a lumenului ureteral. Testul Nechiporenko (determinarea numărului de leucocite din 1 ml de urină) ajută la evaluarea mai obiectivă a gradului de leucociturie în nefrotuberculoză și, în unele cazuri, la detectarea acestuia cu o analiză generală normală a urinei. Cu toate acestea, trebuie ținut cont de faptul că leucocituria poate apărea în pielonefrita acută și cronică, cistită, uretrita, calculi renali și uretere.

Eritrocituria, la fel ca leucocituria, este considerată unul dintre cele mai frecvente semne de laborator ale tuberculozei genitourinare. Frecvența hematuriei depinde de prevalența procesului; aceasta crește pe măsură ce se dezvoltă procesul tuberculos distructiv în rinichi. Eritrocituria fără leucociturie este mai tipică pentru stadiile incipiente ale tuberculozei renale. Hematuria, predominantă față de leucociturie, este un argument important în favoarea tuberculozei renale atunci când o diferențiază de pielonefrita nespecifică.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Test biochimic de sânge

În tuberculoză, modificările unor indici biochimici depind în primul rând de faza procesului, complicații și diverse boli concomitente. La pacienții cu tuberculoză inactivă a plămânilor și a altor organe, proteinele totale și fracțiile proteice ale serului sanguin nu sunt modificate și determină conținutul lor normal.

În formele acute ale bolii, precum și în exacerbarea și progresia formelor cronice de tuberculoză, coeficientul albumină-globulină scade.

De o importanță semnificativă în evaluarea stării funcționale și a afectării organice a ficatului în tuberculoză și complicațiile acesteia este determinarea bilirubinei directe și totale, aspartat aminotransferazei (AST), alanin aminotransferazei (ALT) în serul sanguin. Determinarea dinamică a nivelului de aminotransferaze. Bilirubina în tratamentul pacienților cu tuberculoză, în special în formele sale severe, este o componentă obligatorie a examenului biochimic al pacienților cu tuberculoză și se efectuează lunar.

Evaluarea stării funcționale a rinichilor include determinarea creatininei serice și calcularea ratei de filtrare glomerulară folosind formula Cockcroft-Gault. Calculul ratei de filtrare glomerulară folosind testul Reberg dă rezultate mai puțin precise.

Scopul principal al studiilor biochimice dinamice la pacienții cu tuberculoză este monitorizarea cursului procesului, detectarea la timp a efectelor secundare ale medicamentelor și corectarea adecvată a tulburărilor de homeostazie emergente.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Aplicarea metodelor de cercetare biochimică în tuberculoza extrapulmonară

Cel mai informativ indicator este considerat a fi conținutul de acid tuberculostearic în fluidele biologice, însă determinarea acestuia este asociată cu dificultăți tehnice (necesitatea utilizării cromatografiei de gaze și a spectrometriei de masă).

Este promițătoare măsurarea activității adenozin deaminazei - o enzimă determinată în fluide: sinoviale, pericardice, ascitice sau cerebrospinale. Principalii producători de adenozin deaminază sunt limfocitele și monocitele. Determinarea activității adenozin deaminazei în fluidele biologice facilitează diagnosticul sinovitei tuberculoase, tuberculozei ganglionilor limfatici, meningitei tuberculoase, serozitei tuberculoase.

Unii indicatori biochimici, datorită nespecificității lor, se determină doar în fluidele biologice apropiate de leziune. Nivelul indicatorilor se măsoară ca răspuns la administrarea subcutanată sau intradermică a tuberculinei (de obicei înainte de administrare și la 48 și 72 de ore după aceasta). După aceasta, se calculează gradul de creștere a nivelului markerului (în %) în raport cu nivelul inițial.

În mod optim, activitatea enzimei transamidinazei, specifică unui organ, este determinată în urină; apariția acesteia se observă în cazul afectărilor renale de diverse origini. Studiul transamidinazei este justificat doar în condițiile administrării subcutanate de tuberculine pentru a exacerba procesul inflamator local. Activitatea transamidinazei este determinată în urină inițial și la 24-72 de ore după administrarea a 50 TE de tuberculină. O creștere a fermenturiei de 2 ori sau mai mult permite în 82% din cazuri diferențierea tuberculozei active a rinichilor de exacerbarea pielonefritei cronice.

În cazul tuberculozei organelor genitale feminine, concentrațiile de haptoglobină și malondialdehidă din sânge se determină în condițiile testului provocator la tuberculină. Tuberculina se administrează subcutanat în doză de 50 TE și se efectuează un studiu biochimic repetat după 72 de ore. În cazul etiologiei tuberculoase, gradul de creștere a nivelului de haptoglobină este de cel puțin 28%, iar nivelul malondialdehidei este de 39% sau mai mult. Se utilizează, de asemenea, determinarea activității adenozin deaminazei în lichidul peritoneal obținut din punga Douglas. Puncția se examinează din nou la 72 de ore după administrarea intradermică a tuberculinei în doze de 0,1 TE și 0,01 TE în zona de proiecție a organelor genitale interne pe peretele abdominal anterior. O creștere a activității adenozin deaminazei cu 10% sau mai mult față de valoarea inițială indică un proces tuberculos.

În cazul leziunilor oculare, se examinează reacția focală care apare în ochi ca răspuns la stimularea cu antigen. În acest caz, dezvoltarea unui răspuns brusc pronunțat, însoțit de o scădere a funcțiilor vizuale, este nedorită. Deoarece evaluarea reacțiilor focale minime este adesea dificilă, se recomandă concentrarea în paralel asupra gradului de creștere a haptoglobinei sau adenozin deaminazei din serul sanguin pentru a obiectiva concluzia.

Toate studiile biochimice ar trebui efectuate în combinație cu alte metode.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Studiul sistemului de coagulare a sângelui

Relevanța studierii stării sistemului de coagulare a sângelui în tiziologie se datorează prezenței hemoptiziei sau hemoragiilor pulmonare la un număr de pacienți cu tuberculoză pulmonară, precum și complicațiilor hemocoagulării în tratamentul chirurgical al tuberculozei. În plus, hemocoagularea intravasculară latentă însoțitoare în mod natural afectează evoluția bolii și eficacitatea chimioterapiei.

La pacienții cu tuberculoză pulmonară cu o componentă exudativă predominantă a inflamației, se observă o scădere a activității anticoagulante a sângelui. La pacienții cu o prevalență scăzută a leziunilor pulmonare specifice, cu o componentă productivă predominantă a inflamației, hemocoagularea intravasculară este exprimată nesemnificativ. La pacienții cu tuberculoză pulmonară cu hemoptizie și hemoragii pulmonare, starea sistemului de coagulare a sângelui este diferită: la pacienții cu pierderi minore de sânge la apogeul hemoptoeei sau imediat după încetarea acesteia, se observă o creștere bruscă a capacității de coagulare a sângelui datorită unei intensificări pronunțate a proceselor de formare a trombinei, menținând în același timp o coagulabilitate „structurală” crescută. La pacienții cu pierderi masive de sânge, se observă o scădere a potențialului de coagulare datorită scăderii concentrației de fibrinogen, a activității factorului XIII și a numărului de trombocite. În stadiul tratamentului chirurgical, la pacienții cu forme limitate de tuberculoză pulmonară, nu apar perturbări semnificative ale sistemului homeostazial. La pacienții cu procese răspândite, la efectuarea pneumonectomiei sau pleuropneumonectomiei, se dezvoltă adesea sindromul DIC, care poate lua forma unei „a doua boli”.

Pentru a monitoriza starea sistemului de coagulare a sângelui la pacienții cu tuberculoză pulmonară, este necesar să se determine timpul de tromboplastină parțială activată (APTT), fibrinogenul, timpul de trombină, indicele de protrombină, precum și timpul de sângerare și timpul de coagulare a sângelui.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Studii hormonale

Observațiile experimentale și clinice moderne indică prezența modificărilor stării hormonale în inflamația tuberculoasă specifică a plămânilor. S-a dovedit că corectarea disfuncției sistemelor hipofizo-adrenal, hipofizo-tiroidian și a funcției pancreatice, în combinație cu terapia antituberculoasă, contribuie la activarea proceselor de fibrogeneză și reparare în focarul inflamației specifice.

Starea funcțională a sistemului hipofizo-tiroidian este evaluată prin conținutul de triiodotironină (T3), tiroxină (T4) și hormon tiroidiostimulant hipofizar (TSH) din serul sanguin _. S - _a stabilit că hipotiroidismul subclinic este detectat la 38-45% dintre pacienții cu tuberculoză pulmonară și este cel mai adesea diagnosticat în formele diseminate și fibro-cavernoase ale procesului. În aceste forme, nivelurile atât de T3, cât și de T4 sunt cel mai brusc reduse _, iar _{dezechilibrul} acestor hormoni apare sub forma unei creșteri a _{raportului T4/} T3.

Funcția cortexului suprarenal este evaluată prin nivelul seric de cortizol, iar funcția endocrină a pancreasului este evaluată prin concentrația de insulină imunoreactivă. În faza acută a unei boli infecțioase, nevoia de cortizol endogen și insulină crește. Hiperinsulinemia indică, de asemenea, rezistența la insulină a țesuturilor organismului, ceea ce este tipic pentru orice proces inflamator activ, în special unul specific. Determinarea funcției glucocorticoide a glandelor suprarenale în tuberculoza pulmonară activă ne permite să detectăm prezența hipercorticismului la majoritatea pacienților. Concentrațiile normale de cortizol din sânge la un pacient cu inflamație infecțioasă în perioada acută trebuie considerate o insuficiență relativă a funcției glucocorticoide a cortexului suprarenal, care poate servi drept bază pentru terapia de substituție cu doze adecvate de glucocorticoizi.

Aproape o treime dintre pacienții cu tuberculoză pulmonară au un nivel scăzut de insulinemie, apropiindu-se de limita inferioară a normei, în timp ce 13-20% prezintă hiperinsulinism semnificativ. Atât hipo-, cât și hiperinsulinismul relativ sunt factori de risc ridicat pentru dezvoltarea tulburărilor metabolismului carbohidraților de severitate variabilă. Aceste modificări ale activității funcționale a celulelor B pancreatice necesită monitorizarea regulată a glicemiei la pacienții cu tuberculoză și prevenirea la timp a diabetului zaharat. În plus, acest lucru servește ca o justificare suplimentară pentru oportunitatea utilizării dozelor fiziologice de insulină în terapia complexă a tuberculozei.

În general, scăderea nivelului hormonilor tiroidieni, dezechilibrul acestora, hipercortisolemia și hiperinsulinismul sunt cele mai pronunțate la pacienții cu o evoluție severă a procesului tuberculos, cu leziuni pulmonare extinse și simptome pronunțate de intoxicație cu tuberculoză.

Diagnosticul microbiologic al tuberculozei

Studiile microbiologice sunt necesare pentru identificarea pacienților cu tuberculoză, verificarea diagnosticului, monitorizarea și corectarea chimioterapiei, evaluarea rezultatelor tratamentului, cu alte cuvinte, din momentul înregistrării unui pacient cu tuberculoză până la radierea sa din registru.

Toate programele și proiectele epidemiologice se bazează pe evaluarea numărului de excretoare de bacterii, ceea ce este imposibil de realizat fără utilizarea metodelor de laborator pentru detectarea micobacteriilor tuberculoase. Atunci când se examinează atractivitatea așa-numitei populații neorganizate, procentul de excretoare de bacterii ajunge la 70 sau mai mult, ceea ce face ca metodele de laborator să fie un mijloc destul de eficient de identificare a pacienților cu tuberculoză în cadrul acestui grup populațional.

Metodele microbiologice tradiționale de diagnosticare a tuberculozei sunt studiile bacterioscopice și culturale. Metodele moderne includ cultivarea micobacteriilor tuberculoase în sisteme automate și PCR. Cu toate acestea, toate aceste metode sunt în mod necesar combinate cu metodele bacteriologice clasice.

Colectarea de materiale de diagnostic

Eficacitatea testelor de laborator depinde în mare măsură de calitatea materialului de diagnostic. Respectarea regulilor de colectare, depozitare și transport al materialului de diagnostic, precum și implementarea precisă a algoritmului de examinare a pacientului, afectează direct rezultatul și asigură siguranța biologică.

O varietate de materiale sunt utilizate pentru testarea tuberculozei. Deoarece tuberculoza pulmonară este cea mai frecventă formă de infecție tuberculoasă, principalul material pentru testare este considerat a fi sputa și alte tipuri de secreții ale arborelui traheobronșic: secreții ale tractului respirator superior obținute după inhalarea de aerosoli: ape de lavaj bronșic; lavaje bronhoalveolare; material obținut în timpul bronhoscopiei, biopsiei transtraheale și intrapulmonare: aspirat bronșic, frotiuri laringiene, exudate, frotiuri de plagă etc.

Eficacitatea cercetării crește dacă se efectuează colectarea controlată a materialelor de la pacient. În acest scop, se alocă o cameră special echipată sau se achiziționează cabine speciale. Colectarea materialelor este o procedură periculoasă, prin urmare, materialul pentru cercetare trebuie colectat în conformitate cu regulile de siguranță împotriva infecțiilor.

Materialul pentru testarea Mycobacterium tuberculosis este colectat în flacoane sterile cu capace bine închise pentru a preveni contaminarea mediului și a proteja materialul colectat de contaminare.

Flacoanele pentru colectarea materialului de diagnostic trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:

• trebuie să fie fabricat din material rezistent la impact;
• ar trebui să se topească ușor după autoclavizare;
• să aibă un volum suficient (40-50 ml):
• să aibă o deschidere largă pentru colectarea sputei (diametrul nu mai mic de 30 mm);
• să fie ușor de manipulat, transparent sau translucid, astfel încât cantitatea și calitatea probei colectate să poată fi evaluate fără a deschide capacul.

Pentru a obține rezultate optime ale cercetării, trebuie îndeplinite următoarele condiții:

• recoltarea materialului trebuie efectuată înainte de începerea chimioterapiei;
• materialul pentru studiu trebuie colectat înainte de a mânca sau de a lua medicamente dimineața;
• Pentru studiu, este recomandabil să se recolteze cel puțin 3 probe de spută matinală. Sputa se recoltează timp de 3 zile consecutive;
• Materialul colectat trebuie livrat la laborator cât mai repede posibil:
• în cazurile în care este imposibilă livrarea imediată a materialului la laborator, acesta se păstrează la frigider la o temperatură a aerului de 4 °C timp de cel mult 48 de ore;
• La transportul materialului, este necesar să se acorde o atenție deosebită integrității sticlelor.

Sputa recoltată corect are un caracter mucos sau mucopurulent. Volumul optim al porțiunii de spută examinate este de 3-5 ml.

Sputa se recoltează sub supravegherea unui lucrător medical. Persoanele responsabile de colectarea sputei trebuie să se asigure că sunt respectate anumite reguli:

• Este necesar să se explice pacientului scopul examinării și necesitatea de a tuși nu cu salivă sau mucus nazofaringian, ci cu conținutul secțiunilor profunde ale tractului respirator. Acest lucru se poate realiza ca urmare a unei tuse productive care apare după mai multe (2-3) respirații adânci. De asemenea, este necesar să se avertizeze pacientul că trebuie să-și clătească mai întâi gura cu apă fiartă pentru a îndepărta partea principală a microflorei care vegetează în cavitatea bucală și resturile alimentare care complică examinarea sputei;
• Lucrătorul medical implicat în colectarea sputei, pe lângă halat și bonetă, trebuie să poarte mască, mănuși de cauciuc și șorț de cauciuc;
• stând în spatele pacientului, acesta este sfătuit să țină flaconul cât mai aproape de buze și să separe imediat sputa în el în timp ce tușește, fiind necesar să se asigure că fluxul de aer este direcționat departe de lucrătorul medical:
• După ce recoltarea sputei este completă, lucrătorul medical trebuie să închidă cu grijă flaconul cu capacul și să evalueze cantitatea și calitatea sputei colectate. Flaconul este apoi etichetat și plasat într-o cutie specială pentru transportul la laborator.

Dacă pacientul nu produce spută, atunci cu o seară înainte și dimineața devreme în ziua recoltării materialului, trebuie să i se administreze un expectorant: extract din rădăcini de nalbă mare (mucaltin), bromhexină, ambroxol etc. - sau se utilizează o inhalare iritantă, utilizând echipamentul instalat în încăperea pentru colectarea sputei. Materialul recoltat în acest mod nu este supus conservării și trebuie examinat în ziua recoltării. Pentru a evita „respingerea” acestuia în laborator, trebuie făcută o mențiune specială în trimitere.

Dacă studiile microbiologice nu sunt efectuate într-o anumită instituție, materialul de diagnostic colectat trebuie livrat la laborator centralizat, cu condiția ca materialul să fie păstrat la frigider sau cu conservanți între livrări. Materialul este livrat la laborator în cutii de transport care pot fi ușor dezinfectate. Fiecare probă trebuie să fie prevăzută cu o etichetă corespunzătoare, iar întregul lot trebuie să aibă un formular însoțitor completat.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Modalități și frecvență de examinare a pacienților

În timpul examinării inițiale, așa-numitei examinări diagnostice, a unui pacient pentru tuberculoză, este necesar să se examineze cel puțin 3 porții de spută colectate sub supravegherea personalului medical pe parcursul a 2 sau 3 zile, ceea ce crește eficacitatea microscopiei.

Screeningul primar pentru tuberculoză ar trebui efectuat de către toate instituțiile medicale și de diagnostic din sistemul de sănătate. Recent, pentru a crește eficiența examinării primare, au fost organizate așa-numitele centre de microscopie pe baza laboratoarelor de diagnostic clinic, dotate cu microscoape și echipamente moderne pentru a asigura siguranța epidemică.

Instituțiile antituberculoase utilizează o schemă de anchetă care prevede cel puțin examinarea triplă a sputei sau a altor materiale de diagnostic în decurs de 3 zile. În timpul tratamentului, studiile microbiologice sunt efectuate în mod regulat, cel puțin o dată pe lună, în faza de chimioterapie intensivă. La trecerea la faza de urmărire, studiile sunt efectuate mai rar - la intervale de 2-3 luni, în timp ce frecvența studiilor este redusă la două.

Caracteristicile colectării materialului diagnostic pentru tuberculoza extrapulmonară

O caracteristică a materialului patologic în formele extrapulmonare de tuberculoză este concentrația scăzută de micobacterii tuberculoase în acesta, ceea ce necesită metode mai sensibile de cercetare microbiologică, în principal metode de semănat pe un mediu nutritiv.

În cazul tuberculozei genitourinare, urina este materialul cel mai accesibil pentru examinare. Colectarea urinei trebuie efectuată de o asistentă medicală special instruită.

Organele genitale externe se spală cu apă și săpun sau cu o soluție slabă de permanganat de potasiu. Deschiderea externă a uretrei se tratează cu atenție. Porțiunea din mijloc a urinei de dimineață se recoltează într-un flacon steril: la bărbați - în mod natural, la femei - cu ajutorul unui cateter. Urina din pelvisul renal se recoltează în eprubete sterile în timpul cateterizării unuia sau a ambilor rinichi, în acest ultim caz - în mod obligatoriu separat de la fiecare rinichi. O cantitate mică din această urină se centrifughează, se examinează sedimentul.

La bărbați, sperma, puncțiile testiculare și secrețiile prostatice sunt centrifugate pentru a obține un sediment. În cazul oricărei localizări a unui anumit proces în zona genitală la bărbați, masajul prostatic poate promova eliberarea secrețiilor care conțin micobacterii tuberculoase.

Sângele menstrual se recoltează de la femei prin aspirație sau folosind o capsulă Kafka. Materialul rezultat se eliberează de eritrocite prin spălare cu apă distilată și apoi centrifugare. Sedimentul este examinat.

Secrețiile din canalul cervical al uterului sunt colectate într-un recipient sau capac Kafka, adică este de dorit să se acumuleze 1-2 ml de material patologic.

Materialul obținut în timpul intervențiilor chirurgicale la nivelul rinichilor, organelor genitale, biopsiilor, prelevărilor de endometriu este omogenizat. Pentru aceasta, se introduce într-un mojar steril și se zdrobește temeinic cu o foarfecă sterilă. La suspensia rezultată se adaugă nisip steril de râu într-o cantitate egală cu masa sa, apoi se adaugă 0,5-1,0 ml de soluție izotonică de clorură de sodiu și totul se măcină până se formează o masă pasoasă prin adăugarea de soluție izotonică de clorură de sodiu (4-5 ml). Apoi, masa este lăsată să se așeze timp de 1-1,5 minute, iar supernatantul este examinat.

Tuberculoza oaselor și articulațiilor. Puncția (puroiul din abcese) obținută cu o seringă sterilă se introduce într-un recipient steril și se livrează imediat la laborator. Folosind o pipetă sterilă, umezită în prealabil cu soluție izotonică sterilă de clorură de sodiu, se prelevează 2-5 ml de puroi, se transferă într-o sticlă cu perle și se adaugă încă 2-3 ml de soluție izotonică de clorură de sodiu. Sticla se închide cu un dop și se agită într-un agitator timp de 8-10 minute. Se examinează suspensia omogenizată.

În formele fistuloase de tuberculoză osteoarticulară, puroiul este prelevat din fistulă. Secreția abundentă este colectată direct într-o eprubetă. În cazurile de secreție insuficientă de puroi, tractul fistulei este spălat cu o soluție izotonică sterilă de clorură de sodiu, iar spălările colectate într-o eprubetă sau o bucată de tampon îmbibat în puroi sunt trimise pentru examinare.

Materialul chirurgical obținut în timpul intervențiilor chirurgicale la nivelul oaselor și articulațiilor poate consta din mase purulent-necrotice, granulații, țesut cicatricial, țesut osos, țesut al membranei sinoviale și alte substraturi. Prelucrarea acestuia se efectuează ca în cazul tuberculozei renale.

Examinarea microbiologică a lichidului sinovial într-o soluție de citrat de sodiu 3% (într-un raport 1:1) pentru a preveni coagularea se efectuează imediat după puncție.

Tuberculoza ganglionilor limfatici. Puroiul extras în timpul puncției ganglionilor limfatici este examinat în același mod ca puroiul din abcese. Țesutul ganglionar limfatic obținut în timpul intervențiilor chirurgicale și biopsiilor este examinat ca și în alte forme de tuberculoză.

Studiul fecalelor pentru Mycobacterium tuberculosis se efectuează extrem de rar din cauza absenței aproape complete a rezultatelor pozitive.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Microscopia micobacteriilor

Microscopia sputei este o metodă relativ rapidă, simplă și ieftină, care ar trebui utilizată în toate cazurile în care se suspectează tuberculoza. În plus, acest studiu este efectuat pentru a evalua eficacitatea chimioterapiei și pentru a confirma recuperarea sau eșecul tratamentului în absența rezultatelor culturilor.

Se utilizează două metode de examinare microscopică:

• metoda de microscopie directă, când un frotiu este preparat direct din materialul de diagnostic;
• o metodă de microscopie a sedimentelor preparate din material tratat cu decontaminanți pentru cercetări culturale.

Prima metodă este utilizată în acele laboratoare unde se efectuează doar studii microscopice (laboratoare de diagnostic clinic ale rețelei medicale generale).

Cele mai bune rezultate ale examinării microscopice se obțin prin concentrarea materialului de diagnostic (de exemplu, prin centrifugare).

Pentru a detecta Mycobacterium tuberculosis cu o probabilitate de 50% prin microscopie, 1 ml de spută trebuie să conțină mai mult de 5.000 de celule microbiene. Sputa de la pacienții cu forme pulmonare de tuberculoză conține de obicei un număr semnificativ de bacterii acido-rezistente, ceea ce permite detectarea fiabilă a acestora prin bacterioscopie. Sensibilitatea diagnostică a acestei metode poate fi crescută prin examinarea mai multor probe de spută de la un singur pacient. Un rezultat negativ al examenului bacterioscopic nu exclude diagnosticul de tuberculoză, deoarece sputa unor pacienți conține mai puține Mycobacterium decât poate fi detectată prin microscopie. Pregătirea deficitară a frotiurilor de spută poate fi, de asemenea, cauza unui rezultat negativ al examenului bacterioscopic.

Cea mai comună metodă de detectare a micobacteriilor acido-rezistente într-un frotiu este colorarea Ziehl-Neelsen. Metoda se bazează pe penetrarea carbolfucsinei într-o celulă microbiană printr-o membrană care include un strat ceros-lipidic, cu efectul simultan al încălzirii și al acțiunii puternice de corodare a fenolului. Decolorarea ulterioară a frotiului cu o soluție de acid sulfuric 25% sau alcool clorhidric 3% duce la decolorarea tuturor structurilor neacido-rezistente. Elementele decolorate ale frotiului sunt colorate cu o soluție de albastru de metilen 0,3%. Micobacteriile nu percep coloranții anilinici convenționali, drept urmare micobacteriile acido-rezistente sunt colorate în roșu-zmeură, iar alți microbi și elemente celulare sunt colorate în albastru.

Pentru examinarea frotiurilor colorate conform Ziehl-Neelsen, se utilizează un microscop binocular cu lumină, cu obiectiv de imersie (mărire de 90 sau 100 de ori) și un ocular cu mărire de 7 sau 10 ori. Se examinează 100 de câmpuri vizuale, ceea ce este suficient pentru a detecta micobacterii individuale în frotiu. Dacă rezultatul unei astfel de examinări este negativ, se recomandă examinarea a încă 200 de câmpuri vizuale pentru confirmare. Rezultatele sunt înregistrate, indicând numărul de micobacterii acido-rezistente (AFB) detectate.

Pe lângă această metodă, colorarea cu fluorocrom este utilizată pentru microscopia luminescentă, ceea ce permite obținerea celor mai bune rezultate. Utilizarea acestei metode crește eficiența microscopiei cu 10-15%. Când micobacteriile sunt tratate cu coloranți luminescenți (auramină, rodamină etc.), aceste substanțe se leagă și de structurile ceroase ale celulei microbiene. Când celulele colorate sunt iradiate cu o sursă de lumină excitantă (un anumit spectru de radiații ultraviolete), acestea încep să strălucească portocaliu sau roșu aprins pe un fundal negru sau verde închis. Datorită luminozității și contrastului ridicat al imaginii vizibile, mărirea generală a microscopului poate fi redusă de 4-10 ori, ceea ce extinde câmpul vizual și reduce timpul de vizualizare a preparatului. Împreună cu aceasta, datorită adâncimii de câmp semnificativ mai mari, confortul studiului poate fi sporit.

Când se utilizează microscopia cu fluorescență, vizualizarea aceleiași zone a unui frotiu durează semnificativ mai puțin timp decât microscopia optică a frotiurilor colorate conform Ziehl-Neelsen. Dacă un microscopist vizualizează aproximativ 20-25 de astfel de frotiuri pe parcursul unei zile lucrătoare, atunci cu ajutorul microscopiei cu fluorescență poate examina mai mult de 60-80 de probe în același timp. Microscopiștii experimentați știu că colorarea celulelor cu un amestec de auramină și rodamină este într-un fel specifică pentru micobacteriile acido-rezistente, care în acest caz au aspectul unor tije aurii. Saprofitele sunt colorate verzui.

Un alt avantaj important al metodei de microscopie cu fluorescență este capacitatea de a detecta micobacteriile modificate care și-au pierdut proprietățile de rezistență la acid sub influența unui număr de factori nefavorabili, în special chimioterapia intensivă, și, prin urmare, nu sunt detectate prin colorare Ziehl-Neelsen.

Dezavantajele metodei de microscopie cu fluorescență includ costul relativ ridicat al microscopului și al funcționării acestuia. Cu toate acestea, în laboratoarele centralizate sau în alte laboratoare mari, unde volumul de muncă depășește norma a trei tehnicieni de laborator care lucrează cu trei microscoape convenționale, este mai ieftin să se utilizeze un singur microscop cu fluorescență.

Metodele bacterioscopice au o specificitate destul de ridicată (89-100%). Aproximativ 97% din rezultatele pozitive obținute prin orice metodă de microscopie sunt confirmate clar de rezultatele semănatului.

Trebuie menționat că examinarea microscopică a unui frotiu de material patologic nu permite determinarea speciei micobacteriilor rezistente la acid detectate. Metoda microscopică permite tragerea unei concluzii doar despre prezența sau absența microorganismelor rezistente la acid în preparat, ceea ce se explică prin existența în natură a unui număr mare de microorganisme rezistente la acid netuberculoase, similare morfologic cu micobacteriile din complexul tuberculos.

Evaluarea rezultatelor microscopiei se efectuează în unități semicantitative.

Pentru a putea compara rezultatele diferitelor metode de microscopie, se introduc coeficienți empirici. De exemplu, pentru a compara rezultatele unui frotiu colorat cu coloranți fluorescenți cu datele unui studiu de microscopie optică (mărire de 1000 de ori), este necesar să se împartă numărul de micobacterii acido-rezistente detectate folosind un microscop fluorescent la coeficientul corespunzător: la o mărire de 250 de ori a microscopului - la 10, la o mărire de 450 de ori - la 4, la o mărire de 630 de ori - la 2.

Caracteristicile microscopiei în tuberculoza extrapulmonară

Se efectuează microscopia directă, precum și microscopia frotiurilor preparate după îmbogățire cu colorare ulterioară conform metodei Ziehl-Neelsen sau cu coloranți fluorescenți. Microscopia directă a frotiurilor este ineficientă din cauza concentrației scăzute de micobacterii din material și, prin urmare, este mai rațional să se utilizeze metode de îmbogățire. Centrifugarea este cea mai eficientă. Dacă materialul biologic este vâscos, se utilizează centrifugarea cu omogenizare și lichefiere simultană a materialului, care se realizează folosind centrifuge de mare viteză cu o forță de centrifugare de 3000 g și soluții de hipoclorit. Alte metode de îmbogățire, cum ar fi microflotația, nu sunt utilizate în prezent din cauza formării de aerosoli biologic periculoși.

[ 37 ]

Metoda de cultură pentru diagnosticarea tuberculozei

Metoda de însămânțare, sau metoda de cultură, este mai sensibilă decât microscopia cu frotiu și are o serie de avantaje față de aceasta din urmă. Permite detectarea a câteva zeci de micobacterii viabile în materialul examinat și are o valoare diagnostică ridicată. Acest lucru este deosebit de important atunci când se examinează material de la pacienți nou diagnosticați sau tratați care excretă un număr mic de micobacterii.

Comparativ cu microscopia, cercetarea culturilor permite creșterea numărului de pacienți cu tuberculoză detectați cu peste 15-25%, precum și verificarea tuberculozei în stadii incipiente, când boala este încă ușor tratabilă. Un avantaj foarte important al cercetării culturilor este considerat a fi posibilitatea obținerii unei culturi de agent patogen, care poate fi identificat și studiat în raport cu sensibilitatea la medicamente, virulența și alte proprietăți biologice.

Dezavantajele metodelor de cultivare includ durata lor (perioada de așteptare pentru materiale ajunge la 10 săptămâni), costul mai mare și complexitatea procesării materialului de diagnostic.

Principii de tratament pre-semănat al materialului de diagnostic

Metodele microbiologice convenționale nu pot fi utilizate pentru efectuarea testelor de tuberculoză. Acest lucru se datorează faptului că micobacteriile tuberculoase cresc foarte lent, iar majoritatea probelor clinice conțin microorganisme și ciuperci piogene și putrefactive cu creștere rapidă. Creșterea lor rapidă pe medii nutritive bogate interferează cu dezvoltarea micobacteriilor și nu permite izolarea agentului patogen tuberculos, astfel încât materialul de diagnostic trebuie pretratat înainte de semănat. În plus, micobacteriile eliberate din tractul respirator al pacientului sunt de obicei înconjurate de o cantitate mare de mucus, ceea ce face dificilă concentrarea lor. În acest sens, înainte de semănat, sputa și alte materiale similare trebuie lichefiate și decontaminate.

Toți detergenții și decontaminanții au un efect toxic mai mult sau mai puțin pronunțat asupra micobacteriilor. Ca urmare a tratamentului, până la 90% dintre micobacterii pot muri. Pentru a păstra o parte suficientă a populației micobacteriene, este necesar să se utilizeze metode de tratament blânde care să permită, pe de o parte, suprimarea microorganismelor piogene și putrefactive cu creștere rapidă și, pe de altă parte, păstrarea la maximum a viabilității micobacteriilor prezente în material.

În funcție de material, omogenitatea acestuia și nivelul de contaminare, pentru tratamentul pre-însămânțare se utilizează diverși decontaminanți: pentru spută - soluție de hidroxid de sodiu 4%, soluții de fosfat trisodic 10%, clorură de benzalconiu fosfat trisodic, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteină-hidroxid de sodiu) cu o concentrație finală de NaOH de 1%, pentru urină și alte materiale lichide - soluție de acid sulfuric 3%, pentru probe contaminate, materiale care conțin grăsimi - soluție de acid oxalic de până la 5%. În plus, în unele cazuri, se utilizează enzime și surfactanți (detergenți). Utilizarea Tween și a altor detergenți este însoțită de o moarte mai mică a celulelor micobacteriene (40-50% supraviețuiesc). Cu toate acestea, aceștia pot fi utilizați doar pentru materiale lichide. NALC-NaOH, produs în kituri, este cel mai utilizat în lume. Această metodă permite izolarea a peste 85% din populația de celule micobacteriene. Decontaminarea materialelor solide care conțin țesut este mai dificilă, deoarece este dificil de estimat gradul de dispersie a materialului în timpul omogenizării. De exemplu, procesarea biopsiilor ganglionilor limfatici este adesea însoțită de o frecvență crescută a contaminării cu floră străină. În acest caz, se poate utiliza etoniu 1%.

Materialul neomogen este omogenizat folosind sfere de sticlă în prezența decontaminanților. Materialele lichide sunt precentrifugate și se procesează doar sedimentul.

Tehnica de semănat și incubare

După procesarea preliminară, materialul este centrifugat, ceea ce precipită micobacteriile și crește conținutul acestora în sediment („îmbogățire a sedimentului”). Sedimentul rezultat este neutralizat și inoculat pe suprafața unor medii nutritive dense sau a unor eprubete cu medii lichide (semilichide). Din sedimentul rămas se prepară frotiuri pentru examinare microscopică. Tehnica de însămânțare trebuie să prevină contaminarea încrucișată a materialului de diagnostic.

Pentru o interpretare clinică fiabilă a rezultatelor cercetărilor microbiologice, trebuie respectată următoarea regulă: studiile microscopice și culturale trebuie efectuate în paralel din aceeași probă de material diagnostic.

Tuburile inoculate sunt plasate într-un termostat la 37 ^° C timp de 2 zile, în poziție orizontală. Acest lucru asigură o absorbție mai uniformă a materialului în mediul nutritiv. După 2 zile, tuburile sunt mutate în poziție verticală și sigilate ermetic cu dopuri de cauciuc sau silicon pentru a preveni uscarea mediului însămânțat.

Culturile sunt păstrate într-un termostat la 37 ^° C timp de 10-12 săptămâni, cu inspecție săptămânală regulată. Următorii parametri sunt înregistrați la fiecare inspecție de control:

• perioadă de creștere observabilă vizual din ziua semănatului;
• rata de creștere (numărul de UFC);
• contaminarea culturii cu floră microbiană sau ciuperci străine (astfel de eprubete sunt îndepărtate);
• nicio creștere vizibilă. Tuburile sunt lăsate în termostat până la următoarea inspecție.

Medii nutritive

Pentru cultivarea micobacteriilor se utilizează diverse medii nutritive: solide, semilichide, lichide. Cu toate acestea, niciunul dintre mediile nutritive cunoscute nu are proprietăți care să asigure creșterea tuturor celulelor micobacteriene. În acest sens, pentru a îmbunătăți eficiența, se recomandă utilizarea simultană a 2-3 medii nutritive cu compoziții diferite.

Ca mediu standard pentru izolarea primară a agentului patogen tuberculos și determinarea sensibilității sale la medicamente, OMS recomandă mediul Lowenstein-Jensen. Acesta este un mediu dens cu ouă pe care se obține creșterea micobacteriilor în ziua 20-25 după semănarea materialului bacterioscopic pozitiv. Semănarea materialului bacterioscopic negativ necesită o perioadă de incubație mai lungă (până la 10-12 săptămâni).

În țara noastră, mediul de cultură cu ouă Finn-II propus de E. R. Finn a devenit larg răspândit. Acesta diferă prin faptul că în loc de L-asparagină folosește glutamatul de sodiu, care declanșează alte căi pentru sinteza aminoacizilor în micobacterii. Creșterea apare pe acest mediu ceva mai devreme, iar frecvența izolării micobacteriilor este cu 6-8% mai mare decât pe mediul Lowenstein-Jensen.

Pentru a crește eficiența diagnosticului bacteriologic al tuberculozei extrapulmonare, este recomandabil să se includă în complexul de medii nutritive medii Finn-II modificate. Pentru a accelera creșterea, în mediul nutritiv Finn-II se introduce suplimentar tioglicolat de sodiu 0,05%, ceea ce reduce concentrația de oxigen. Pentru a proteja sistemele enzimatice ale micobacteriilor de produșii toxici ai peroxidării lipidice, antioxidantul α-tocoferol acetat se introduce în mediul nutritiv Finn-II la o concentrație de 0,001 μg/ml. Materialul de diagnostic este însămânțat folosind metoda standard.

În laboratoarele antituberculoase din Rusia se utilizează și alte modificări ale mediilor nutritive dense: mediul nutritiv „Novaya” propus de G.G. Mordovsky, mediile nutritive A-6 și A-9 dezvoltate de VA Anikin etc.

Datorită faptului că în timpul chimioterapiei apar leziuni ale diferitelor sisteme metabolice ale celulei microbiene, o parte din populația micobacteriană își pierde capacitatea de a se dezvolta normal pe medii nutritive convenționale și necesită medii nutritive echilibrate osmotic (semilichide sau lichide).

Evaluarea și înregistrarea rezultatelor culturii materialului de diagnostic

Unele tulpini și tipuri de micobacterii cresc lent, creșterea putând apărea chiar și în ziua a 90-a. Numărul unor astfel de culturi este mic, dar acest lucru obligă la păstrarea semănatelor într-un termostat timp de 2,5-3 luni.

Culturile virulente de Mycobacterium tuberculosis cresc de obicei pe medii solide de cultură cu ouă sub formă de colonii în formă de R, de dimensiuni și aspect variabile. Coloniile sunt uscate, ridate, de culoarea fildeșului și ușor pigmentate. Pe alte medii, coloniile de Mycobacterium tuberculosis pot fi mai umede. După o cură de chimioterapie sau în timpul tratamentului, se pot izola colonii netede cu creștere umedă (forme S).

La izolarea culturilor, se utilizează un set de studii speciale pentru a distinge micobacteriile tuberculoase de micobacteriile non-tuberculoase și saprofitele acido-rezistențe.

Un răspuns pozitiv se dă după o examinare microscopică obligatorie a unui frotiu din coloniile crescute, colorate conform Ziehl-Neelsen. În cazul creșterii micobacteriilor, în frotiuri se găsesc bastonașe roșii aprins, așezate individual sau în grupuri, formând clustere sub formă de pâslă sau împletituri. În culturile tinere, în special cele izolate de la pacienții tratați cu chimioterapie pentru o perioadă lungă de timp, micobacteriile se disting prin polimorfism pronunțat, până la prezența unor variante scurte, aproape cocoide sau alungite, care seamănă cu miceliul fungic, alături de forme în formă de bastonaș.

Intensitatea creșterii micobacteriene este desemnată conform următoarei scheme: (+) - 1-20 UFC într-o eprubetă (excreție bacteriană scăzută); (++) - 20-100 UFC într-o eprubetă (excreție bacteriană moderată); (+++) - >100 UFC într-o eprubetă (excreție bacteriană abundentă). În diagnosticul de laborator al tuberculozei, nu este suficient să se dea un răspuns care să indice dacă micobacteriile au fost detectate sau nu printr-o anumită metodă. De asemenea, este necesar să se aibă o idee detaliată despre volumul și natura populației micobacteriene, compoziția și proprietățile acesteia. Aceste date permit interpretarea corectă a stării procesului, planificarea tacticilor și ajustarea promptă a tratamentului.

În ultimii ani, au fost propuse medii nutritive pe bază de agar cu diverși aditivi de creștere și utilizarea unui amestec special de gaze pentru a accelera creșterea micobacteriilor. Pentru a obține creșterea micobacteriilor pe aceste medii, în timpul cultivării se creează o atmosferă cu un conținut crescut de dioxid de carbon (4-7%). În acest scop, se utilizează incubatoare speciale cu CO2 _. Cu toate acestea, sistemele automate de cultivare a micobacteriilor au cunoscut cea mai mare dezvoltare: MGIT-BACTEC-960 și MB/Bact.

Unul dintre aceste sisteme este sistemul MGIT (tub indicator de creștere a micobacteriilor), care reprezintă o dezvoltare de înaltă tehnologie și este conceput pentru diagnosticarea bacteriologică accelerată a tuberculozei și determinarea sensibilității micobacteriilor la medicamentele de primă linie și la unele medicamente de a doua linie. MGIT este conceput pentru a fi utilizat ca parte a dispozitivului VASTEC-960. Microorganismele sunt cultivate în eprubete speciale cu un mediu nutritiv lichid pe bază de mediu Middlebrook-7H9 modificat. Pentru a stimula creșterea micobacteriilor și a suprima creșterea microflorei străine, se utilizează suplimentul de creștere MGIT și un amestec de medicamente antibacteriene PANTA.

Creșterea microorganismelor este înregistrată optic. Se bazează pe fluorescență, care apare atunci când micobacteriile consumă oxigen în timpul creșterii lor. Un colorant fluorocrom dependent de oxigen este conținut în fundul unei eprubete speciale și acoperit cu un strat de silicon. Reproducerea micobacteriilor duce la o scădere a cantității de oxigen din eprubetă și la o scădere a concentrației acestuia, ceea ce provoacă o creștere a fluorescenței, care devine vizibilă atunci când eprubeta este iradiată cu lumină ultravioletă și este înregistrată automat de fotosenzorii încorporați în dispozitivul VASTES-960. Intensitatea luminescenței este înregistrată în unități de creștere (UG). Datele de creștere sunt introduse automat într-un computer, unde pot fi salvate. Analiza computerizată a curbelor de creștere poate oferi informații despre prezența diferitelor grupuri de micobacterii, inclusiv a celor non-tuberculoase, și ajută, de asemenea, la evaluarea proprietăților de creștere ale micobacteriilor.

Ca urmare a introducerii unor astfel de sisteme, timpul de creștere a micobacteriilor a fost redus semnificativ, fiind în medie de 11 zile pe VASTEC-960 și 19 zile pe MB/Bact față de 33 de zile pe un mediu nutritiv dens standard. Trebuie menționat că aceste sisteme necesită personal înalt calificat. Semănatul materialului pe medii lichide este însoțit în mod obligatoriu de semănatul pe mediul Lowenstein-Jensen, care joacă rolul de rezervă în cazurile în care micobacteriile tuberculoase nu cresc pe alte medii.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Determinarea sensibilității micobacteriilor la medicamente

Determinarea spectrului și a gradului de sensibilitate a micobacteriilor la medicamentele antituberculoase are o importanță clinică deosebită, precum și pentru evaluarea epidemiologică a răspândirii tuberculozei rezistente la medicamente. În plus, monitorizarea rezistenței la medicamente ne permite să evaluăm eficacitatea programului antituberculos în ansamblu, fiind un indicator integral al activității tuturor componentelor măsurilor antituberculoase.

Frecvența și momentul testării sensibilității la medicamente:

• înainte de începerea tratamentului, o dată pentru a determina strategia și tactica de tratament:
• La izolarea culturilor din diverse materiale de la un pacient (spută, BAL, urină, exudate, lichid cefalorahidian etc.), se examinează toate tulpinile izolate:
• la sfârșitul fazei intensive de tratament în absența unor modificări clinice și radiologice:
• dacă este necesară modificarea schemei de tratament în cazul:
  • absența negativității sputei;
  • recultură după negativitatea sputei;
  • o creștere bruscă a cantității de AFB într-un frotiu după o scădere inițială. Este bine cunoscut faptul că tulpinile de Mycobacterium tuberculosis cu sensibilitate diferită la medicamente sunt izolate din materialul unui pacient cu tuberculoză. Sensibilitatea tulpinilor la medicamentele antituberculoase poate diferi în spectrul medicamentelor, gradul, frecvența și viteza de dezvoltare a rezistenței.

Gradul de rezistență la medicamente al Mycobacterium tuberculosis se determină în conformitate cu criteriile stabilite, care se concentrează pe semnificația clinică a rezistenței și depind de activitatea antituberculoasă a medicamentului, farmacocinetica sa, concentrația în leziune, doza terapeutică maximă etc.

Determinarea sensibilității micobacteriilor la medicamente se efectuează în prezent folosind metode microbiologice:

• concentrații absolute (metoda de diluare pe medii nutritive solide sau lichide),
• proporții,
• coeficientul de rezistență.

De obicei, rezistența se manifestă sub forma creșterii vizuale a coloniilor de micobacterii tuberculose, însă există metode care induc creșterea în stadiile incipiente ale diviziunii celulare micobacteriene sub formă de reacții de culoare. Aceste metode reduc timpul de testare de la 3-4 la 2 săptămâni.

Metoda concentrației absolute recomandată de Comitetul de Chimioterapie al OMS a devenit larg răspândită în Rusia ca metodă unificată. Din punct de vedere metodologic, este cea mai simplă, dar necesită o standardizare ridicată și precizie a procedurilor de laborator. Testul de sensibilitate la medicamente constă dintr-un set de eprubete cu un mediu nutritiv modificat cu medicamente antituberculoase. Setul este format din 2-3 eprubete cu concentrații diferite din fiecare dintre medicamentele utilizate, o eprubetă de control cu un mediu fără medicament și o eprubetă care conține 1000 μg/ml salicilat de sodiu sau 500 μg/ml acid paranitrobenzoic pentru a detecta creșterea micobacteriilor non-tuberculoase.

Pentru a prepara un set de medii cu preparate, se utilizează un mediu Lowenstein-Jensen modificat (fără amidon), care se toarnă în baloane. În fiecare balon se adaugă un anumit volum din diluția corespunzătoare a medicamentului antituberculos. Conținutul baloanelor se amestecă bine, se toarnă în eprubete și se coagulează într-o poziție înclinată timp de 40 de minute la o temperatură de 85°C. Se recomandă coagularea mediului într-un coagulator electric cu control automat al temperaturii. Mediu cu medicamente antituberculos

Primul rând poate fi păstrat la frigider la 2-4 °C timp de 1 lună, iar medicamentele din al doilea rând - nu mai mult de 2 săptămâni. Depozitarea mediilor cu medicamente la temperatura camerei este inacceptabilă. La prepararea soluțiilor de medicamente antituberculoase, se ia în considerare activitatea acestora, calculându-se concentrația ajustând greutatea moleculară a părții nespecifice a medicamentului, puritate etc. Pentru a determina sensibilitatea la medicament, se utilizează doar substanțe chimic pure.

Principiul metodei este de a determina concentrația unui medicament antituberculos care suprimă creșterea unei porțiuni semnificative a populației de micobacterii. Atunci când este efectuată corect, această metodă are o fiabilitate bună.

Înainte de efectuarea testului, este necesar să se asigure că cultura izolată de Mycobacterium tuberculosis nu conține microfloră străină. Din cultura de micobacterii într-o soluție de clorură de sodiu 0,9% se prepară o suspensie omogenă care conține 500 de milioane de corpi microbieni în 1 ml (standard de turbiditate optică 5 unități). Suspensia rezultată se diluează cu soluție de clorură de sodiu 0,9% (1:10) și se adaugă 0,2 ml de suspensie în fiecare eprubetă din setul de medii nutritive. Eprubetele inoculate se plasează într-un termostat la 37 °C și se mențin orizontal timp de 2-3 zile, astfel încât suprafața înclinată a mediului nutritiv să fie inoculată uniform cu suspensia de Mycobacterium tuberculosis. Apoi, eprubetele se deplasează în poziție verticală și se incubează timp de 3-4 săptămâni. Rezultatele se înregistrează după 3-4 săptămâni.

Întrucât timpul necesar pentru izolarea agentului patogen din materialul clinic pe medii nutritive este de cel puțin 1-1,5 luni, rezultatele determinării sensibilității la medicamente folosind această metodă pot fi obținute nu mai devreme de 2-2,5 luni de la însămânțarea materialului. Acesta este unul dintre principalele dezavantaje ale metodei.

Rezultatele testelor de sensibilitate la medicamente pentru micobacterii sunt interpretate pe baza anumitor criterii. Pe medii solide, o cultură este considerată sensibilă la concentrația medicamentului conținut în mediu dacă numărul de colonii micobacteriene crescute pe o anumită eprubetă cu medicamentul respectiv nu depășește 20, cu o creștere abundentă pe o eprubetă de control fără medicamente. Numai dacă există mai mult de 20 de colonii, cultura este considerată rezistentă la o anumită concentrație. În practică, atunci când se obțin rezultate de creștere în eprubete apropiate de 20 UFC, este necesar să se notifice unitatea clinică că sensibilitatea sau rezistența în acest caz este la limită, deoarece acest lucru poate explica uneori dinamica neclară a indicatorilor clinici.

Pentru diverse preparate, se stabilește o anumită concentrație la care se observă reproducerea unei proporții critice a populației micobacteriene. Aceste concentrații sunt numite „critice”. Ca și criteriu de stabilitate se folosește amploarea creșterii populației micobacteriene pe un mediu nutritiv cu preparatul la o concentrație critică.

În practica tiziologică internă, atunci când se determină rezistența la medicamente, aceasta nu se limitează doar la determinarea concentrațiilor critice. Acest lucru se datorează faptului că o definiție extinsă a nivelului de rezistență la medicamente al agentului patogen permite clinicianului să formuleze mai corect tactici de chimioterapie, utilizând cunoștințe despre efectul de potențare al combinațiilor de medicamente, să anticipeze rezistența încrucișată sau să utilizeze medicamente mai eficiente din grupul utilizat de medicamente antituberculoase.

Metoda concentrației absolute este cea mai simplă, dar și cea mai sensibilă la erorile făcute în implementarea sa. Mai fiabilă, în special atunci când se determină sensibilitatea la medicamentele de linia a doua, și răspândită în afara Rusiei este metoda proporțională. Aceasta ia în considerare deficiențele metodei concentrației absolute, dar necesită mai multă muncă pentru implementare.

Metoda este foarte similară cu metoda concentrației absolute. Prepararea eprubetelor cu medicamente este aceeași ca în metoda concentrației absolute. Cu toate acestea, doza de însămânțare a suspensiei de micobacterii tuberculoase este redusă de 10 ori, ceea ce elimină frecvența rezistenței spontane a unor tulpini de micobacterii tuberculoase la medicamente precum etambutol, protionamidă, capreomicină. Ca și controale, se utilizează 2 sau 3 eprubete cu o doză de însămânțare egală cu cea din eprubete, diluate succesiv de 10 și 100 de ori. Criteriul de rezistență este proporția de creștere observată vizual a micobacteriei tuberculoase. Pentru medicamentele de linia I, criteriul de rezistență este creșterea excesivă de 1% din populația inițială, pentru medicamentele de linia a II-a - creșterea de 1 sau mai mult de 10% din cea inițială, în funcție de concentrația critică selectată.

În 1997, grupul de lucru al OMS și al Uniunii Internaționale Împotriva Tuberculozei pentru detectarea rezistenței la medicamentele antituberculoase a făcut ajustări la aceste criterii, propunând ca micobacteriile care cresc pe mediul dens de ouă Lowenstein-Jensen la următoarele concentrații să fie considerate rezistente:

• dihidrostreptomicină - 4 μg/ml;
• izoniazidă - 0,2 µg/ml:
• rifampicină - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

În 2001, au fost propuse concentrații critice pentru următoarele medicamente de linia a doua (pentru o proporție critică de 1%):

• capreomicină - 40 mcg/ml;
• protionamidă - 40 mcg/ml;
• kanamicină - 30 μg/ml;
• viomicină - 30 μg/ml;
• cicloserină - 40 mcg/ml;
• acid aminosalicilic - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacină - 2 mcg/ml.

Rezultatele creșterii sunt evaluate după 4 săptămâni ca evaluare preliminară și după 6 săptămâni de cultivare ca evaluare finală.

Pentru determinarea sensibilității la pirazinamidă, o substanță utilizată pe scară largă în chimioterapia modernă împotriva tuberculozei, concentrația critică recomandată este de 200 μg/ml. Cu toate acestea, încă nu există o metodă general acceptată pentru determinarea rezistenței la acest medicament pe medii nutritive solide, deoarece activitatea sa antibacteriană se manifestă doar într-un mediu acid (pH <6), care este dificil de întreținut din punct de vedere tehnic. În plus, multe culturi clinice de Mycobacterium tuberculosis sunt reticente în a crește pe medii de cultură cu ouă, cu un mediu acid.

Pentru a evalua calitatea rezultatelor determinării sensibilității micobacteriilor la medicamente, se recomandă controlul fiecărui lot nou de mediu Lowenstein-Jensen prin determinarea în paralel a sensibilității tulpinii standard de muzeu H37Rv. În plus, există anumite criterii microbiologice care trebuie îndeplinite pentru ca metodele să ofere un rezultat bine reproductibil și interpretat corect. Acestea includ viabilitatea culturii de micobacterii tuberculoase, regulile pentru obținerea unei suspensii și suspensii omogene, regulile pentru selectarea culturilor de micobacterii tuberculoase și reprezentativitatea masei bacteriene selectate. Fiabilitatea determinării rezistenței la medicamente scade odată cu o excreție bacteriană extrem de slabă.

Recent, metoda de determinare a sensibilității la medicamente folosind sisteme automate a fost recunoscută ca fiind promițătoare. Cele mai avansate în acest domeniu sunt dezvoltările bazate pe VASTEC MGIT-960. În acest caz, sensibilitatea la medicamente a micobacteriilor tuberculoase este determinată pe baza unei metode de proporții modificate. În timpul determinării, se compară rata de creștere a micobacteriilor tuberculoase în eprubeta de control și în eprubetele cu medicamente. Pentru a determina sensibilitatea la streptomicină, izoniazidă, rifampicină și etambutol, se utilizează aditivi de îmbogățire și antibiotice incluse în kitul SIRE. Pentru a determina sensibilitatea la pirazinamidă, se utilizează kitul PZA. În timpul testului, eprubetele cu medicamente sunt inoculate cu o suspensie de micobacterii tuberculoase, precum și eprubetele de control cu o diluție de 100 de ori a suspensiei pentru toate medicamentele, cu excepția pirazinamidei, unde diluția suspensiei este de 10 ori. Criteriul de stabilitate este indicatorul de creștere a micobacteriilor de 100 GU atunci când creșterea în eprubeta de control atinge 400 GU (vezi „Metode de cultură pentru izolarea micobacteriilor”). Rezultatele sunt înregistrate și interpretate automat și sunt setate de programul introdus sau selectat.

Concentrațiile finale din eprubeta cu mediu nutritiv lichid sunt utilizate ca și concentrații critice. În prezent, au fost dezvoltate concentrații critice atât pentru medicamentele de primă linie, cât și pentru unele medicamente de a doua linie. Trebuie menționat că determinarea sensibilității micobacteriilor tuberculoase la cicloserină și acid aminosalicilic se efectuează numai pe medii nutritive din ouă.

Un protocol detaliat de lucru cu sistemul descris permite testarea sensibilității la medicamente atât pe o cultură izolată (cu un mediu nutritiv dens), cât și utilizând creșterea primară a micobacteriilor într-o eprubetă MGIT. Ultima opțiune reduce semnificativ timpul necesar efectuării studiilor culturale, permițând obținerea rezultatelor complete asupra culturii de micobacterii tuberculoase (inclusiv informații privind sensibilitatea la medicamente) în termen de 3 săptămâni de la colectarea materialului, în timp ce metoda tradițională poate oferi acest lucru abia în a 3-a lună. Rezultatele obținute la timp, atunci când pacientul se află în faza intensivă a tratamentului, pot compensa costul relativ ridicat al studiilor.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Diferențierea micobacteriilor

Având în vedere că mediile nutritive utilizate nu sunt strict selective, diferențierea ulterioară a micobacteriilor izolate este considerată obligatorie. Necesitatea diferențierii micobacteriilor se datorează unei serii de caracteristici ale proceselor patologice cauzate de reprezentanții genului: evoluția și prognosticul diferit al tuberculozei și micobacteriozei, prezența rezistenței naturale la unele medicamente antituberculoase.

Se recunoaște că identificarea primară a micobacteriilor din complexul M. tuberculosis din micobacteriile non-tuberculoase se realizează în funcție de următoarele caracteristici: rata de creștere pe medii nutritive dense, formarea pigmenților, morfologia coloniilor, prezența rezistenței la acid și temperatura optimă pentru creștere.

Din păcate, nu există o singură metodă de laborator care să poată distinge în mod fiabil micobacteriile din complexul M. tuberculosis de alte micobacterii acido-rezistențe; cu toate acestea, o combinație a semnelor descrise mai sus cu rezultatele unui număr de teste biochimice prezentate mai jos permite identificarea micobacteriilor din complexul M. tuberculosis cu o probabilitate de până la 95%.

Pentru a diferenția micobacteriile din complexul M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii și altele) de micobacteriile non-tuberculoase cu creștere lentă, se utilizează teste biochimice de bază pentru a detecta prezența următoarelor semne:

• capacitatea de a produce acid nicotinic (testul cu niacină):
• activitatea nitrat-reductazei;
• catalază termostabilă;
• creștere pe un mediu cu salicilat de sodiu (1 mg/ml).

Ca test suplimentar, se pot utiliza și teste de creștere pe un mediu care conține 500 μg/ml acid para-nitrobenzoic sau 5% clorură de sodiu.

Multe laboratoare bacteriologice identifică aceste microorganisme doar la nivel complex, ceea ce se datorează capacităților limitate ale laboratoarelor și capacităților metodologice ale specialiștilor.

În majoritatea cazurilor, în practică, următoarele teste sunt suficiente pentru a diferenția M. tuberculosis și M. bovis: niacină, nitrat reductază, pirazinamidază și înregistrarea creșterii pe un mediu care conține 2 μg/ml hidrazidă de acid tiofen-2-carboxilic. Se ține cont de faptul că micobacteriile din complexul M. tuberculosis sunt caracterizate prin următorul set de caracteristici:

• creștere lentă (mai mult de 3 săptămâni);
• temperatura de creștere între 35-37 ^° C;
• absența pigmentării (culoare fildeș);
• colorație acid-rezistentă pronunțată;
• test pozitiv pentru niacină;
• test pozitiv pentru nitrat reductază;
• absența catalazei termostabile (68 ^o C).
• lipsa creșterii pe mediu Lowenstein-Jensen care conține:
  • 1000 µg/ml acid salicilic de sodiu,
  • 500 mcg/ml acid para-nitrobenzoic,
  • 5% clorură de sodiu:
• creștere în prezența a 1-5 μg/ml acid tiofen-2-carboxilic.

Relevanța diferențierii micobacteriilor izolate va crește semnificativ odată cu creșterea frecvenței înregistrării cazurilor de HIV/SIDA asociate cu tuberculoză sau micobacterioză. În prezent, nu există o certitudine absolută privind disponibilitatea laboratoarelor regionale practice de a efectua corect acest volum de muncă.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Diagnosticul imunologic al tuberculozei

Există o serie de fenomene universale, preparate și teste imunologice care au fost descoperite inițial în mod specific în tuberculoză sau în modelul răspunsului imun la micobacterii. Acestea includ BCG și tuberculina, fenomene precum DST cutanat (testele tuberculinice - reacțiile Pirquet și Mantoux), reacția la administrarea subcutanată a tuberculinei la animale sensibilizate (fenomenul Koch). Unii dintre primii anticorpi din bolile infecțioase au fost descoperiți și în tuberculoză. Desigur, cu cât înțelegerea mecanismelor imunității antituberculoase și a controlului lor genetic este mai profundă, cu atât utilizarea metodelor și preparatelor imunologice care afectează imunitatea poate fi mai largă pentru rezolvarea problemelor practice ale tiziologiei.

Cea mai importantă și complexă problemă practică în prezent este considerată a fi detectarea tuberculozei în procesul de screening în masă al populației. Cu toate acestea, în ciuda numeroaselor rapoarte despre „succese” (pe material limitat), nu există o metodă imunologică (reproductibilă „în orice mână”) sau un medicament adecvat acestor scopuri.

Metodele imunologice, în special studiile serologice (determinarea antigenelor, anticorpilor) și testele de provocare cu tuberculină, sunt utilizate pe scară largă în practica clinică.

Metodele serologice, care determină antigenele și anticorpii în diferite medii ale organismului, ocupă primul loc printre studiile imunologice utilizate în diagnosticul diferențial.

Specificitatea determinării anticorpilor împotriva micobacteriei tuberculosis depinde de antigenele utilizate în analiza imună. Au fost propuși un număr semnificativ de antigene, primul dintre acestea fiind tuberculina PPD:

• PPD și alte preparate complexe din fluid de cultură;
• dezintegrant cu ultrasunete;
• Extract de triton și alte preparate complexe pentru pereții celulari;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomanan;
• factor de cordon (trehaloză-6,6-di-micolat);
• glicolipide fenolice și alte glicolipide;
• lipopolisaharide;
• antigen care leagă fibronectina;
• proteine (cel mai adesea recombinante); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15,12 KDA etc.

Ca urmare a multor ani de cercetări efectuate de oamenii de știință ruși și străini, au fost identificate principalele modele de formare a anticorpilor și eficacitatea diagnosticului serologic al tuberculozei: cu cât antigenul este mai complex, cu atât sensibilitatea este mai mare și specificitatea testelor este mai mică. Specificitatea variază în diferite țări, în funcție de infecția populației cu M. tuberculosis și micobacterii non-tuberculoase, de vaccinarea BCG etc. La copii, informativitatea serodiagnosticului este mai mică decât la adulți. În tuberculoza primară (mai des la copii), determinarea IgM este mai informativă; în tuberculoza secundară - IgG. La persoanele infectate cu HIV, informativitatea serodiagnosticului în determinarea anticorpilor este redusă. Eficacitatea determinării anticorpilor depinde de o serie de „momente clinice”: activitatea procesului (prezența sau absența „izolării” micobacteriilor, prezența cavităților de degradare, gradul de infiltrare), prevalența procesului, durata cursului său.

Sensibilitatea metodei de testare imunoenzimatică (EIA) este de aproximativ 70%. Eficacitatea insuficientă a studiului se datorează specificității sale scăzute. Anterior, au fost luate în considerare posibilitățile de utilizare a screeningului serologic în grupurile cu risc crescut, în special în rândul persoanelor cu modificări post-tuberculoze la nivelul plămânilor.

Pentru creșterea specificității ELISA, se caută antigene mai specifice, inclusiv cele obținute prin inginerie genetică: ESAT-6 etc. (vezi mai sus). Utilizarea antigenelor strict specifice (38 kDa, ESAT) crește specificitatea, dar reduce semnificativ sensibilitatea analizei. Alături de ELISA (sisteme experimentale de testare de laborator, cum ar fi kitul Pathozyme ELISA), sunt oferite și kituri imunocromatografice cu filtrare laterală (Mycodot), precum și alte teste similare (analiza cu puncte membranare) cu evaluare vizuală a rezultatului testului. La efectuarea acestor teste, analiza durează 10-30 de minute; nu necesită echipament special, ci necesită evaluarea vizuală a rezultatelor, ceea ce este asociat cu o anumită subiectivitate. Aceste metode au aproximativ aceleași caracteristici de sensibilitate și specificitate (70% și, respectiv, 90-93%) ca și ELISA tradițională.

Utilizarea metodelor de analiză imună are o anumită valoare ca metodă suplimentară luată în considerare în complexul de metode utilizate în diagnosticul diferențial al tuberculozei, în special în diagnosticul formelor sale extrapulmonare. Metoda ELISA este cea mai eficientă în diagnosticul meningitei tuberculoase la examinarea lichidului cefalorahidian. În acest caz, sensibilitatea analizei este de 80-85%, iar specificitatea de 97-98%. Există informații despre eficacitatea determinării anticorpilor împotriva Mycobacterium tuberculosis în lichidul lacrimal în diagnosticul uveitei tuberculoase.

Inducerea sintezei interferonului gamma in vitro

Interferonul gamma (IFN-γ) este un factor de protecție imună specifică, realizat prin activarea sistemelor enzimatice ale macrofagelor. Inducerea sintezei IFN-γ de către limfocitele T sensibilizate este cauzată de interacțiunea acestora cu antigenele micobacteriene.

Atât PPD-ul tuberculinic, cât și antigenii specifici obținuți prin inginerie genetică sunt utilizați ca antigeni, în special antigenul ESAT-6 (antigen secretat timpuriu cu o greutate moleculară de 6 kDa) și CFP-10 (proteină din filtratul de cultură, 10 kDa). Antigenii modificați genetic sau recombinanți sunt absenți în celulele vaccinului BCG și ale altor micobacterii. Atunci când se utilizează tuberculina, rezultatele testului de inducție IFN-γ sunt comparabile cu rezultatele testului cutanat la tuberculină (corelație directă). Atunci când se utilizează antigeni modificați genetic, rezultatele testului sunt mai specifice și nu depind de vaccinarea BCG anterioară. La examinarea persoanelor vaccinate care nu au avut contact cu infecția cu tuberculoză, specificitatea testului este de 99%. Sensibilitatea testului la pacienții cu tuberculoză variază de la 81 la 89%.

Au fost dezvoltate teste și metode de diagnosticare bazate pe cultivarea pe termen scurt a celulelor sanguine integrale sau a celulelor mononucleare izolate din sânge cu antigene ale micobacteriilor tuberculoase in vitro, urmată de determinarea concentrației de IFN-γ sau de numărarea numărului de limfocite T care sintetizează IFN-γ. Concentrația de interferon sintetizat într-o eprubetă este determinată prin ELISA folosind anticorpi monoclonali care leagă IFN-γ. Apoi, folosind calibrarea standardului de IFN-γ, se determină concentrația acestuia în eprubetă sau în godeurile plăcii.

În testul Elispot, numărul de celule T care sintetizează IFN-γ este numărat pe suprafața unei plăci acoperite cu anticorpi împotriva IFN-γ.

Dezvoltatorii testului de inducție IFN-γ in vitro, aprobat de Administrația pentru Alimente și Medicamente din SUA, susțin că testul nu poate diferenția infecția tuberculoasă latentă de tuberculoza activă. Prin urmare, în regiunile cu o rată ridicată de infecție, testul nu are valoare diagnostică directă. Cu toate acestea, în țara noastră, acesta poate fi utilizat pentru a diferenția infecția tuberculoasă la copii de alergia postvaccinare, precum și pentru a evalua nivelul imunității specifice în timpul tratamentului.

În prezent, este în curs de studiu un sistem intern de testare pentru determinarea inducerii sintezei IFN-γ de către antigeni specifici ai tuberculozei in vitro.

Statusul imunitar și evoluția tuberculozei, imunocorecția

În timpul tratamentului tuberculozei, la oameni apar modificări ale antigenemiei și ale stării sistemului imunitar.

Datele privind modificările exudatelor și țesuturilor sunt în mare măsură contradictorii. Singurul lucru care poate fi observat pe deplin justificat este că granuloamele tuberculoase, de regulă, conțin un număr semnificativ de limfocite T activate.

Este logic să ne oprim asupra încă două puncte necesare pentru a înțelege rolul mecanismelor imunologice în tratamentul tuberculozei la om:

• Pacienții cu SIDA au o incidență deosebit de mare de a dezvolta rezistență multiplă la medicamente;
• În cazul rezistenței multiple la medicamente (și în absența infecției cu HIV), tulburările imune (în principal imunitatea celulelor T) sunt deosebit de semnificative.

În tuberculoză, se utilizează pe scară largă diverse metode de imunocorecție: în primul rând, acestea sunt medicamente care acționează în principal asupra imunității celulelor T și a sistemului fagocitar mononuclear (hormoni timus, izofon, licopid, polioxidoniu etc.), precum și micobacterii întregi (atenuate) și componentele acestora.

Diagnosticul biologic molecular al tuberculozei

Metodele de biologie moleculară în diagnosticul bolilor infecțioase includ în principal metode bazate pe manipularea materialelor genomice ale agenților patogeni bacterieni și virali pentru a identifica material genetic specific - secțiuni de ADN cu o secvență de nucleotide specifică unei anumite specii sau tulpini de agent patogen, pentru analizarea secvențelor specifice de ADN din gene care determină sensibilitatea agentului patogen la anumite medicamente, precum și pentru analizarea activității funcționale a anumitor gene ale agentului patogen. Metodele de biologie moleculară au devenit larg răspândite în cercetarea științifică și în aplicații practice în diagnosticul și monitorizarea diferitelor infecții bacteriene și virale după descoperirea reacției în lanț a polimerazei în 1985 de către Carrie Mullis (laureată a Premiului Nobel, 1989).

Principii și capacități ale metodei reacției în lanț a polimerazei

PCR permite amplificarea (multiplicarea) unei secvențe de nucleotide (un fragment de ADN patogen) într-o eprubetă în câteva ore de milioane de ori. Efectuarea reacției în prezența unor lanțuri individuale de ADN determină sensibilitatea excepțional de ridicată a analizei.

Secvența de nucleotide a anumitor secțiuni ale lanțului de ADN determină unicitatea genetică a microorganismului, ceea ce explică specificitatea ridicată a PCR.

Importanța acestei metode pentru detectarea și studiul caracteristicilor Mycobacterium tuberculosis se datorează caracteristicilor biologice ale microorganismului, care are o creștere foarte lentă: timpul de dublare a ADN-ului Mycobacterium tuberculosis în timpul cultivării lor este de 12-24 de ore.

Principiul metodei PCR este amplificarea - multiplicarea multiplă, de milioane de ori, a secțiunilor unei secvențe specifice de ADN într-un microvolum de eprubetă cu repetarea ciclică a următoarelor trei etape de reacție, fiecare dintre acestea având loc într-un regim de temperatură diferit:

• Etapa I - denaturarea ADN-ului bicatenar la încălzire cu divergența lanțurilor sale;
• Etapa II - legarea complementară (hibridizarea) primerilor (oligonucleotidelor de amorsare) cu secțiunile terminale ale lanțurilor unui fragment de ADN strict specific selectat pentru amplificare;
• Etapa a III-a – completarea lanțului fragmentelor de ADN folosind ADN polimerază termostabilă.

Pentru amplificare, eprubeta trebuie să conțină molecule de ADN matriceal. Patru tipuri de deoxinucleozide trifosfate (nucleotide) care conțin bazele azotate corespunzătoare: adenină (A), timină (T), guanină (G), citozină (C); oligonucleotide de amorsare sintetizate artificial (primeri) constând din 18-20 perechi de baze; o enzimă termostabilă, ADN polimerază, cu o temperatură optimă de 68-72 ^° C și ioni de magneziu.

Specificitatea PCR depinde de fragmentul de ADN ales. În conformitate cu aceasta, se sintetizează oligonucleotidele primerului flancant. Specificitatea hibridizării și a completării lanțului de ADN este determinată de principiul complementarității următoarelor perechi de baze azotate: adenină-timină, guanină-citozină.

Pentru determinarea genomului micobacteriilor din complexul tuberculos, cea mai eficientă țintă de amplificare în majoritatea sistemelor de testare este fragmentul de ADN IS6110, care în majoritatea tulpinilor de micobacterii tuberculose prezintă un număr semnificativ (10-20) de repetiții în genom, ceea ce asigură, alături de specificitate, o sensibilitate ridicată a analizei. Totodată, au fost descrise tulpini de micobacterii tuberculose cu un număr mic de repetiții sau absența fragmentului IS6110.

Extracția moleculelor de ADN dintr-o probă biologică

Pentru a efectua PCR, moleculele de ADN ale agentului patogen trebuie izolate din materialul biologic într-un volum minim, cu o cantitate minimă de ADN nespecific și diverși inhibitori ai enzimei - ADN polimeraza.

Pregătirea probelor trebuie efectuată în condiții care să prevină contaminarea încrucișată a probelor studiate cu molecule de ADN izolate. Aceasta necesită tratarea prealabilă a încăperii cu lumină ultravioletă, a podelelor și a suprafețelor de lucru ale meselor și dispozitivelor - cu soluții care conțin clor. De asemenea, este necesar să se utilizeze mănuși curate, eprubete de unică folosință și vârfuri pentru pipete automate.

Pentru a izola ADN-ul de Mycobacterium tuberculosis din probe clinice (lichid cefalorahidian, lavaj bronșic) care nu conțin un număr mare de leucocite, resturi celulare sau săruri, este suficient să centrifugați proba la 3-4 mii de rotații pe minut, să adăugați în sediment 20-30 µl de soluție 2% de Triton X-100 și să încălziți la 90 ^° C timp de 30 de minute.

Prepararea probei de spută necesită o lichefiere eficientă, utilizând de obicei hidroxid de sodiu 4% și N-acetil-L-cisteină (NALC) în concentrații de 50-80 mg per probă, în funcție de vâscozitatea probei. Soluția NALC trebuie preparată ex tempore sau pulberea NALC poate fi adăugată direct în probă, sub formă uscată. După lichefiere, probele trebuie centrifugate timp de 15 minute la 3.500-4.000 rpm (3.000 g) în tuburi cu capac filetat de 50 ml, adică în aceleași condiții recomandate pentru prepararea sputei înainte de cultură.

Pentru extragerea ADN-ului din sedimente, se utilizează cel mai adesea o metodă bazată pe utilizarea unei soluții 5-6 molare de izotiocianat de guanidină ca reactiv de liză și a unor particule microporoase de oxid de siliciu („pământ de diatomee”) care absorb moleculele de ADN. Substanțele nespecifice, inclusiv posibilii inhibitori, sunt apoi spălate într-o soluție 2,5 molară de izotiocianat de guanidină și o soluție de etanol, după care moleculele de ADN sunt desorbite în apă, iar aceste probe sunt utilizate pentru efectuarea PCR. Pentru a simplifica tehnologia de extracție a ADN-ului, „pământul de diatomee” este adesea înlocuit cu microparticule magnetice acoperite cu oxid de siliciu. În acest caz, în loc de centrifugare, se utilizează un suport magnetic special pentru microtuburi pentru precipitarea particulelor.

În Rusia a fost dezvoltată o metodă originală de separare imunomagnetică a micobacteriilor cu extracția ulterioară a ADN-ului agentului patogen. Pentru separarea imunomagnetică a micobacteriilor tuberculoase, se utilizează feroparticule cu dimensiunea de 3-5 μm, acoperite cu oxid de siliciu, de care sunt atașați anticorpi policlonali (de iepure) împotriva micobacteriilor tuberculoase prin intermediul unei legături chimice. Probele de spută după liza alcalină sunt neutralizate cu o soluție acidă de Tris-HCl și incubate cu un sorbent imunomagnetic. Apoi, imunoferoparticulele sunt colectate folosind o tijă magnetică cu vârf înlocuibil, transferate într-un microtub și precipitate. Se adaugă 20-30 μl de soluție 2% Triton X-100 și se încălzește timp de 30 de minute la 90 ^° C. Supernatantul este utilizat ca matrice de ADN pentru analiza PCR.

O problemă dificilă este extragerea ADN-ului micobacteriei tuberculoase din probele de biopsie. Pentru liza biopsiei, enzima proteinază K este utilizată la o concentrație finală de 200-500 mg/l la o temperatură de 56 ^° C peste noapte. Apoi, este extrasă folosind una dintre metodele cunoscute. Excesul de ADN nespecific în analiza PCR a probelor de biopsie provoacă adesea inhibarea reacției, ceea ce necesită extracții repetate ale ADN-ului.

Metode de detectare a rezultatelor

După finalizarea reacției, fragmentele amplificate de ADN al agentului patogen sunt identificate folosind diverse metode.

Metoda de electroforeză în gel este bine cunoscută. În acest caz, fragmentul de ADN obținut este identificat printr-un control pozitiv care conține fragmentul de ADN specific dorit sau printr-o dimensiune cunoscută anterior (numărul de perechi de nucleotide) a fragmentului, care este determinată folosind un marker molecular standard.

În prezența unui colorant specific - bromură de etidiu, care este inclusă în ADN-ul bicatenar, fragmentul de ADN sintetizat se dezvăluie ca o bandă care strălucește sub influența luminii ultraviolete.

Dimensiunea fragmentului de ADN, determinată prin electroforeză pe baza distanței parcurse de la început, trebuie să corespundă unui marker de greutate moleculară cunoscut sau unui control pozitiv.

Alte metode pentru determinarea rezultatelor PCR se bazează pe hibridizarea produselor PCR monocatenare cu un oligonucleotid complementar - o sondă ADN marcată cu biotină, urmată de detectare utilizând o reacție enzimatică, de exemplu, prin legarea unui conjugat streptavidină-fosfatază alcalină la biotină.

Pe baza acestui tip de detecție, au fost create analizoare PCR în care detectarea rezultatelor PCR se efectuează automat ca urmare a citirii densității optice din probe după ce a avut loc reacția enzimatică.

Dezavantajele acestor metode includ posibilitatea contaminării intralaborator cu fragmente destul de scurte de molecule de ADN. Când aceste molecule intră în probele nou testate, ele devin o matrice pentru PCR și duc la rezultate fals pozitive.

În acest sens, pentru a preveni rezultatele fals pozitive, sunt introduse reguli stricte pentru separarea și izolarea încăperilor: pentru extracția ADN-ului din probele biologice; încăperi pentru detectarea rezultatelor (electroforeză) din zona curată. Aceste încăperi reprezintă o zonă de probabilă contaminare. O altă zonă izolată este o cameră curată pentru introducerea probelor de ADN studiate în eprubete cu amestecul de reacție pentru PCR. Și, în final, se presupune că dispozitivul principal - amplificatorul ADN - ar trebui scos într-o încăpere separată, eventual de birou.

Pentru a preveni contaminarea cu produșii reacțiilor anterioare - ampliconi, unele sisteme de testare PCR conțin deoxinucleozid uridină în loc de deoxinucleozid timidină, care se construiește în poziția corespunzătoare în timpul sintezei lanțului in vitro, adică baza azotată timina prezentă în ADN-ul nativ este înlocuită cu uracil. ADN glicozilaza uracil adăugată în amestecul de reacție al materialului analizat distruge doar fragmentele contaminante cu deoxiuridină, dar nu și ADN-ul nativ analizat care conține deoxitimidină. Încălzirea ulterioară la 94 ^o C inactivează această enzimă și nu interferează cu amplificarea în PCR.

Există un sistem de testare bazat pe amplificarea izotermă a ARNr, pentru care se efectuează mai întâi transcripția inversă și sinteza moleculelor de ADN, care la rândul lor reprezintă matricea pentru sinteza ulterioară a moleculelor de ARN. Ampliconii ARN sunt detectați folosind o sondă de ADN colorată cu acridină în timpul hibridizării într-o soluție de reacție în eprubetă. Această metodă, pe lângă sensibilitatea ridicată, are avantajul efectuării analizei într-un singur eprubetă, ceea ce previne contaminarea. Potrivit autorilor, sensibilitatea acestei metode în probele respiratorii atinge 90%, cu o specificitate de 99-100%.

Noi metode de detectare sunt implementate în PCR în timp real. Aceste metode diferă în principal prin faptul că PCR și detectarea rezultatelor sale se efectuează simultan într-o singură eprubetă închisă. Acest lucru nu numai că simplifică din punct de vedere tehnologic metoda de analiză, dar previne și contaminarea spațiilor de laborator și a probelor cu produsele PCR anterioare.

În PCR în timp real, rezultatele sunt detectate prin fluorescența care rezultă din hibridizarea unei sonde de ADN fluorogene cu un fragment specific de ADN amplificat în timpul PCR. Structura sondelor de ADN fluorogene este construită astfel încât markerul fluorescent este eliberat ca urmare a unei reacții enzimatice sau se distanțează de molecula de stingere a fluorescenței doar la hibridizarea specifică cu molecula de ADN dorită amplificată în timpul PCR. Pe măsură ce numărul de molecule hibridizate cu sonda crește, creșterea fluorescenței până la un nivel detectabil este proporțională cu numărul de molecule ale produsului amplificat. Deoarece numărul de molecule ale fragmentului de ADN este dublat în timpul fiecărui ciclu PCR, numărul ciclului de la care este detectată fluorescența și crește este invers proporțional cu numărul de molecule de ADN din proba originală. Dacă mai multe concentrații diferite cunoscute de molecule ale fragmentului corespunzător de ADN al micobacteriei tuberculoase sunt introduse în reacție ca etalonator, atunci numărul de genomuri de ADN din materialul studiat poate fi calculat folosind un program de calculator.

Fiecare probă standard este duplicată. Criteriul cantitativ este numărul minim de cicluri PCR necesare pentru debutul și creșterea fluorescenței detectabile. Axa absciselor reprezintă numărul de cicluri; axa ordonatelor reprezintă valoarea fluorescenței. Concentrațiile de ADN sunt invers proporționale cu numărul de cicluri necesare pentru apariția fluorescenței. Ferestrele din coloana din dreapta (21-32) arată numerele ciclurilor pentru concentrațiile corespunzătoare. Diferențele dintre concentrațiile de 10 ori ale fragmentelor de ADN 10² ^- 10⁶ ^ml sunt de 3,2-3,4 cicluri. Pentru doi pacienți, concentrațiile fragmentelor IS6110 au fost de aproximativ 10³ ^/ ml și ^10⁴ /ml. Luând în considerare numărul de repetiții (6-20) ale fragmentelor analizate în genomul Mycobacterium tuberculosis, numărul de Mycobacterium tuberculosis din probele clinice este de aproximativ 100, respectiv 1000 de celule.

Aplicarea PCR în diagnosticul tuberculozei

Metoda PCR este utilizată în cea mai mare măsură pentru diagnosticarea rapidă a tuberculozei - detectarea Mycobacterium tuberculosis în probe clinice: spută, spălări bronșice, exudat pleural, urină, lichid cefalorahidian, puncții de osteoliză, aspirate ale tractului genital feminin și diverse biopsii. Într-un studiu realizat în Olanda, pe aproximativ 500 de probe de spută și spălări bronșice de la 340 de pacienți cu diagnostic confirmat de tuberculoză pulmonară, a fost studiată sensibilitatea comparativă a metodelor PCR, de cultură și de microscopie pe frotiu. Sensibilitatea analizei a fost de 92,6%, 88,9% și, respectiv, 52,4%. Specificitatea tuturor metodelor a fost de aproximativ 99%.

S-a efectuat o comparație a eficienței detectării Mycobacterium tuberculosis utilizând microscopia pe frotiu, semănarea pe mediu Lowenstein-Jensen, sistemul de testare VASTES și analiza PCR. PCR a demonstrat o sensibilitate de 74,4%, microscopia - 33,8%, semănarea pe mediu solid - 48,9% și VASTES - 55,8%. Timpul mediu de detectare pentru semănarea pe mediu Lowenstein-Jensen este de 24 de zile. VASTES - 13 zile, PCR - 1 zi.

De asemenea, este discutat potențialul utilizării PCR ca metodă sensibilă și rapidă pentru monitorizarea eficacității tratamentului pentru tuberculoză.

Detectarea ADN-ului Mycobacterium tuberculosis prin metoda PCR cu chimioterapie eficientă este determinată pe o perioadă mai lungă de timp - în medie 1,7 luni comparativ cu excreția bacteriană determinată prin microscopie fluorescentă și 2,5 luni comparativ cu examenul bacteriologic.

Diagnosticul formelor extrapulmonare de tuberculoză

Importanța PCR ca metodă sensibilă este deosebit de mare pentru formele extrapulmonare, deoarece tocmai în aceste forme metodele clinice și radiologice și metodele bacteriologice tradiționale pentru determinarea Mycobacterium tuberculosis în materialele de diagnostic sunt ineficiente.

La examinarea probelor de urină, rezultatele analizei PCR au fost pozitive la 16 din 17 pacienți cu tuberculoză activă a sistemului urinar și negative la 4 pacienți cu tuberculoză renală inactivă și 39 de pacienți cu boli non-tuberculoase ale sistemului urinar.

A fost demonstrată eficiența analizei PCR în studiul aspiratelor de măduvă osoasă la pacienții cu febră de origine necunoscută și cu suspiciune de natură tuberculoasă a bolii. Pentru diagnosticul limfadenitei tuberculoase la copii, au fost studiate 102 aspirate de puncție și probe bioptice de la 67 de copii cu suspiciune de limfadenită tuberculoasă. Au fost obținute rezultate pozitive: prin PCR în timp real - 71,6%, microscopie cu fluorescență - 46,3%, studiu de cultură - 41,8%. În studiul a 50 de biopsii de ganglioni limfatici la pacienți cu boala zgârieturii de pisică, toate rezultatele au fost negative. Astfel, a fost demonstrată o specificitate de 100% a analizei PCR. În aceeași lucrare, a fost demonstrată posibilitatea detectării M. avium în biopsia puncțională a ganglionilor limfatici.

Diagnosticul tuberculozei genitale feminine în caz de infertilitate este cunoscut ca fiind una dintre cele mai dificile probleme de diagnostic. Rezultate pozitive au fost obținute în studiile PCR ale biopsiilor endometriale, aspiratelor endometriale și probelor de lichid Douglas la 14 (56%) din 25 de paciente examinate laparoscopic cu suspiciune de tuberculoză. Microscopia cu frotiu și studiile de cultură au produs 1, respectiv 2 rezultate pozitive. Aceste cazuri au fost, de asemenea, PCR-pozitive. Majoritatea rezultatelor PCR-pozitive au fost în cazuri cu caracteristici ale tuberculozei conform examenului histologic; un număr mai mic a fost în cazuri cu suspiciune de tuberculoză conform laparoscopiei. Doar un rezultat PCR pozitiv a fost obținut în absența datelor laparoscopice pentru tuberculoză.

Atunci când se diagnostichează formele extrapulmonare de tuberculoză, medicii se întreabă adesea cu privire la posibilitatea identificării agentului patogen atunci când examinează probele de sânge folosind metoda PCR. Datele din literatura de specialitate indică faptul că detectarea ADN-ului Mycobacterium tuberculosis din probele de sânge este posibilă în formele avansate de infecție cu HIV. ADN-ul Mycobacterium tuberculosis a fost detectat doar în tuberculoza generalizată a diferitelor organe la pacienții cu transplant renal și imunosupresie.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Identificarea speciilor de micobacterii

Metoda PCR poate fi destul de eficientă pentru identificarea rapidă a micobacteriilor din complexul tuberculos și a unor tipuri de micobacterii non-tuberculoase după obținerea creșterii lor primare. În acest caz, utilizarea PCR poate economisi 7-10 zile necesare pentru identificarea culturală ulterioară a unui rezultat pozitiv. Studiul PCR este foarte simplu din punct de vedere tehnic, deoarece nu necesită o pregătire complexă a probelor de material clinic pentru a obține o sensibilitate ridicată. La examinarea a 80 de culturi pozitive într-un astfel de sistem de testare (MB BacT. de la Organon), toate rezultatele analizelor PCR pozitive au fost strict specifice și au fost efectuate în decurs de 1 zi. Pentru a identifica alte tipuri de micobacterii atunci când sunt obținute în cultură, ADN-ul agentului patogen este hibridizat cu sonde ADN specifice marcate cu acridină, iar tulpinile sunt detectate prin apariția chemiluminescenței folosind un chemiluminometru sau pe benzi de nitroceluloză cu evaluare vizuală după hibridizare. Acest kit identifică un număr limitat de specii: complexul Mycobacterium tuberculosis, M. avium, complexul M. avium, M. kansasii și M. gordonae.

A. Telenti și colab. au dezvoltat, de asemenea, o metodă relativ simplă și ieftină pentru identificarea speciilor de micobacterii importante clinic, bazată pe PCR și tratarea ulterioară cu două enzime de restricție (enzime care au capacitatea de a tăia o moleculă de ADN în puncte specifice). În acest caz, se amplifica un fragment de ADN care codifică o proteină de șoc termic (65 kDa), după care fragmentul de ADN obținut prin PCR, cu o dimensiune de 439 de perechi de nucleotide, este tratat separat cu două enzime - Bste II și Нае III. Apoi, utilizând electroforeza pe gel de agaroză, se analizează cele două produse obținute, determinându-se dimensiunile acestora (numărul de perechi de nucleotide) folosind un set de fragmente standard de ADN (markeri moleculari de ADN) cu o lungime de la 100 la 1000 de perechi de nucleotide. La fiecare dintre speciile definite (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) se găsesc 2 sau 3 fragmente de ADN de dimensiuni diferite pentru fiecare enzimă de restricție. Combinarea fragmentelor de ADN rezultate de diferite dimensiuni permite diferențierea acestor specii unele de altele.

Se dezvoltă o tehnologie pentru micromatrici de ADN biologic, care va ajuta la identificarea a peste 100 de specii de micobacterii într-un singur studiu.

Identificarea speciilor poate fi efectuată și prin amplificarea PCR a regiunii variabile a ARNr 16S, urmată de secvențierea ampliconilor în comparație cu structura primară corespunzătoare, ceea ce permite identificarea a peste 40 de specii de micobacterii.

PCR poate fi utilizat și pentru identificarea speciilor din complexul tuberculosis mycobacterium, inclusiv diferențierea între M. bovis și M. bovis BCG. Acest lucru se realizează prin analizarea prezenței sau absenței anumitor gene în regiunile genomice RD1, RD9 și RD10. RD1 este absent în M. bovis BCG, dar este prezent la speciile virulente, inclusiv M. bovis.

Determinarea sensibilității la medicamente a Mycobacterium tuberculosis utilizând PCR

Sarcinile metodelor genetice moleculare pentru determinarea sensibilității sau rezistenței la medicamente a Mycobacterium tuberculosis se reduc la identificarea mutațiilor în anumite secvențe de nucleotide ale genelor cunoscute. Principalele metode se bazează fie pe citirea directă (secvențierea) acestor secvențe după amplificare, fie pe hibridizarea fragmentelor de ADN marcate cu biotină, amplificate în timpul PCR cu sonde ADN. Ambele opțiuni implică identificarea substituțiilor în secvențele de nucleotide care, atunci când se utilizează sonde ADN, duc la absența sau hibridizarea incompletă pe o membrană de nitroceluloză folosind un conjugat enzimatic (streptavidin-fosfatază alcalină) - metoda LIPA-Rif-TB.

Metoda de măsurare a fluorescenței în sondele de ADN fixate local pe microregiuni complementare mutațiilor cunoscute din regiunile genetice amplificate prin PCR, responsabile de sensibilitatea sau rezistența la medicamente, se numește metoda microbiocipurilor. Algoritmul de bază pentru efectuarea acestui studiu este următorul. După izolarea ADN-ului dintr-o probă clinică sau o cultură micobacteriană, trebuie efectuată PCR pentru a amplifica fragmentele corespunzătoare ale genei groB, responsabilă de sensibilitatea la rifampicină, sau genele katG și inhA care codifică proteinele micobacteriene responsabile de sensibilitatea la izoniazidă. Rezultatele PCR sunt evaluate utilizând electroforeza pe gel de agaroză, care confirmă primirea fragmentelor de ADN corespunzătoare de lungimea dorită. Apoi, se efectuează o a doua rundă de PCR pentru a introduce un marker fluorescent în ADN. Rezultatele PCR sunt din nou confirmate prin electroforeză pe gel. După aceasta, se efectuează hibridizarea (incubare peste noapte) cu spălare ulterioară a materialului obținut pe un biocip, care este un număr mare de lanțuri scurte de ADN (sonde) fixate pe o placă mică de sticlă, complementare secvențelor nucleotidice ale tipului sensibil la medicamente de micobacterii tuberculoase în punctele posibilelor mutații, precum și secvențelor mutante responsabile de rezistența la medicamente. Locația sondelor de ADN pe placă este strict definită și se stabilește nivelul de fluorescență observat în timpul hibridizării pentru determinarea rezultatului folosind un dispozitiv special de citire. În acest sens, rezultatele analizei sunt determinate folosind un program special de calculator.

În ultimii ani, au fost dezvoltate metode alternative pentru determinarea sensibilității la medicamente a Mycobacterium tuberculosis, bazate pe tehnologia PCR în timp real, permițând efectuarea acestor studii în eprubetă închisă.

Figura 13-13 prezintă rezultatul analizei culturilor clinice de Mycobacterium tuberculosis în determinarea rezistenței medicamentoase la rifampicină utilizând PCR în timp real: 218 - probă de control (sensibilă la rifampicină); 93 - control pozitiv pentru mutația Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - control pozitiv pentru mutația Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - probe experimentale. Rezultatul calculării curbelor cinetice de amplificare pentru 4 canale: canalul 1: 393 - control pozitiv pentru mutația Ser-Trp TCG-TGG; canalul 2: 4482 - control pozitiv pentru mutația Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - probe experimentale; canalul 4: curbe cinetice de amplificare pentru toate probele participante la experiment. Control pozitiv al reacției de amplificare. Concluzii: Analiza a relevat următoarele mutații care determină rezistența la rifampicină: în probele 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Același principiu a fost utilizat pentru a determina rezistența la izoniazidă prin genele katG și inhA, care determină cele mai frecvente mutații.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Identificarea tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis

Cea mai studiată metodă de identificare a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis este o tehnologie numită polimorfism al lungimii fragmentelor de restricție (RFLP) și care se bazează pe fragmentarea (restricția) ADN-ului Mycobacterium tuberculosis de către enzima Pvu II și hibridizarea ulterioară a fragmentelor obținute cu anumite secvențe specifice pe ADN-ul elementului său repetitiv IS6110. Variabilitatea intraspecifică se realizează datorită numărului diferit de repetiții IS6110 și a localizării acestora pe ADN, precum și a diversității distanțelor dintre anumite puncte de atac ale enzimei de restricție (situsuri de restricție) și elementul IS6110. Această tehnologie este foarte complexă și necesită multă muncă. După tratarea ADN-ului izolat din cultura de micobacterii tuberculosis cu enzimă de restricție, se efectuează electroforeză pe gel, apoi fragmente de ADN de diferite lungimi sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză, hibridizate cu fragmente ale elementului IS6110, iar rezultatele sunt detectate folosind o reacție enzimatică. Modelul specific de benzi rezultat caracterizează ADN-ul unei tulpini specifice de micobacterie tuberculosis. Analiza computerizată relevă identitatea sau relația tulpinilor. În ciuda faptului că metoda RFLP este cea mai discriminatorie, adică relevă cel mai mare număr de diferențe în tulpinile analizate, aceasta este ineficientă cu un număr mic (mai puțin de 5) de repetiții IS6110, observate la unele tulpini. Figurile 13-14 prezintă rezultatele tipizării RFLP a tulpinilor.

O alternativă ar putea fi metoda de spoligotipare - analiza polimorfismului secvențelor de ADN spacer - intermediare între repetițiile directe ale regiunii DR. Atunci când se efectuează spoligotiparea tulpinilor, PCR se efectuează cu primeri care limitează regiunea DR, după care se formează fragmente de lungimi diferite, care hibridizează cu regiuni intermediare variabile de ADN. Analiza secvențelor spacer ale regiunii DR pare, potrivit cercetătorilor, mai simplă, mai productivă și mai potrivită pentru screening-ul primar al tulpinilor și analiza epidemiologică preliminară, precum și pentru studierea directă a materialului clinic.

Evident, o metodă mai eficientă și mai accesibilă din punct de vedere tehnologic este VNTR (prescurtare a cuvintelor englezești), sau metoda de determinare a numărului variabil de repetiții în tandem exacte în ADN-ul Mycobacterium tuberculosis. Această metodă se bazează doar pe utilizarea PCR și nu necesită manipulări suplimentare. Deoarece numărul de repetiții în tandem în diferite tulpini și în diferite loci este diferit, fragmente de diferite dimensiuni sunt determinate și analizate pe electroforegrama rezultată a produselor PCR. Potrivit cercetătorilor, cu ajutorul VNTR, se obține un grad mai mare de discriminare a tulpinilor decât cu metoda RFLP.

În ultimii ani s-a acordat multă atenție răspândirii tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis din familia W-Beijing (numită uneori tulpina Beijing), care sunt în mare parte rezistente la medicamente.

Cerințe de bază pentru calitatea cercetării în biologie moleculară

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Principalele documente de reglementare pentru efectuarea PCR

Ordinele Ministerului Sănătății al Federației Ruse: Nr. 45 din 7.02.2000; Nr. 109 din 21.03.2003; Nr. 64 din 21.02.2000. Instrucțiuni: 1.3.1888-04 „Organizarea muncii în timpul cercetării PCR a materialului infectat cu agenți biologici patogeni din grupele de patogenitate III-IV”; 1.3.1794-03 „Organizarea muncii în timpul cercetării PCR a materialului infectat cu microorganisme din grupele de patogenitate I-II”. 2003; 3.5.5.1034-01 „Dezinfecția materialului de testare infectat cu bacterii din grupele de patogenitate I-IV atunci când se lucrează cu metoda PCR”, 2001. Anexa 11 la Instrucțiunile privind metodele unificate de cercetare microbiologică în detectarea, diagnosticarea și tratamentul tuberculozei.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personal

Studiile de biologie moleculară pot fi efectuate de medici specialiști în diagnostic clinic, bacteriologi, virologi, biologi de laborator de diagnostic clinic, precum și de specialiști cu studii medicale secundare care au urmat specializarea și pregătirea avansată în modul stabilit.

Amenajarea spațiilor de laborator

Sunt necesare următoarele facilități de laborator:

• Zona de procesare a probelor - un laborator adaptat pentru lucrul cu agenți infecțioși din grupele de patogenitate III-IV, în conformitate cu Ghidul Metodologic 13.1888-04.
• Zona pentru prepararea amestecurilor de reacție PCR este o încăpere de laborator care oferă protecție împotriva contaminării interne a laboratorului - o zonă „curată”.
• • Dacă se utilizează electroforeza sau hibridizarea pentru analiza produselor PCR, încăperea de laborator în care fragmentele de ADN amplificate sunt extrase din tubul de amplificare și, în consecință, pot ieși în mediul înconjurător, în conformitate cu cerințele pentru laboratoarele PCR (Orientări metodologice 1.3.1794-03, Orientări metodologice 1.3.1888-04) trebuie complet izolată de încăperile specificate în paragrafele anterioare. Deplasarea oricărui personal, echipamente, orice materiale și obiecte din zona de electroforeză în zona de procesare a probelor și în zona „curată”, precum și transferul de aer prin sistemul de ventilație sau ca urmare a curenților de aer, trebuie excluse. Această zonă nu este necesară pentru detectarea fluorimetrică a produselor PCR.
• Sala de documentare și procesare a rezultatelor este dotată cu calculatoare și echipamentele de birou necesare. Această cameră poate conține echipamente care asigură detectarea produselor PCR fără deschiderea tubului. - detectoare PCR fluorescente și termociclatoare pentru PCR în timp real.

Cerințele sanitare și epidemiologice pentru prelucrarea primară a sputei sunt similare cu cerințele microbiologice standard pentru lucrul cu Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Set complet de echipamente de laborator pentru diagnostic PCR

Trusa de laborator include echipamente pentru următoarele încăperi.

• Camera de preparare a probelor conține următoarele echipamente: hotă cu flux laminar de clasa de protecție II „SP-1.2”: termostat în stare solidă cu capac încălzit pentru eprubete Eppendorf; microcentrifugă la 13.000 rpm; centrifugă („Vortex”); frigider cu interval de temperatură de la -20 ^° C la +10 ^° C; pipete cu volum variabil din seria „Proline”; pompă cu balon de separare OM-1; suport pentru pipete; suport pentru stație de lucru 200x0,5 ml; suport pentru stație de lucru 50x1,5 ml; suporturi pentru depozitarea eprubetelor 80x1,5 ml;
• cameră de preparare a amestecului de reacție: cameră de protecție cutie PCR („Laminar-C. 110 cm); centrifugă „Vortex”; pipete cu volum variabil din seria „Proline”; suport pentru pipete; suport pentru stație de lucru 200x0,2 ml; suporturi pentru depozitarea eprubetelor 80x1,5 ml; frigider cu interval de temperatură de la -20 ^° C la +10 ^° C;
• Cameră de electroforeză: cameră de electroforeză orizontală; sursă de alimentare; transiluminator;
• Amplificator ADN sau analizor de acid nucleic (PCR în timp real) cu computer și software; poate fi amplasat în orice cameră disponibilă. Dacă se utilizează tehnologia PCR în timp real, nu este necesară o cameră de electroforeză.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Controlul extern al calității

Pentru a se asigura că obțin rezultate obiectiv fiabile, laboratoarele trebuie să participe la un sistem de evaluare externă a calității cercetării de laborator.

Participanții la sistemul de control al calității primesc: 12 fiole cu suspensii liofilizate de celule bacteriene, dintre care două conțin E. coli, 3 fiole cu micobacterii tuberculoase (tulpină avirulentă) la o concentrație de 10² ^/ ml; 3 fiole cu celule dintr-o tulpină similară la o concentrație de 10⁴ ^/ ml; 2 fiole fiecare cu micobacterii non-tuberculoase M. avium-intracellulare și M. kansasii la o concentrație de 10⁵ ^/ ml.

Testele trimise pentru evaluarea externă a calității sunt pre-testate în două laboratoare independente cu o vastă experiență în acest domeniu.

[ 85 ], [ 86 ]