Diagnosticul clinic al tuberculozei

Tuberculoza este o boală ușor de diagnosticat în condițiile moderne și în realizările științifice. Diagnosticul clinic al tuberculozei este esențial pentru alte metode de diagnostic, în al doilea rând numai la metodele de cercetare cu raze X.

[1], [2], [3], [4],

Test de sânge clinic

La pacienții cu tuberculoză, schimbările în analiza generală a sângelui nu sunt patognomonice. Cu forme limitate și inactive ale tuberculozei hypochromia caracteristice de eritrocite în cantitatea lor normală. Când infiltrate masive sau pneumonie cazeoasă, în timp ce prevalența limfadenita cazeoasă, leziuni intestinale specifice, precum și pentru pulmonare mari sau sângerări postoperatorii și note erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Macrocitoza, în special poikilotsitoz, se întâlnesc mult mai rar, de obicei cu anemie severă. Numărul de reticulocite la etapa a tuberculozei compensate variază de la 0,1 la 0,6%, cu subcompensat - 0.6-1.0% și 1%, se caracterizează prin reticulocite decompensată.

Când tuberculoza, în unele cazuri, poate exista o leucocitoza moderată (de până la 15 mii de leucocite.), Mai puține radiații, care apar la 2-7% dintre pacienții cu forme care apar procese limitate și ușor și la 12,5% - de tuberculoză pulmonară distructive și progresivă .

Cele mai frecvente schimbări apar în formula leucocitelor. Marcați atât neutrofilia relativă, cât și cea absolută, o schimbare moderată a formulei leucocitelor spre stânga înainte de promileocite. Mielocitele sunt foarte rare în cazul tuberculozei necomplicate. Creșterea numărului de neutrofile cu boabe anormale la pacienții cu TB haemogram indică întotdeauna durata procesului: la pacienții cu tuberculoză severă, aproape toate neutrofilelor contin cereale anormale. Când se declanșează focarul tuberculozei, trecerea nucleară se apropie rapid rapid de normal. Granularitatea patologică a neutrofilelor persistă de obicei mai mult decât alte modificări ale hemogramei.

Conținutul de eozinofile din sângele periferic variază de asemenea în funcție de faza procesului și starea alergică a organismului. Numărul lor scade până la aneozinofiliya în focar prelungită și severă a bolii și, invers, crește pe măsură ce infiltratelor resorbție și revărsat pleural, precum și formele timpurii ale tuberculozei primare.

Majoritatea formelor de tuberculoză primară sunt însoțite de limfopenie, care se observă uneori de mai mulți ani, chiar și după cicatrizarea modificărilor specifice. Tuberculoza secundară în faza de exacerbare, în funcție de severitatea procesului, poate fi însoțită fie de un număr normal de limfocite, fie de limfopenie.

Ea ocupă un loc special determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor Teste suplimentare pentru a evalua procesul de tuberculoasă (RES), având o valoare în evaluarea procesului de tuberculoză flux și identificarea formelor sale active. Creșterea VSH indică prezența procesului patologic (infecțios-inflamator, septic supurativa, hemoblastosis, Hodgkin și colab.) Și indică gravitatea, dar nivelurile normale nu ESR întotdeauna indică absența patologiei. Accelerarea sedimentării eritrocitare este facilitată de creșterea conținutului globulinelor, fibrinogenului, colesterolului din sânge și scăderii vâscozității sângelui. Scăderea sedimentării eritrocitare este caracteristică stărilor însoțite de hemoconcentrație, o creștere a conținutului albuminelor și a acizilor biliari.

Hemograma la pacienții cu tuberculoză se modifică în timpul tratamentului. Deplasările hematologice dispar cu cât mai repede, cu cât intervenția terapeutică este mai reușită. Cu toate acestea, trebuie avut în vedere efectul asupra hemopoiezei diferitelor medicamente antibacteriene. Acestea produc adesea eozinofilie, în unele cazuri - leucocitoză și, de cele mai multe ori, leucopenie până la agranulocitoză și reacție limfoid-reticulară. Controlul sistematic hematologic și analiza corectă a datelor obținute sunt esențiale pentru evaluarea stării clinice a pacientului, a dinamicii procesului și a eficacității tratamentului utilizat.

[5], [6], [7], [8], [9],

Analiza clinică a urinei

Cu tuberculoza sistemului urinar, analiza urinei este principala metodă de diagnosticare a laboratorului. Puteți observa leucocitriu, eritrociturie, proteinurie, hipoisosterenurie, tuberculoză mycobacterium, bacteriurie nespecifică.

Leucocitria este cel mai frecvent simptom al tuberculozei sistemului urinar înainte de efectuarea chimioterapiei specifice și este absentă numai în cazuri excepționale, de exemplu, cu o eliminare completă a lumenului ureteral. Testul Nechyporenko (determinarea numărului de leucocite în 1 ml de urină) ajută să evalueze mai obiectiv nefrotuberkuloze grad leucocituriei cu, și, în unele cazuri, să-l identifice la urinalysis normal. Cu toate acestea, trebuie luat în considerare faptul că leucocitria poate fi cu pielonefrită acută și cronică, cistită, uretră, pietre la rinichi și uretere.

Eritrotsiturii. Precum și leucocitare. Sunt considerate unul dintre cele mai frecvente semne de laborator de tuberculoză a sistemului genito-urinar. Frecvența hematuriei depinde de prevalența procesului, crește pe măsura dezvoltării procesului distructiv de tuberculoză în rinichi. Erythrocyturia fără leucocitrie este mai tipică pentru stadiile incipiente ale tuberculozei rinichilor. Hematuria, care predomină asupra leucocitriilor, este un argument important în favoarea tuberculozei rinichilor în diferențierea sa cu pielonefrita nespecifică.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Test de sânge biochimic

Cu tuberculoză, schimbările în parametrii biochimici depind în primul rând de faza procesului, complicații și diverse boli concomitente. La pacienții cu tuberculoză inactivă a plămânilor și a altor organe, fracțiile totale de proteine și proteine din serul de sânge sunt neschimbate și determină conținutul lor normal.

În formele acute ale bolii, precum și cu exacerbarea și progresia formelor cronice de tuberculoză, coeficientul de albumină-globulină scade.

Esențial în evaluarea stării funcționale a daunelor organice și a ficatului în tuberculoză și complicațiile sale este determinarea seric total și a bilirubinei directe, AST (ACT), alanin aminotransferază (ALT). Determinarea dinamică a nivelului de aminotransferaze. Bilirubinei în tratamentul pacienților bolnavi de tuberculoză, în special în formele severe, - o componentă obligatorie a examenului biochimic al pacienților cu tuberculoză și se desfășoară pe o bază lunară.

Evaluarea stării funcționale a rinichilor include determinarea creatininei serice și calcularea ratei de filtrare glomerulară în conformitate cu formula Cockcroft-Gault. Calcularea ratei de filtrare glomerulară utilizând proba lui Reberg oferă rezultate mai puțin precise.

Scopul principal al studiilor biochimice dinamice ale pacienților cu tuberculoză este de a monitoriza evoluția procesului, detectarea în timp util a efectului secundar al medicamentelor și corectarea adecvată a tulburărilor homeostatice care apar.

[17], [18], [19]

Aplicarea metodelor biochimice de investigare în tuberculoza extrapulmonară

Indicatorul cel mai informativ este conținutul de acid tuberculostearic în fluide biologice, însă definiția acestuia este asociată cu dificultăți tehnice (necesitatea cromatografiei de gaz și a spectrometriei de masă).

Evaluarea prospectivă a activității adenozin deaminazei - o enzimă determinată în lichide: sinovial, pericardic, ascitic sau spinal. Principalii producători de adenozin deaminază sunt limfocitele și monocitele. Determinarea activității adenozin deaminazei în fluidele biologice facilitează diagnosticarea sinovitismului tuberculozei, tuberculozei ganglionilor limfatici, meningitei tuberculozei, serozitei tuberculozei.

Unii indicatori biochimici datorită nespecificității lor sunt determinați numai în fluide biologice, aproape de focalizarea leziunii. Măsurați nivelul indicatorilor ca răspuns la injectarea subcutanată sau intradermică a tuberculinei (de obicei înainte și 48 de ore și după 72 de ore). După aceasta, gradul de creștere a nivelului markerului (în%) se calculează în raport cu nivelul inițial.

Determinarea optimă în urină a activității unei enzime specifice de organ transamnidază, a cărei apariție este observată atunci când rinichii de natură diferită sunt afectați. Studiul transaminazei este justificat numai în condițiile administrării subcutanate a tuberculinei pentru a exacerba procesul inflamator local. Determinați activitatea transaminidinei în urină inițial și 24-72 de ore după introducerea tuberculinei de 50 TE. Extinderea fermentiei în 2 ori și mai mult permite în 82% din cazuri diferențierea tuberculozei active a rinichilor de exacerbarea pielonefritei cronice.

În cazul tuberculozei organelor genitale feminine, concentrațiile de haptoglobină și dialdehida malonică din sânge sunt determinate în condițiile unui test de tuberculină provocator. Tuberculina injectată subcutanat într-o doză de 50 TE și 72 de ore mai târziu a efectuat un al doilea studiu biochimic. În cazul etiologiei tuberculozei, gradul de creștere a nivelului de haptoglobină nu este mai mic de 28%, iar nivelul malondialdehidei este de 39% sau mai mult. Se utilizează, de asemenea, determinarea activității adenozin deaminazei într-un fluid peritoneal obținut din spațiul Douglas. Punctul este reexaminat 72 de ore după injectarea intradermică a tuberculinei la doze de 0,1 TE și 0,01 TE în proiecția organelor genitale interne pe peretele abdominal anterior. În favoarea procesului de tuberculoză, o creștere a activității adenozin deaminazei este de 10% sau mai mult în comparație cu cea inițială.

Când ochiul este afectat, se examinează reacția focală care apare în ochi ca răspuns la stimularea antigenică. Nu este de dorit să se dezvolte un răspuns pronunțat, însoțit de o scădere a funcțiilor vizuale. Întrucât evaluarea reacțiilor focale minime este adesea dificilă, pentru obiectivizarea concluziei se recomandă orientarea în paralel și gradul de creștere a serului de sânge de haptoglobină sau adenozin deaminază.

Toate studiile biochimice trebuie efectuate împreună cu alte metode.

[20], [21], [22], [23],

Cercetarea sistemului de coagulare a sângelui

Relevanța stării de cercetare a sistemului de coagulare a sângelui de TBC este cauzată de prezența unui număr de pacienți cu hemoptizie tuberculoză pulmonară sau hemoragie pulmonară, precum și complicațiile hemocoagulation în tratamentul chirurgical al tuberculozei. În plus, TB legate în mod natural în stare latentă care curge hemocoagulation intravasculară influențează cursul bolii și eficacitatea chimioterapiei.

La pacienții cu prevalenta TB pulmonara a componentei inflamatie exudativa a declinului observate în activitatea anticoagulantă de sânge. La pacienții cu o prevalență scăzută a unei leziuni specifice în plămâni, cu o predominanță a hemocoagulation productive componenta inflamatorie intravascular exprimată ușor. La pacienții cu tuberculoză pulmonară cu hemoptizie și sistemul pulmonar de coagulare a sângelui de stat hemoragie este diferită: la pacienții cu pierderi mici de sânge la gemoptoe înălțime sau imediat după terminarea ei există o creștere bruscă a capacității de coagulare a sângelui, datorită intensificării severă a trombinoobrazovaniya menținând în același timp a crescut „structurale“ de coagulare. La pacienții cu pierderi masive de sânge observată potențial de coagulare scădere în detrimentul scăderea concentrației de fibrinogen. Activitatea factorului XIII, numărul de trombocite. La etapa tratamentului chirurgical la pacienții cu forme limitate de tuberculoză pulmonară cu încălcări semnificative apare sistemul homeostaziei. Pacienții cu proces pe scară largă în executarea pnevmon- sau plevropnevmonektomii dezvolta frecvent DIC, care poate lua forma de „a doua boala.“

Pentru a monitoriza starea de coagulare a sângelui la pacienții cu tuberculoză pulmonară trebuie efectuată determinarea timpului de tromboplastină parțial activată (aPTT), fibrinogen, timpul de trombină, indicele de protrombină și timpul de sângerare și timpul de coagulare.

[24], [25], [26], [27], [28]

Cercetarea hormonală

Observații experimentale și clinice recente indică prezența unor modificări ale stării hormonale într-o pneumonie tuberculoasă specifică. Este dovedit faptul că corectarea disfuncției sistemelor-hipofizo suprarenal, hipofizo tiroidieni si functiei pancreatice, în asociere cu terapia anti-TB contribuie la activarea fibrogenesis și reparații la o inflamație specifică locus.

Starea funcțională a sistemului hipofizo tiroidian este evaluată prin conținutul în serul sanguin al triiodotironina (T ₃ ), tiroxina (T ₄ ), pituitară hormon stimulator tiroidian (TSH). Sa constatat că hipotiroidism subclinic este detectat la 38-45% dintre pacienții cu tuberculoză pulmonară, și cel mai adesea este diagnosticat cu procesul de formulare și diseminată fibro cavernos. În aceste aceleași forme cele mai reduse dramatic nivelurile de ambele T ₃ și T ₄, și vine un dezechilibru al acestor hormoni sub forma creșterea raportului T ₄ / T _s.

Funcția corticosuprarenaliene este evaluată prin nivelul de cortizol din serul sanguin și funcția endocrină a pancreasului - concentrația insulinei imuno-reactive. În faza acută a bolii infecțioase, necesitatea cortizolului endogen și a insulinei crește. Hiperinsulinemia evidențiază, de asemenea, rezistența la insulină a țesuturilor corporale, care este tipică pentru orice proces inflamator activ, în special specific. Determinarea funcției glyukokortiko-idnoy adrenal cu tuberculoză pulmonară activă relevă prezența Cushing la majoritatea pacienților. Niveluri normale de concentrație sanguină cortizol la pacientul cu inflamație infecțioasă în perioada acută trebuie considerată ca eșec relativă a funcției glucocorticoizi a cortexului suprarenal care poate servi ca bază pentru dozele de terapie de substituție adecvată a glucocorticoizilor.

Aproape o treime din pacienții cu tuberculoză pulmonară pot stabili că nivelul de insulină din ele este destul de scăzut și se apropie de limita inferioară a normei, în timp ce 13-20% observă hiperinsulinism semnificativ. Ambele hipo- și hiperinsulinism relativ sunt factori de risc înalt pentru dezvoltarea încălcărilor metabolismului carbohidraților în grade diferite. Aceste schimbări în activitatea funcțională a celulelor B ale pancreasului necesită monitorizarea regulată a glicemiei la pacienții cu tuberculoză și prevenirea în timp util a diabetului zaharat. În plus. Acest lucru servește ca o justificare suplimentară a oportunității utilizării dozelor fiziologice de insulină în terapia complexă a tuberculozei.

În general, niveluri, mai mici de hormoni tiroidieni și hipercortizolemie lor dezechilibru hiperinsulinismul mai mare acoperire la pacienții cu curs severă a procesului tuberculos, cu leziuni pulmonare extinse si simptome severe de intoxicație și tuberculoză.

Diagnosticul microbiologic al tuberculozei

Sunt necesare studii microbiologice pentru identificarea pacienților cu tuberculoză, verificarea diagnosticului, monitorizarea și corectarea chimioterapiei, evaluarea rezultatelor tratamentului, cu alte cuvinte, de la momentul în care pacientul este înregistrat cu tuberculoză înainte de al scoate.

Toate programele și proiectele epidemiologice se bazează pe o evaluare a numărului de excretori bacterieni, care nu se pot realiza fără a utiliza metode de laborator pentru detectarea tuberculozei microbacteriene. Într-un studiu al așa-numitei populații neorganizate, procentul de invadatori bacterieni atinge 70 sau mai mult, ceea ce face ca metodele de laborator să fie un mijloc suficient de eficient de a identifica pacienții cu tuberculoză în rândul acestui grup de populație.

Metodele tradiționale microbiologice de diagnosticare a tuberculozei sunt studii bacterioscopice și de cultură. Metodele moderne iau în considerare cultivarea tuberculozei mycobacterium în sisteme automate, stabilirea PCR. Cu toate acestea, toate aceste metode se combină în mod necesar cu metodele bacteriologice clasice.

Colectarea materialului de diagnostic

Eficacitatea studiilor de laborator depinde într-o mare măsură de calitatea materialului de diagnosticare. Respectarea regulilor de colectare, stocare și transport a materialelor de diagnosticare și punerea exactă în aplicare a algoritmului de evaluare a pacientului afectează în mod direct rezultatul și asigură siguranța biologică.

Pentru testarea tuberculozei, se utilizează o varietate de materiale. Datorită faptului că TB logkih- forma cea mai comuna leziuni tuberculoase, materialul de bază pentru cercetarea considera spută și alte tipuri de traheobronșic detașabile: superior secrețiilor tractului respirator obținute după inhalarea de aerosoli: spălările bronhice; spălarea bronhoalveolară; materialul obținut prin bronhoscopie și transtraheale intrapulmonare biopsii din aspirate bronșice, tampoane laringiene, exsudate din răni și frotiuri al.

Eficacitatea cercetărilor crește dacă se realizează o colecție controlată de material de la un pacient. În acest scop, se alocă o cameră special echipată sau se achiziționează cabine speciale. Colectarea de materiale este o procedură periculoasă, prin urmare este necesar să se colecteze materiale pentru cercetare, respectând regulile de siguranță infecțioasă.

Materialul pentru testarea pe Mycobacterium tuberculosis este colectat în sticle sterile cu capace bine înșurubate pentru a preveni contaminarea mediului și pentru a proteja materialul colectat de contaminare.

Flacoanele pentru colectarea materialului de diagnosticare trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:

• trebuie să fie realizate din material rezistent la impact;
• ar trebui să se topească ușor în timpul autoclavării;
• să aibă un volum suficient (40-50 ml):
• au o deschidere largă pentru colectarea sputei (diametrul nu mai mic de 30 mm);
• să fie ușor de manevrat, transparent sau translucid, astfel încât să puteți evalua cantitatea și calitatea probei colectate fără a deschide capacul.

Pentru a obține rezultate optime de cercetare, trebuie respectate următoarele condiții:

• Colectați materialul înainte de începerea chimioterapiei;
• materialul pentru studiu trebuie colectat înainte de consumul de mâncare și medicamente de dimineață;
• pentru cercetare este de dorit să se colecteze cel puțin 3 probe de flegma de dimineață. Adunați sputa timp de 3 zile consecutive;
• materialul colectat trebuie livrat la laborator cât mai curând posibil:
• în cazul în care este imediat imposibil să se livreze materialul la laborator, acesta este depozitat în frigider la o temperatură a aerului de 4 ° C timp de cel mult 48 de ore;
• La transportul materialului, este necesar să se monitorizeze îndeaproape integritatea flacoanelor.

Sputa colectată corect este mucoasă sau mucopurulentă. Volumul optim al sputei testate este de 3-5 ml.

Sputa este colectată sub supravegherea unui medic. Persoanele responsabile pentru colectarea sputei ar trebui să urmeze punerea în aplicare a anumitor reguli:

• este necesar să se explice pacientului scopul studiului și nevoia de a tuse nu saliva sau mucus nazofaringian, ci conținutul tractului respirator profund. Acest lucru poate fi obținut ca urmare a unei tuse productive care apare după câteva (2-3) respirații profunde. De asemenea, este necesar să se avertizeze pacientul că el trebuie să-și clătească gura cu apă fiartă, pentru a îndepărta partea principală a microflorei care este vegetantă în cavitatea bucală și reziduurile alimentare care împiedică examinarea sputei;
• un lucrător medical care participă la colectarea sputei, în plus față de un halat de baie și o pălărie, trebuie să poarte o mască, mănuși de cauciuc și o șorț de cauciuc;
• în spatele pacientului, se recomandă să păstreze sticla cât mai aproape de buze și să se separe imediat în flegma în timp ce acesta tuse și trebuie să se prevadă că fluxul de aer este îndreptat departe de lucrătorul în domeniul sănătății:
• După finalizarea colectării sputei, lucrătorul medical trebuie să închidă cu atenție flaconul cu un capac și să evalueze cantitatea și calitatea sputei colectate. Apoi, flaconul este etichetat și plasat într-un bix special pentru transportul în laborator.

În cazul în care pacientul nu produce flegma, cu o noapte înainte și dimineața devreme în ziua de colectare a materialului necesar să-i dea un expectorant :. Un extract din rădăcini de nalba (mukaltin), bromhexin, ambroxol, etc. - sau aplicați un inhalare iritanta cu ajutorul echipamentelor instalate in camera pentru a colecta spută. Materialul colectat în acest mod nu este supus conservării și trebuie examinat în ziua colectării. Pentru a evita "culling" -ul în laborator în direcția ar trebui să facă un semn special.

În cazul în care nu se efectuează studii microbiologice la această instalație, materialul de diagnostic colectat trebuie livrat central la laborator, cu condiția ca materialul să fie conservat la intervalele dintre livrările în frigider sau cu utilizarea de conservanți. Livrați materiale în laborator în cutii de transport, care pot fi ușor dezinfectate. Fiecare eșantion trebuie să fie prevăzut cu eticheta adecvată, iar întregul lot trebuie umplut cu un formular de însoțire.

[29], [30], [31],

Modurile și frecvența examinării pacienților

La examinarea inițială, așa-numita diagnostic, a pacientului pentru tuberculoză, este necesar să se examineze cel puțin 3 porțiuni de spută timp de 2 sau 3 zile. Colectate sub supravegherea personalului medical, ceea ce sporește eficiența microscopiei.

Screeningul primar pentru tuberculoză trebuie efectuat de către toate instituțiile medicale de diagnosticare ale sistemului de sănătate. Recent, așa-numitele centre de microscopie, dotate cu microscoape moderne și echipamente pentru siguranța epidemiei, au fost organizate pe baza laboratoarelor de diagnostic clinic pentru a îmbunătăți eficiența examinării inițiale.

În facilitățile anti-TB, se utilizează un test de screening care include examenul de spută sau alt material de diagnosticare de cel puțin 3 ori timp de 3 zile. În timpul tratamentului, studiile microbiologice sunt efectuate în mod regulat cel puțin o dată pe lună în timpul fazei de chimioterapie intensivă. La trecerea la faza de tratament, studiile sunt efectuate mai rar - cu un interval de 2-3 luni, în timp ce frecvența studiului este redusă la două.

Caracteristicile colecției de material de diagnostic pentru tuberculoza extrapulmonară

Caracteristică Material patologic cu forme de TBC extrapulmonară - Mycobacterium tuberculosis concentrație scăzută în ea, ceea ce necesită o metode mai sensibile studii microbiologice, în primul rând pe mediu tehnicile de însămânțare.

Cu tuberculoza sistemului genito-urinar, urina este cel mai accesibil material de studiu. Colectarea urinei trebuie efectuată de o asistentă medicală special instruită.

Genitalii externi sunt spălați cu apă cu săpun sau cu o soluție slabă de permanganat de potasiu. Deschiderea externă a uretrei este tratată cu atenție. Într-o fiolă sterilă, se colectează o porțiune medie din urina de dimineață: la bărbați, în mod natural, la femei, folosind un cateter. Urina din pelvisul renal este colectată în tuburi sterile cu cateterizarea unuia sau a doi rinichi, în ultimul caz - în mod necesar separat de fiecare rinichi. O cantitate mică din această urină este centrifugată, sedimentul este examinat.

La bărbați, spermatozoizi, testicule punctate, secretul prostatei este supus centrifugării pentru a obține un precipitat. Cu orice localizare a unui proces specific în zona genitală la bărbați, masajul prostatei poate promova secreția secrețiilor care conțin tuberculoza mycobacterium.

Sângele menstrual la femei este colectat prin aspirație sau prin utilizarea unui capac Kafka. Materialul obținut este eliberat din celulele roșii, spălându-l cu apă distilată urmată de centrifugare. Precipitatul este examinat.

Alocațiile din canalul cervical al uterului sunt colectate în unele capacități Kafka sau capac, adică este de dorit să se acumuleze 1-2 ml de material patologic.

Material obținut din intervenții operative pe rinichi, organe genitale. Cu biopsii, răzuire din endometru, omogenizată. Pentru a face acest lucru, este plasat într-un mortar steril și zdrobit bine cu foarfece sterile. La această suspensie se adaugă râu nisip steril într-o cantitate egală cu greutatea sa, iar apoi completat cu 0,5-1.0 ml soluție izotonică de clorură de sodiu, și totul se triturează până la o masă păstoasă, cu adaos de soluție de clorură de sodiu izotonică (4-5 ml). Apoi masa este lăsată să se depună timp de 1-1,5 minute, supernatantul este examinat.

Tuberculoza oaselor și articulațiilor. Punctul (puroi de abcese) obținut cu o seringă sterilă este plasat în recipiente sterile și este livrat imediat la laborator. Pipeta sterilă, umezită anterior cu soluție sterilă de clorură de sodiu, ia 2-5 ml de puroi, se transferă într-o sticlă de granule și se adaugă încă 2-3 ml soluție izotonică de clorură de sodiu. Flaconul este închis cu o plută și este agitat într-un aparat de joker timp de 8-10 minute. Se examinează suspensia omogenizată.

În formele fistuloase de tuberculoză osteoarticulară se iau puroi din fistula. Evacuarea abundentă este colectată direct într-un tub de testare. In cazuri slaba fistulă pyorrhea se spală cu soluție sterilă de clorură de sodiu izotonică, și soluțiile de spălare au fost colectate într-un tub de testare sau bucata de tampon impregnate cu puroi trimise pentru analiză.

Material chirurgical obținute în timpul intervenției chirurgicale asupra oaselor și articulațiilor pot consta din mase-purulent necrotice, granulații, cicatrice, membranele sinoviale ale țesutului osos și alte substraturi. Tratamentul său se efectuează, ca și în cazul tuberculozei rinichilor.

Studiul microbiologic al lichidului sinovial în soluție citrat de sodiu 3% (raport 1: 1) pentru a preveni coagularea se efectuează imediat după puncție.

Tuberculoza ganglionilor limfatici. Pulbul, extras în timpul puncției ganglionilor limfatici, este de asemenea examinat. Ca puroi al abceselor. Țesuturile ganglionilor limfatici obținuți în timpul intervențiilor chirurgicale, biopsii, sunt examinate, ca și în cazul altor forme de tuberculoză.

Studiul maselor scaunelor pe tuberculoza mycobacterium este extrem de rar, datorită lipsei aproape totale a rezultatelor pozitive.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium microscopy

Microscopia cu spută este o metodă relativ rapidă, simplă și ieftină, care ar trebui utilizată în toate cazurile cu tuberculoză suspectată. În plus, acest studiu este realizat pentru a evalua eficacitatea chimioterapiei și pentru a constata recuperarea sau eșecul tratamentului dacă nu există un test de cultură.

Sunt utilizate două metode de examinare microscopică:

• metoda de microscopie directă, atunci când un preparat este preparat direct din materialul de diagnosticare;
• metoda de microscopie a unui sediment preparat din material tratat pentru decontaminant pentru cultură.

Prima metodă este folosită în laboratoarele unde se efectuează numai studii microscopice (laboratoarele clinice și de diagnostic din rețeaua medicală generală).

Cele mai bune rezultate ale examinării microscopice sunt obținute prin concentrarea materialului de diagnostic (de exemplu, prin centrifugare).

Pentru a detecta tuberculoza mycobacterium cu o probabilitate de 50% la efectuarea microscopiei, 1 ml de spută ar trebui să conțină mai mult de 5000 de celule microbiene. Sputa de pacienți cu forme pulmonare de tuberculoză conține de obicei o cantitate semnificativă de bacterii acide, care le permite să fie detectate în mod fiabil prin bacterioscopie. Sensibilitatea diagnostică a acestei metode poate fi mărită dacă mai multe probe de spută sunt examinate de la un pacient. Un rezultat negativ al unui examen bacterioscopic nu exclude diagnosticul de tuberculoză, deoarece sputa unor pacienți conține mai puțin micobacterii decât poate fi detectată prin microscopie. Pregătirea slabă a frotiului sputei poate provoca, de asemenea, un rezultat negativ al unui examen bacterioscopic.

Cea mai obișnuită metodă pentru detectarea microbacteriilor acide-rapide în frotiu este culoarea conform lui Tsiol-Nelsen. Metoda se bazează pe penetrarea fucsinului carbolic într-o celulă microbiană printr-o membrană care include un strat de lipid-ceară, în timp ce încălzirea simultană și acțiunea puternică a gravării fenolului. Decolorarea ulterioară a frotiului cu o soluție de acid sulfuric 25% sau acid clorhidric 3% duce la o decolorare a tuturor structurilor care nu sunt acide. Elementele decolorate ale frotiului sunt colorate cu o soluție de albastru de metilen 0,3%. Mycobacteria nu percepe coloranții obișnuiți de anilină, ca urmare a faptului că micobacteriile acide rapide sunt colorate în culoarea roșu-roșu și alți microbi și elemente celulare - în albastru.

Pentru frotiurilor colorate de Ziehl-Nelsenu folosesc microscop binocular lumina cu lentile de imersie în ulei (creșterea 90- sau 100 de ori) și ocular la mărire de 7 sau 10 ori. Explorați 100 de câmpuri de vizibilitate, care este suficient pentru a identifica micobacteriile unice în frotiu. În cazul în care rezultatul unui astfel de studiu este negativ, pentru confirmare se recomandă vizualizarea a încă 200 de câmpuri de vizibilitate. Înregistrați rezultatele, indicând numărul de bacili detectați acid-rapid (KUM).

În plus față de această tehnică, fluorochromii de culoare sunt utilizați pentru microscopia luminescente, care permite obținerea celor mai bune rezultate. Utilizarea acestei metode sporește eficiența microscopiei cu 10-15%. Atunci când tratăm micobacteriile cu coloranți luminescenți (auramină, rodamină etc.), aceste substanțe se leagă de structurile de tip ceară ale celulei microbiene. Când radiați celule colorate cu o sursă de lumină incitantă (un anumit spectru de radiații ultraviolete), acestea încep să strălucească cu lumină portocalie sau roșie luminoasă pe un fundal negru sau întuneric verde. Datorită luminozității și contrastului ridicat al imaginii vizibile, mărirea generală a microscopului poate fi redusă de 4-10 ori, câmpul de vizualizare se mărește și timpul de vizionare al preparatului scade. Odată cu aceasta, datorită profunzimii mult mai mari a câmpului, puteți mări confortul studiului.

Atunci când microscopia fluorescentă este folosită pentru a vizualiza aceeași zonă, frotiuul consumă mult mai puțin timp decât cu microscopia luminoasă a colorării Tsiol-Nelsen. Dacă într-o zi lucrătoare un microscop examinează aproximativ 20-25 astfel de frotiuri, cu ajutorul microscopiei fluorescente, poate examina mai mult de 60-80 de probe în același timp. Experții în microscop știu că colorarea celulelor cu un amestec de auramină și rodamină este într-un fel specifică pentru bacili cu aciditate rapidă, care în acest caz arata ca bastoane de aur. Saprofitele sunt vopsite într-o culoare verzui.

Un alt avantaj important al metodei de microscopie fluorescenta - capacitatea de a detecta mycobacterium alterată, a pierdut sub influența factorilor adverse, inclusiv chimioterapie intensiva, proprietatea kislotousotoychivosti și nu este detectată în legătură cu această colorație Ziehl-Nelsenu.

Dezavantajele metodei de microscopie de fluorescență includ costul relativ ridicat al microscopului și funcționarea acestuia. Cu toate acestea, în laboratoarele centralizate sau în alte laboratoare mari, în care încărcătura depășește norma a 3 tehnicieni de laborator care lucrează cu trei microscoape convenționale, este mai ieftin să folosiți un microscop fluorescent.

Metodele bacteriologice au o specificitate destul de mare (89-100%). Aproximativ 97% din rezultatele pozitive obținute prin orice metodă de microscopie sunt confirmate fără echivoc de rezultatele însămânțării.

Trebuie remarcat faptul că, în cazul examinării microscopice a frotiului de material patologic, este imposibil să se determine speciile aparținând micobacteriilor identificate acid-rapide. Metoda de microscopie permite să emită un aviz numai cu privire la prezența sau absența acidului în prepararea de microorganisme, care poate fi explicată prin existența în natura unui număr mare de morfológicamente similar cu microorganisme complexe micobacterii tuberculoase acide nontubercular rezistente.

Rezultatele microscopiei sunt evaluate în unități semiquantitative.

Pentru a putea compara rezultatele diferitelor metode de microscopie, se introduc coeficienți empirici. De exemplu, pentru a compara rezultatele frotiurilor colorate cu vopsele fluorescente, lumina microscopului de cercetare a datelor (1000 ori mărire), este necesar să se împartă numărul de bacilli acid rapid detectat de microscop cu fluorescență, coeficientul corespunzător de la 250 de ori mărire - până la 10, 450 de ori - până la 4, cu 630 de ori - până la 2.

Caracteristici ale microscopiei pentru tuberculoza extrapulmonară

Se efectuează microscopie directă, precum și microscopia frotiurilor preparate după îmbogățire, urmată de colorarea Tsiol-Nelsen sau coloranți luminescenți. Microscopia directă a frotiurilor este ineficientă datorită unei concentrații scăzute de micobacterii din material și, prin urmare, este mai rațional să se utilizeze metode de îmbogățire. Cea mai eficientă este centrifugarea. Dacă materialul biologic este vâscos, centrifugare este aplicată cu lichefierea simultană și omogenizare a materialului, care se realizează cu ajutorul centrifugelor de mare viteză, cu o forță centrifugă de 3000 g și hipoclorit de soluții. Alte metode de îmbogățire, cum ar fi micro flotația, nu sunt utilizate în prezent datorită formării de aerosoli periculoși din punct de vedere biologic.

[37], [38],

Metoda culturală de diagnosticare a tuberculozei

Metoda de însămânțare sau metoda de cultură este mai sensibilă decât microscopia frotiului și are o serie de avantaje față de cea din urmă. Acesta permite detectarea mai multor zeci de micobacterii viabile în materialul de testare și are o mare valoare diagnostică. Acest lucru este deosebit de important atunci când se examinează materialul de la pacienții nou diagnosticați sau tratați, care eliberează o cantitate mică de micobacterii.

În comparație cu microscopia, cercetarea în domeniul culturii permite creșterea numărului de pacienți cu tuberculoză diagnosticată cu mai mult de 15-25%, precum și verificarea tuberculozei în stadiile anterioare, când boala este încă supusă tratamentului. Un avantaj foarte important al testului de cultură este posibilitatea de a obține o cultură excitant care poate fi identificată și studiată în ceea ce privește sensibilitatea la medicament, virulența și alte proprietăți biologice.

Dezavantajele metodelor de cultivare includ durata lor (timpul de așteptare al materialelor ajunge la 10 săptămâni). Costul mai mare, complexitatea procesării materialului de diagnosticare.

Principiile de pre-tratare a materialului de diagnosticare

Metodele microbiologice convenționale nu pot fi utilizate în efectuarea studiilor privind tuberculoza. Acest lucru se datorează faptului. Că Mycobacterium tuberculosis crește foarte lent și că majoritatea probelor clinice conțin microorganisme piogenice și putrefactive cu creștere rapidă, ciuperci. Creșterea rapidă a acestora pe medii nutritive bogate interferează cu dezvoltarea micobacteriilor și nu permite izolarea agentului cauzator de tuberculoză, astfel încât materialul de diagnosticare trebuie să fie pretratat înainte de însămânțare. În plus, micobacteriile eliberate din căile respiratorii ale pacientului sunt de obicei înconjurate de o cantitate mare de mucus, ceea ce face dificilă concentrarea acestora. În acest sens, înainte de plantarea sputei și a altor materiale similare, lichefierea lor, este necesară decontaminarea.

Toate detergenții și decontaminurile au un efect toxic mai mult sau mai puțin pronunțat asupra micobacteriilor. Ca rezultat al procesării, până la 90% din micobacterii pot muri. Pentru a păstra suficient populației micobacterian, care economisesc necesitatea de a utiliza tehnici de prelucrare care permit, pe de o parte, pentru a suprima bacteriile piogenice în creștere rapidă și putrezită, iar pe de altă parte - pentru a menține viabilitatea micobacteriilor prezente în materialul.

În funcție de materialul, gradul său de omogenitate și de poluare pentru preprocesarea folosind diverse decontaminant: sputei - soluție de hidroxid de sodiu 4%, soluții trohzameschonnogo fosfat de sodiu 10%, clorură de benzalconiu, fosfat trisodic, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteină hidroxid de sodiu) la o concentrație finală de 1% NaOH, în urină și alte materiale lichide - soluție de acid sulfuric 3%, pentru probele contaminate, materiale care conțin grăsimi - soluție de acid oxalic până la 5%. În plus, în unele cazuri se utilizează enzime, surfactanți (detergenți). Aplicație detergenți Tween și alte moarte micobacteriene este însoțită de mai puține celule (40-50% supraviețuiesc). Cu toate acestea, ele pot fi utilizate numai pentru materiale lichide. Cea mai mare distribuție în lume a fost NALC-NaOH. Produse în seturi. Această metodă permite alocarea a mai mult de 85% din populația celulelor micobacteriene. Decontaminarea tkanesoderzhaschih solide mai greu de ghicit, deoarece gradul de dispersie a materialului în timpul omogenizării dificile. De exemplu, biopsii de tratament ale ganglionilor limfatici este adesea însoțită de o frecvență crescută a contaminării cu floră străine. În acest caz, se poate folosi 1% de etoniu.

Materialul neomogen este omogenizat cu perle de sticlă în prezența decontaminantului. Materialele lichide sunt pre-centrifugate și se tratează numai un precipitat.

Tehnici de însămânțare și incubare

După pretratare, materialul este centrifugat, precipitând astfel micobacteriile și mărindu-le conținutul în sediment ("îmbogățirea nămolului"). Precipitatul rezultat este neutralizat și inoculat (inoculat) cu medii nutritive dense sau tuburi cu mediu lichid (semilichid). Din restul sedimentelor, frotiurile sunt pregătite pentru examinare microscopică. Tehnica de însămânțare ar trebui să împiedice contaminarea încrucișată a materialului de diagnosticare.

Pentru o interpretare clinică fiabilă a rezultatelor unui studiu microbiologic, trebuie respectată următoarea regulă: studiile microscopice și de cultură trebuie efectuate în paralel din aceeași probă a materialului de diagnosticare.

Tuburile inoculate sunt plasate într-un termostat la 37 ^° C timp de 2 zile într-o poziție orizontală. Aceasta asigură o absorbție mai uniformă a materialului în mediul de cultură. După 2 zile, tuburile sunt transferate într-o poziție verticală și etanșate ermetic cu dopuri de cauciuc sau silicon pentru a preveni uscarea mediului de semănat.

Culturile sunt incubate la 37 ^aproximativ C , timp de 10-12 săptămâni cu vizualizare săptămânal. Pentru fiecare previzualizare, se înregistrează următorii parametri:

• perioada observată vizual din ziua creșterii semănatului;
• rata de creștere (numărul de UFC);
• contaminarea culturii cu o floră microbiană sau ciuperci străine (astfel de tuburi sunt îndepărtate);
• lipsa de creștere vizibilă. Tuburile sunt lăsate în termostat până la următoarea vizionare.

Suplimente nutritive

Pentru cultivarea micobacteriilor sunt utilizate diverse medii nutritive; dens, semi-lichid, lichid. Cu toate acestea, niciuna dintre mediile nutritive cunoscute nu are proprietăți care să asigure creșterea tuturor celulelor micobacteriene. În legătură cu aceasta, se recomandă utilizarea simultană a 2-3 materiale nutritive de compoziție diferită pentru a crește eficiența.

OMS recomandă mediul Levenstein-Jensen ca mediu standard pentru izolarea primară a agentului cauzator de tuberculoză și pentru determinarea sensibilității sale la medicament. Acesta este un mediu dens de ou pe care se obține creșterea micobacteriilor în ziua 20-25 după însămânțarea unui material bacterioscopic pozitiv. Culturile de material negativ bacterioscopic necesită o perioadă de incubație mai lungă (până la 10-12 săptămâni).

În țara noastră, propunerea E.R. Finn ou mediu Finn-II. Diferă prin aceea că, în loc de L-asparagină, utilizează glutamat de sodiu, care declanșează alte metode de sinteză a aminoacizilor din micobacterii. Creșterea apare pe acest mediu oarecum mai devreme, iar frecvența de alocare a micobacteriilor este cu 6-8% mai mare decât în mediul Lowenstein-Jensen.

Pentru a îmbunătăți eficacitatea diagnosticului bacteriologic al tuberculozei extrapulmonare, se recomandă includerea mediilor Finn-II modificate în complexul de medii nutritive. Pentru accelerarea creșterii, se adaugă în plus la mediul nutritiv Finn-II o tioglicolat de sodiu 0,05%, care reduce concentrația de oxigen. Pentru a proteja sistemele enzimatice de micobacterii de produsele toxice de peroxidare lipidică în mediul nutritiv Finn-II, acetat de antioxidant α-tocoferol este adăugat la o concentrație de 0,001 pg / ml. Semănarea materialului de diagnosticare se efectuează conform unei proceduri standard.

În laboratoarele anti-tuberculoză din Rusia sunt utilizate și alte modificări ale mediilor nutritive dense; propus G.G. Mediul nutritiv mordovian "Nou", dezvoltat de V.A. Medii nutritive anicice A-6 și A-9, etc.

Datorită faptului că, în procesul de chimioterapie este de deteriorare a diverselor sisteme metabolice ale celulelor microbiene, unele populații micobacteriene pierde capacitatea de a se dezvolta în mod normal, în medii nutritive convenționale și necesită osmotic echilibrate (sau semilichidă) medii de cultură.

Evaluarea și înregistrarea rezultatelor însămânțării materialului de diagnostic

Unele tulpini și specii de micobacterii cresc încet, creșterea poate să apară chiar și în cea de-a 90-a zi. Numărul acestor culturi este mic, dar acest lucru face posibilă rezistența culturilor la un termostat de 2,5-3 luni.

Culturile virulente de tuberculoză mycobacterium cresc de obicei pe medii dense de ou sub formă de colonii de formă R, de diferite mărimi și specii. Coloniile sunt uscate, încrețite, fildeș, ușor pigmentate. În alte medii, colonia tuberculozei mycobacterium poate fi mai umedă. După un curs de chimioterapie sau în timpul tratamentului, pot fi alocate colonii netede cu creștere umedă (forme S).

La izolarea culturilor, un set de studii speciale este utilizat pentru a distinge Mycobacterium tuberculosis de mycobacteria non-tuberculosis și saprofite rezistente la acid.

Un răspuns pozitiv este dat după o examinare microscopică obligatorie a frotiului colorat Tsiol-Nelsen din coloniile crescute. În cazul creșterii micobacteriilor în frotiuri se găsesc bastoane roșii strălucitoare care se află singură sau în grupuri care formează grupuri sub formă de pâslă sau panglici. În culturile tinere, in special izolate de la tratamentul pe termen lung al pacienților cu chimioterapie, micobacterii difera polimorfismul exprimat, până când prezența în formă de tijă, împreună cu versiuni scurte, aproape coccoid sau alungite care seamănă cu miceliu.

Rata de creștere a micobacteriilor este indicată prin următoarea schemă: (+) - 1-20 cfu in vitro (excreție bacteriană redusă); (++) - 20-100 CFU in vitro (excreție bacteriană moderată); (+++) -> 100 CFU in vitro (excreție bacteriană abundentă). În diagnosticul de laborator al tuberculozei, nu este suficient să se răspundă dacă miocobacteria este detectată prin una sau altă metodă. Au o înțelegere detaliată a amplorii și naturii populației micobacteriene, a compoziției și a proprietăților acesteia. Aceste date ne permit să interpretăm corect starea procesului, să planificăm tactici și să corectăm în timp util tratamentul.

În ultimii ani, a fost propusă o accelerare a creșterii micobacteriilor, au fost propuse medii nutritive pe bază de agar cu diverse aditivi de creștere și utilizarea unui amestec special de gaze. Pentru a obține creșterea micobacteriilor pe aceste medii, în timpul cultivării, se creează o atmosferă cu un conținut ridicat de dioxid de carbon (4-7%). În acest scop, utilizați speciale de CO ₂ incubator. Cu toate acestea, cele mai dezvoltate sisteme automate de cultivare a micobacteriilor: MGIT-BACTEC-960 și MB / Bact.

Un astfel de sistem - Sistemul MGIT (creștere micobacteriile tub indicând), care se referă la dezvoltarea de înaltă tehnologie și este destinat pentru diagnosticarea bacteriologic rapida a tuberculozei si a Mycobacterium sensibilitatea la medicamente de prima linie, iar unele medicamente de linia a doua. MGIT se concentrează pe utilizarea acestuia ca parte a dispozitivului VASTES-960. Microorganismele sunt cultivate în tuburi speciale cu un mediu nutritiv lichid bazat pe mediul Middlebrook-7H9 modificat. Pentru stimularea creșterii micobacteriilor și suprimarea creșterii microflorei străine, se utilizează suplimentul de creștere MGIT și un amestec de medicamente antibacteriene PANTA.

Creșterea microorganismelor este înregistrată optic. Se bazează pe fluorescență, care apare atunci când oxigenul este consumat de micobacterii în timpul creșterii. Dye oxigen-flyuorohromny conținută în partea inferioară a unei eprubete speciale și acoperite cu un strat de silicon. Reproducere micobacteriile duce la o scădere în cantitate de oxigen în tub și reducerea concentrației care determină o creștere a fluorescenței, care devine vizibilă sub iradiere cu tuburi de lumină ultravioletă și fotosenzor înregistrate automat încorporat aparat VASTES-960. Intensitatea luminiscenței este înregistrată în unități de creștere (unități de creștere GU). Datele de creștere sunt înregistrate în computer, unde pot fi salvate automat. Analiza computerizată a curbelor de creștere poate oferi informații despre prezența unei varietăți de bazine micobacteriene, inclusiv nontubercular, și ajută, de asemenea pentru a evalua proprietățile de creștere ale micobacterii.

Ca urmare a introducerii unor astfel de sisteme, timpul de creștere a micobacteriilor a scăzut semnificativ, în medie 11 zile pe VASTES-960 și 19 zile pe MB / Bact comparativ cu 33 de zile pe un mediu nutritiv standard dens. Trebuie remarcat faptul că aceste sisteme necesită personal de înaltă calificare. Semănarea materialului pe mediu lichid este, în mod necesar, însoțită de însămânțarea pe mediul Levenstein-Jensen, care joacă rolul de rezervă în acele cazuri în care Mycobacterium tuberculosis nu dă naștere în alte medii.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Determinarea sensibilității la medicament a micobacteriilor

Determinarea spectrului și a gradului de sensibilitate a micobacteriilor la medicamentele împotriva tuberculozei are o mare importanță clinică, precum și pentru evaluarea epidemiologică a răspândirii tuberculozei cu rezistență la medicament. În plus, monitorizarea rezistenței la medicamente permite evaluarea eficacității programului de tuberculoză în ansamblu, fiind un indicator integral al performanței tuturor componentelor activităților anti-tuberculoză.

Multiplicitatea și calendarul sensibilității la medicament:

• înainte de începerea tratamentului o dată pentru a determina strategia și tactica tratamentului:
• când sunt izolate din culturile bolnave din diferite materiale (spută, fluid BAL, urină, exudate, lichior etc.), toate tulpinile izolate sunt examinate:
• la sfârșitul fazei intense de tratament în absența dinamicii clinice și radiologice:
• dacă este necesară modificarea regimului de tratament în următoarele cazuri:
  • absența frotiului sputei;
  • re-izolarea culturii după frotiu-sputum negativ;
  • o creștere drastică a numărului de CMU din tampon după declinul inițial. Este bine cunoscut faptul că tulpinile de mycobacterium tuberculosis, care sunt eterogene în ceea ce privește sensibilitatea la medicament, sunt izolate de materialul de la un pacient cu tuberculoză. Sensibilitatea tulpinilor la medicamentele împotriva tuberculozei poate să difere în funcție de gama de medicamente, grad, frecvență și rată de apariție a rezistenței.

Gradul de rezistență la medicamente de Mycobacterium tuberculosis a fost determinată în conformitate cu criteriile stabilite, care sunt axate pe semnificația clinică și stabilitatea depinde de activitatea de medicament anti-TB, farmacocinetica sa, concentrația în leziune. Doza terapeutică maximă și așa mai departe.

Determinarea sensibilității la medicament a micobacteriilor se realizează în prezent prin metode microbiologice:

• Concentrațiile absolute (metoda de diluare pe medii nutritive dense sau lichide)
• proporții,
• coeficientul de rezistență.

De obicei, rezistența se manifestă sub forma creșterii observate vizual a coloniilor de Mycobacterium tuberculosis, dar există metode care induc creșterea în fazele timpurii ale diviziunii celulare a micobacteriilor sub formă de reacții de culoare. Aceste metode scurtează timpul de testare de la 3-4 la 2 săptămâni.

Ca unificat în Rusia a fost extins, recomandat de metoda de chimioterapie Comitetul OMS a concentrațiilor absolute, care este din punct de vedere metodologic, este cel mai simplu, dar este nevoie de mare precizie și standardizarea procedurilor de laborator. Testul de susceptibilitate la medicament constă într-un set de tuburi de testare cu un mediu nutritiv modificat cu medicamente anti-TB. Setul este format din 2-3 tuburi cu diferite concentrații de fiecare dintre medicamentele utilizate, tuburi de un control, fara medicament pentru mediu și un tub care conține 1000 mcg / ml de sodiu Sali tsilovokislogo sau 500 ug / ml paranitrobenzoynoy nontubercular acid pentru a detecta o creștere a micobacteriilor.

Pentru a prepara un set de medii cu preparate, se utilizează un mediu Levenstein-Jensen modificat (fără amidon), care se toarnă în flacoane. În fiecare dintre baloane se adaugă un volum specific de diluție adecvată a preparatului antituberculos. Conținutul baloanelor este amestecat bine, turnat în tuburi și pliat într-o poziție înclinată timp de 40 de minute la o temperatură de 85 ° C. Se recomandă ca bobina să fie înfășurată într-o rebobină electrică cu control automat al temperaturii. Miercuri cu medicamente anti-TB

Serii 1-a pot fi depozitate în frigider la 2-4 ° C timp de 1 lună, cu preparate din al doilea rând - nu mai mult de 2 săptămâni. Depozitarea mediilor cu preparate la temperatura camerei este inacceptabilă. La prepararea soluțiilor de medicamente anti-tuberculoză, se ia în considerare activitatea lor, calculând concentrația ajustată pentru greutatea moleculară a părții nespecifice a preparatului, puritatea etc. Pentru a determina sensibilitatea la medicament, se utilizează numai substanțe pure din punct de vedere chimic.

Principiul metodei este de a determina concentrația unui medicament antituberculos care inhibă creșterea unei părți semnificative a populației micobacteriene. Dacă este făcut corect, această metodă are o fiabilitate bună.

Înainte de test, este necesar să se asigure că cultura izolată de mycobacterium tuberculosis nu are microfloră străină. Din cultura micobacteriilor în soluție de clorură de sodiu 0,9%, se prepară o suspensie omogenă conținând 500 de milioane de corpuri microbiene pe ml (standard de turbiditate optică de 5 unități). Suspensia rezultată este diluată cu soluție de clorură de sodiu 0,9% (1:10) și 0,2 ml suspensie este adăugată la fiecare tub din setul de medii de cultură. Tuburile inoculate au fost plasate într-un incubator la 37 ° C și menținut în poziție orizontală timp de 2-3 zile la suprafața înclinată a mediului a fost inoculat în mod uniform cu o suspensie de Mycobacterium tuberculosis. Tuburile sunt apoi transferate într-o poziție verticală și incubate timp de 3-4 săptămâni. Rezultatele sunt înregistrate după 3-4 săptămâni.

Întrucât momentul excreției excretorilor din materialul clinic pe medii nutritive este de cel puțin 1-1,5 luni, rezultatele determinării sensibilității medicamentului prin această metodă pot fi obținute nu mai devreme de 2-2,5 luni după însămânțarea materialului. Acesta este unul din principalele dezavantaje ale metodei.

Interpretați rezultatele determinării sensibilității la micobacterii în funcție de anumite criterii. Pe un mediu de cultură solid este considerată sensibilă la concentrația de medicament care este conținută în mediu, în cazul în care numărul de colonii de micobacterii crescute in vitro cu acest medicament nu este mai mare de 20, cu o creștere abundentă în tubul de control fără medicamente. Numai în prezența a mai mult de 20 de colonii, cultura este considerată a fi rezistentă la această concentrație. În practică, atunci când se obțin rezultate de creștere în tuburi de testare aproape de 20 cfu. Este necesar să se notifice unității clinice că sensibilitatea sau rezistența în acest caz este limită, deoarece uneori poate explica dinamica fuzzy a indicatorilor clinici.

Pentru diferite medicamente se stabilește o anumită concentrație, la care se observă reproducerea proporției critice a populației micobacteriene. Aceste concentrații sunt numite "critice". Ca criteriu de stabilitate, se folosește creșterea populației de micobacterii pe un mediu nutritiv cu un preparat la o concentrație critică.

În practica internă a tuberculozei, în determinarea rezistenței la medicament, acestea nu se limitează la determinarea numai a concentrațiilor critice. Acest lucru se datorează faptului. Că nivelul definiție extinsă a rezistentei la medicament permite clinicianului să poziționeze mai precis chimioterapie tactici folosind cunoașterea potențând acțiunea combinațiilor de medicamente, rezistența așteptat zigzag sau să se aplice un grup mai eficiente medicamente utilizate medicamente anti-TB.

Metoda de concentrare absolută este cea mai simplă, dar este, de asemenea, cea mai sensibilă la erorile produse atunci când este efectuată. Mai de încredere, mai ales în determinarea sensibilității la medicamentele de linia a doua, și comună în afara Rusiei este metoda de proporții. Ea ține cont de deficiențele metodei de concentrație absolută, dar în execuție este mai laborioasă.

Metoda este foarte asemănătoare metodei absolute de concentrare. Pregătirea eprubetelor cu medicamente se efectuează în același mod. Ca în metoda de concentrare absolută. Cu toate acestea, doza de însămânțare a suspensiei de tuberculoză micobacteriană este redusă cu un factor de 10. Care elimină frecvența rezistenței spontane a unor tulpini de Mycobacterium tuberculosis la medicamente precum Etambutol, Protionamid, Capreomicină. Ca control, se utilizează 2 sau 3 tuburi cu o doză de semințe egală în eprubete, diluate succesiv de 10 și de 100 de ori. Criteriul stabilității este proporția creșterii observate vizual a tuberculozei mycobacterium. Pentru medicamentele primul criteriu de stabilitate linie este depășirea de creștere de 1% din populația inițială pentru formulările din două serii - o creștere de 1 sau mai mult de 10% din original, în funcție de concentrația critică selectată.

În 1997, un grup de lucru al OMS și Uniunea Internațională pentru identificarea de bune tuberculoza TBC rezistenta la medicamente a făcut ajustări la aceste criterii, oferind micobacterii rezistente la considerat, care cresc pe medii de ou solid Lowenstein-Jensen la următoarele concentrații:

• dihidrostreptomicină - 4 pg / ml;
• isoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampicină 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

În 2001, au fost propuse concentrații critice pentru următoarele medicamente de linia a doua (pentru o proporție critică de 1%):

• capreomicină - 40 mcg / ml;
• protionamidă - 40 mcg / ml;
• kanamicină - 30 pg / ml;
• viomicină - 30 mcg / ml;
• cicloserină 40 pg / ml;
• acid aminosalicilic - 0,5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Rezultatele creșterii sunt evaluate după 4 săptămâni ca preliminare și după 6 săptămâni de cultivare - ca și cea finală.

Pentru a determina sensibilitatea la pirazinamidă, care este utilizat pe scară largă în chimioterapia modernă pentru tuberculoză, concentrația critică recomandată este de 200 μg / ml. Cu toate acestea, până acum nu există o metodă general acceptată pentru determinarea rezistenței medicamentului la acest medicament pe medii nutritive solide, deoarece activitatea sa antibacteriană se manifestă numai în mediu acid (pH <6), care este dificil de susținut din punct de vedere tehnic. În plus, numeroase culturi clinice de tuberculoză micobacteriană cresc în mod reticent pe mediile de ou cu un mediu acid.

Pentru a evalua calitatea rezultatelor testelor de droguri susceptibilitate de Mycobacterium, a recomandat ca fiecare lot nou de mediu LJ controlează determinarea paralelă a sensibilității standardului H37Rv tulpina muzeu. În plus, există anumite criterii microbiologice care trebuie menținute astfel încât tehnicile să ofere un rezultat bine reproductibil și corect interpretat. Printre acestea se numără viabilitatea culturii de Mycobacterium tuberculosis, regulile de obținere a unei suspensii și suspensii omogene culturi de reguli de selecție a Mycobacterium tuberculosis, reprezentativitatea masei bacteriene selectate. Fiabilitatea determinării rezistenței la medicament scade cu o eliberare bacteriană extrem de rară.

Recent, o metodă pentru determinarea sensibilității la medicamente utilizând sisteme automate a fost considerată promițătoare. Cele mai perfecte în acest domeniu sunt evoluțiile bazate pe VASTES MGIT-960. În acest caz, sensibilitatea la medicament a mycobacterium tuberculosis este determinată pe baza unei metode modificate de proporții. În procesul de determinare, rata de creștere a tuberculozei mycobacterium într-un tub de control și în tuburi de testare cu medicamente este comparată. Pentru determinarea sensibilității la streptomicină, izoniazid, rifamp-picin și etambutol, se utilizează suplimentele de îmbogățire și antibioticele incluse în kitul SIRE. Pentru a determina sensibilitatea la pirazinamidă, utilizați kitul PZA. În cursul eprubete de suspensie de testare Mycobacterium tuberculosis inoculat cu medicamente, precum tuburile de control cu suspensie reconstituită de 100 de ori pentru toate medicamentele cu excepția pirazinamida, în care suspensia este de diluare de 10 ori. Criteriul de stabilitate este valoarea micobacteriilor Indicator de creștere 100 GU când creșterea în tubul de control 400 GU (cm. „Cultura metode de izolare micobacteriile“). Contabilitatea și interpretarea rezultatelor sunt efectuate automat și sunt stabilite de intrare sau de programul selectat.

Ca concentrații critice, concentrațiile finale sunt utilizate într-o eprubetă cu un mediu nutritiv lichid. În prezent, au fost elaborate concentrații critice atât pentru medicamentele de primă linie, cât și pentru cele de-a doua linie. Trebuie remarcat faptul că sensibilitatea tuberculozei micobacteriene la cicloserină și acidul aminosalicilic este determinată numai pe mediile nutritive ale ouălor.

Elaborarea sistemului descris protocolul de lucru permite de a studia sensibilitatea la medicamente ca cultura dedicat (mediu nutritiv dens) și folosind primar Mycobacterium MGIT-o creștere in vitro. Această din urmă opțiune reduce semnificativ timpul pentru cultură, permițându-vă pentru a obține rezultatele complete ale culturii Mycobacterium tuberculosis (inclusiv informații privind sensibilitatea la medicamente), după 3 săptămâni de la data colectării materialului, în timp ce metoda tradițională este posibil să se obțină numai a 3 luni. În timp, rezultatele obținute, atunci când pacientul se află într-o fază intensă de tratament, pot compensa costul relativ ridicat al cercetării.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Diferențierea micobacteriilor

Luând în considerare faptul că mediile nutritive utilizate nu sunt strict selective. Diferențierea ulterioară a micobacteriilor izolate este recunoscută ca fiind obligatorie. Nevoia de diferențiere a micobacteriilor se datorează unui număr de caracteristici ale proceselor patologice cauzate de genul: alt curs și rezultatul tuberculozei și micobacterioza, prezența rezistenței la medicamente naturale la unele medicamente anti-TB.

Este recunoscut faptul că identificarea primară a complexului Mycobacterium tuberculosis M. Nontubercular din micobacterii se realizează prin următoarele caracteristici: rata de creștere pe medii solide nutritive, pigmentare, morfologia coloniei, prezența rezistenței acide și o creștere optimă a temperaturii.

Din păcate, nu există nici o metodă unică de laborator pentru a se diferenția în mod fiabil M. Tuberculosis micobacteriilor complex din alte bacilli acid rapid, cu toate acestea, combinația de caracteristici descrise mai sus, cu rezultatele prezentate mai jos un număr de teste biochimice permite identificarea complexului Mycobacterium tuberculosis cu M. Probabil 95%.

Pentru diferențierea Mycobacterium complex M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii și altele) de lent mycobacterii creștere folosit nontubercular teste biochimice de bază care detectează prezența următoarelor simptome:

• capacitatea de a produce acid nicotinic (test de niacin):
• activitatea de reductază a nitratului;
• catalază termostabilă;
• creștere pe mediu cu salicilat de sodiu (1 mg / ml).

Ca teste suplimentare, se poate utiliza, de asemenea, creșterea pe un mediu care conține 500 pg / ml acid paranitrobenzoic sau 5% clorură de sodiu.

Multe laboratoare bacteriologice identifică aceste microorganisme doar la nivelul complexului, datorită capacităților limitate ale laboratoarelor și a capacităților metodologice ale specialiștilor.

In cele mai multe cazuri, cu toate acestea, în practică, pentru diferențierea M. Tuberculosis și M. Bovis este suficientă următoarele teste: niacină, pentru prezența azotaților, înregistrarea prezenței și creșterea pirazinamidazy în mediu conținând 2 ug / ml hidrazidei de acid tiofen-2-carboxilic. Se ia în considerare faptul că micobacteriile complexului M. Tuberculosis sunt caracterizate de următorul set de caractere:

• creștere lentă (mai mult de 3 săptămâni);
• temperatură de creștere în intervalul 35-37 ^o C;
• lipsa pigmentării (fildeș);
• marcat cu acid-rapid de culoare;
• un test pozitiv pentru niacin;
• un test pozitiv al reductazei nitratului;
• absența catalazei termostabile (68 ^° C).
• Absența creșterii pe un mediu Levenstein-Jensen care conține:
  • 1000 pg / ml salicilat de sodiu,
  • 500 pg / ml de acid paranitrobenzoic,
  • 5% clorură de sodiu:
• creștere în prezența a 1-5 pg / ml acid tiofen-2-carboxilic.

Relevanța diferențierii micobacteriilor izolate va crește considerabil odată cu creșterea frecvenței înregistrării cazurilor de HIV / SIDA asociate cu tuberculoza sau micobacterioza. În prezent, nu există o certitudine absolută a disponibilității laboratoarelor regionale practice de a efectua corect acest volum de muncă.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Diagnosticul imunologic al tuberculozei

Există o serie de fenomene universale, de droguri și teste imunologice care au fost găsite inițial tocmai cu tuberculoză sau pe modelul răspunsului imun la micobacterii. Acestea includ BCG tuberculină, un astfel de fenomen cutanat DTH (tuberculin - Pirquet și reacția Mantoux), reacția animalelor subcutanate cu tuberculină sensibilizate (fenomenul Koch). Unul dintre primii anticorpi în boala infecțioasă a fost detectat și în tuberculoză. Desigur, cu atât mai adâncă înțelegere a mecanismelor bune tuberculozei imunitate și controlul lor genetice, cu atât mai mare poate fi utilizarea unor metode imunologice și medicamente care afectează sistemul imunitar, pentru a rezolva problemele practice de TBC.

Cea mai importantă și dificilă problemă practică este considerată în prezent detectarea tuberculozei în procesul de screening în masă a populației. Cu toate acestea, în ciuda numeroaselor rapoarte despre "succese" (pe materiale limitate), nu există o metodă imunologică adecvată (reproductibilă în "orice braț") și un medicament adecvat în acest scop.

Metodele imunologice, în special studiile serologice (determinarea antigenei, anticorpii) și testele de provocare a tuberculinei, sunt utilizate pe scară largă în practica clinică.

În primul rând, printre studiile imunologice utilizate în diagnosticul diferențial, există metode serologice - determinarea antigenelor și a anticorpilor în diferite medii ale corpului.

Specificitatea anticorpilor la microbacteria tuberculoasă depinde de antigenii utilizați în testul imunologic. Se propune o cantitate semnificativă de antigeni, prima dintre care este PPD tuberculină:

• PAP și alte preparate complexe din lichidul de cultură;
• dezintegrarea cu ultrasunete;
• Extractul Triton și alte preparate complexe ale pereților celulari;
• 5-antigen (Daniel);
• Antigenul 60 (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• factorul de cord (trehaloză-6,6-di-mycolat);
• fenolic și alte glicolipide;
• lipopolizaharidă;
• fibronectin-antigen de legare;
• proteine (cel mai adesea recombinant); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA, etc.

Ca urmare a ani de cercetare de către oamenii de știință ruși și străini au dezvăluit legile de bază și eficacitatea diagnosticului serologic anticorp al tuberculozei: antigenul mai complex, sensibilitatea mai mare și specificitatea mai scăzută a testului. Specificitatea în diferite țări variază în funcție de populația infecției cu M. Tuberculosis și micobacteriilor nontubercular de la efectuarea vaccinării BCG și altele. La copii, conținutul informațional al serodiagnosis este mai mic decât la adulți. În tuberculoza primară (mai des copii), definiția IgM este mai informativă. Cu IgG secundar. La pacienții infectați cu HIV, valoarea informativă a serodiagnosticului în determinarea anticorpilor este redusă. Determinarea Eficiența anticorpilor depinde de numărul de „aspecte clinice“: activitatea de proces (prezența sau lipsa prezenței cariilor „izolare“ micobacteriilor a cariilor, gradul de infiltrare), prevalența procesului, durata curgerii sale.

Sensibilitatea metodei de testare imunoenzimatică (ELISA) este de aproximativ 70%. Eficacitatea insuficientă a studiului se datorează specificității sale scăzute. Anterior, a fost luată în considerare posibilitatea de a utiliza screening serologic la grupuri cu risc sporit, în special în rândul persoanelor cu modificări post-tuberculoză în plămâni.

Pentru a spori specificitatea ELISA continuă căutarea de antigene specifice, inclusiv cele produse prin inginerie genetică: (. Vezi mai sus) ESAT-6 și altele .. Utilizarea unor antigeni strict specifici (38 kDa, ESAT) mărește specificitatea. Dar reduce semnificativ sensibilitatea analizei. Împreună cu IFA (sisteme de testare de laborator experimental. De exemplu kit ELISA Pathozyme) oferă, de asemenea kituri cu filtrare laterală imunocromatografică (Mycodot), precum și alte teste similare (dot-analiza pe membrana) cu o evaluare vizuală a rezultatului testului. În timpul acestor teste, analiza se efectuează timp de 10-30 minute; acestea nu necesită echipament special, necesită o evaluare vizuală a rezultatelor, care este asociată cu o anumită subiectivitate. Aceste metode au aproximativ aceleași caracteristici de sensibilitate și specificitate (70% și 90-93%, respectiv) ca ELISA tradițional.

Utilizarea metodelor de analiză imună are o valoare definită ca o suplimentare, luată în considerare în complexul de metode utilizate, în diagnosticul diferențial al tuberculozei, în special în diagnosticarea formelor sale extrapulmonare. Cea mai eficientă metodă ELISA este de diagnosticare a meningitei tuberculozei în studiul lichidului cefalorahidian. În acest caz, sensibilitatea analizei este de 80-85%, iar specificitatea este de 97-98%. Există date privind eficacitatea detectării anticorpilor la microbacteria tuberculozei în lichidul lacrimal în diagnosticul uveitei tuberculoase.

Inducerea sintezei interferon gamma in vitro

Interferonul gama (IFN-γ) este un factor specific de apărare imună, realizat prin activarea sistemelor de enzime macrofage. Inducerea sintezei IFN-γ de către limfocitele T sensibilizate cauzează interacțiunea lor cu antigene de micobacterii.

Ca antigeni utilizați ca tuberculină PPD. și antigenele specifice, obținute prin inginerie genetică, în special antigene ESAT-6 (timpuriu secretat antigen având o greutate moleculară de 6 kDa) și PCP-10 (proteină filtrat de cultură de 10 kDa). Ingineria genetică sau antigenele recombinante sunt absente în celulele vaccinului BCG și al altor micobacterii. Atunci când se utilizează tuberculină, rezultatele testului de inducție IFN-γ sunt comparabile cu rezultatele testului cutanat tuberculină (corelație directă). Când se utilizează antigeni modificați genetic, rezultatele testului sunt mai specifice și nu depind de vaccinarea anterioară a BCG. La testarea persoanelor vaccinate care nu au avut contact cu infecția cu tuberculoză, specificitatea testului este de 99%. Sensibilitatea testului la pacienții cu tuberculoză variază de la 81 la 89%.

Teste și instrumente de diagnosticare au fost dezvoltate pe baza cultivării pe termen scurt a celulelor sau a celulelor mononucleare de sânge integral izolate din sânge cu antigene de Mycobacterium tuberculosis in vitro cu determinarea ulterioară a concentrației de IFN-γ sau prin numărarea numărului de limfocite T care sintetizează IFN-γ. Concentrația de interferon sintetizată într-un tub de testare este determinată prin ELISA utilizând anticorpi monoclonali care leagă IFN-y. Apoi, prin calibrarea IFN-y standard, concentrația sa este determinată în tubul de testare sau în godeurile plăcii.

La efectuarea testului Elispot, numărul de limfocite T care sintetizează IFN-γ. Sunt numărate pe suprafața unei plăci acoperite cu anticorpi la IFN-y.

Dezvoltatorii Diagnosticum pe IFN-γ in vitro, prin inducție, care este aprobat de către Agenția pentru Medicamente și produse din SUA, susțin că un test este imposibil să se diferențieze între infectie latenta TB de tuberculoză activă. Prin urmare, în regiunile cu un nivel ridicat de infecție, testul nu este direct diagnosticat. Cu toate acestea, în țara noastră, aceasta poate fi utilizată pentru a diferenția infecția tuberculoasă la copii de la alergia post-vaccinare și pentru a evalua nivelul imunității specifice în procesul de tratament.

În prezent, este studiat sistemul de testare internă pentru determinarea inducerii sintezei de IFN-y prin antigeni specifici de tuberculoză in vitro.

Starea imunitară și evoluția tuberculozei, imunocorrecția

În procesul de tratare a tuberculozei la om, există schimbări în antigenemie și starea sistemului imunitar.

Datele privind modificările exsudatelor și țesuturilor sunt în mare parte contradictorii. Singurul lucru care poate fi remarcat cu un motiv bun este acela că în granuloamele tuberculoase, de regulă, un număr semnificativ de limfocite T activate sunt detectate.

Este logic să se rezolve alte două dispoziții care sunt necesare pentru a înțelege rolul mecanismelor imunologice în tratamentul tuberculozei la om:

• Pacienții cu SIDA au o incidență deosebit de mare de rezistență la medicamente multiple;
• cu rezistență la medicamente multiple (și în absența infecției cu HIV), tulburările de imunitate (în special legătura cu celule T) sunt deosebit de semnificative.

Când tuberculoza aplică pe larg diferite metode de imunomodulare: este în primul rând medicamente care acționează în principal asupra imunității celulelor T și un sistem de fagocitele mononucleare (hormonii timusului, izoforona, likopid, polioksidony et al.). Precum și micobacteriile integrale (atenuate) și componentele acestora.

Diagnosticul biologic-biologic al tuberculozei

Pentru metode de biologie moleculara in diagnosticul bolilor infecțioase includ, în principal, metode bazate pe manipularea cu materialul genomic al bacteriilor patogene și virale pentru a identifica materialul genetic specific - segmente de ADN având o secvență de nucleotide specifică pentru un anumit tulpini de tip sau patogene pentru a analiza specific Secvențe ADN în gene care determină sensibilitatea agentului patogen la anumite substanțe medicamentoase și, de asemenea, pentru analiza funcțională activitatea anumitor gene ale agentului patogen. Tehnicile de biologie moleculară au fost pe larg în cercetarea științifică și aplicarea practică în diagnosticul și monitorizarea diferitelor infecții bacteriene și virale după deschiderea în 1985, Carrie Myullisom (laureat al premiului Nobel. 1989) reacția în lanț a polimerazei.

Principii și posibilități ale metodei de reacție în lanț a polimerazei

PCR permite amplificarea (multiplicării) in vitro a unei secvențe de nucleotide (fragment ADN al agentului patogen) pentru câteva ore, de milioane de ori. Reacția în prezența lanțurilor ADN individuale determină sensibilitatea extrem de ridicată a testului.

Secvența nucleotidică a anumitor regiuni din lanțul ADN determină identitatea genetică a microorganismului, ceea ce explică specificitatea înaltă a PCR.

Valoarea acestei tehnici pentru detectarea și investigarea caracteristicilor determinate de caracteristicile biologice Mycobacterium tuberculosis ale unui microorganism având o creștere foarte lentă: timp de ADN Mycobacterium tuberculosis dublare când este cultivarea 12-24 ore.

Principiul metodei PCR constă în amplificare - multiplă, de milioane de ori. înmulțirea secțiunilor unei secvențe ADN specifice într-un microvolum de tub în timpul unei recurențe ciclice a următoarelor trei etape de reacție, fiecare dintre acestea trecând într-un regim de temperatură diferit:

• Etapa I - denaturarea ADN-ului dublu catenar la încălzire cu o divergență a lanțurilor sale;
• Stadiul II - legarea complementară (hibridizarea) primerelor (oligonucleotide primare) cu secțiuni terminale ale lanțurilor strict specifice, alese pentru multiplicarea fragmentului ADN;
• Etapa III - finalizarea lanțului fragmentului ADN utilizând o ADN polimerază termostabilă.

Pentru amplificarea in vitro, trebuie să existe molecule de ADN matriceal. Patru tipuri de trifosfați de deoxinucleozidă (nucleotide) care conțin bazele azotate corespunzătoare: adenină (A), timină (T), guanină (D), citozină (C); oligonucleotidele primare sintetizate artificial (primeri) constând din perechi de 18-20 de baze; enzimă termostabilă ADN polimerază având o temperatură optimă de 68-72 ^pe C, și ionii de magneziu.

Specificitatea PCR depinde de alegerea fragmentului ADN. În concordanță cu aceasta, se sintetizează oligonucleotidele din sămânța flancului. Specificitatea hibridării și completarea lanțului ADN se datorează principiului complementarității următoarelor perechi de baze azotate: adenină-timină, guanină-citozină.

Pentru a determina genomica complexul tuberculoasă micobacteriile amplificare țintă cea mai eficientă în majoritatea sistemelor de testare alese fragment de ADN de IS6110, care in cele mai multe tulpini ale genomului Mycobacterium tuberculosis are un număr semnificativ (10-20) de repetiții, care asigură, împreună cu specificitate, sensibilitate ridicată a testului. În același timp, sunt descrise tulpini de Mycobacterium tuberculosis cu un număr mic de repetări sau absența fragmentului IS6110.

Izolarea moleculelor ADN dintr-o probă biologică

Pentru efectuarea PCR, moleculele ADN ale agentului patogen trebuie izolate din materialul biologic într-un volum minim, cu o cantitate minimă de ADN nespecific și diferiți inhibitori ai polimerazei enzime-ADN.

Pregătirea probelor trebuie efectuată în condiții care împiedică contaminarea încrucișată a probelor cu moleculele de ADN izolate. Pentru a face acest lucru, este necesară pre-tratarea camerei cu suprafețe ultraviolete, podele și suprafețe de lucru ale birourilor și aparatelor cu soluții care conțin clor. De asemenea, este necesar să se utilizeze mănuși curate, tuburi de testare de unică folosință și vârfuri pentru pipetări automate.

Pentru a izola ADN - ul Mycobacterium tuberculosis din probele clinice (lichidul cefalorahidian, spălare bronșică) care nu conține un număr mare de celule, resturile celulare, sau săruri ale acestora, suficientă pentru a se centrifughează proba 3-4 mii. Rpm, se adaugă la nămolul 20-30 pl de soluție 2% triton X-100 și se încălzește la 90 ° C ^aproximativ C timp de 30 min.

Pentru prepararea probelor de spută trebuie să fie lichefiere eficient, care este folosit în general pentru o soluție 4% de hidroxid de sodiu și N-acetil-L-cisteină (NALC) într-o cantitate de 50-80 mg per eșantion - în funcție de vâscozitate eșantion. Soluția NALC trebuie să fie preparată ex tempore sau pulberea NALC poate fi adăugată uscată direct în probă. După lichefiere, eșantioanele trebuie centrifugate timp de 15 minute la o temperatură de 3.5-4000 rpm (3000 g) în flacoane de 50 ml cu capace cu șurub, i. E. în aceleași condiții care sunt recomandate pentru prepararea prelungită a flegmului.

Pentru extragerea ADN-ului din metoda de peleți este utilizată cel mai adesea bazate pe utilizarea unei soluții de 5-6 molar de reactiv de lizare izotiocianat de guanidină ca și particulele microporoase și oxidul de siliciu ( „pământ de diatomee“) sorbent molecula de ADN. Substanțe nespecifici, inclusiv inhibitori posibili, apoi se spală într-o soluție 2,5 molar de izotiocianat de guanidiniu și soluție de etanol, după care molecula de ADN este desorbit în apă, iar aceste probe au fost utilizate pentru a efectua PCR. Pentru a simplifica tehnologia de extracție a ADN-ului, "pământul diatomee" este adesea înlocuit cu microparticule magnetice acoperite cu oxid de siliciu. În acest caz, în locul centrifugării se utilizează un suport magnetic special pentru microtuburi pentru a precipita particulele.

În Rusia a fost elaborată o metodă originală pentru separarea imunomagnetică a micobacteriilor, urmată de extracția ADN-ului agentului patogen. Pentru separarea imunomagnetică Mycobacterium tuberculosis utilizând o dimensiune ferroparticles de 3-5 microni, acoperită cu silice, la care sunt atașate prin legare chimică policlonal (iepure) anticorpi la Mycobacterium tuberculosis. Probele de spută după liza alcalină sunt neutralizate cu o soluție acidă tris-HCI și incubate cu un sorbent imunomagnetic. Apoi, imunoferoparticulele sunt colectate cu o tijă magnetică cu vârful înlocuibil, transferate într-o microtubă și precipitate. Se adaugă 20-30 pl dintr-o soluție 2% Triton X-100 și se încălzește timp de 30 minute la 90 ^° C. Supernatantul este utilizat ca șablon ADN pentru analiza PCR.

O problemă dificilă este izolarea ADN-ului de micobacterii tuberculozei din probele de biopsie. Pentru biopsia enzimatică, enzima proteinază K este utilizată la o concentrație finală de 200-500 mg / l la o temperatură de 56 ^° C peste noapte. Mai mult, este utilizată una dintre metodele cunoscute. Excesul de ADN nespecific în analiza PCR a biopsiilor determină adesea inhibarea reacției, ceea ce necesită extracția repetată a ADN-ului.

Metode pentru detectarea rezultatelor

După terminarea reacției, fragmentele ADN amplificate ale agentului patogen sunt identificate prin diverse metode.

Metoda de electroforeză în gel este bine cunoscută. Fragmentul ADN rezultat este identificat printr-un control pozitiv care conține fragmentul ADN specific dorit sau conform unei dimensiuni cunoscute (numărul de perechi de nucleotide) a fragmentului, care este determinată utilizând un marker molecular standard.

În prezența unui colorant specific, bromura de etidiu este inclusă în ADN dublu catenar. Fragmentul ADN sintetizat este detectat ca o bandă luminoasă sub acțiunea ultravioletului.

Mărimea fragmentului ADN, determinată prin electroforeză de la distanța de la început, trebuie să corespundă unui marker de greutate moleculară cunoscută sau unui control pozitiv.

Alte metode de determinare a rezultatelor PCR bazate pe hibridizarea unui singur lant de produse PCR cu oligonucleotide complementare la aceasta - probă de ADN marcat cu biotină, urmată de detecție prin reacții enzimatice, de exemplu prin legarea la fosfatază alcalină streptavidină biotina.

Pe baza acestui tip de detectare, s-au creat analizoare PCR în care detectarea rezultatelor PCR se efectuează automat ca urmare a citirii densității optice în probele după manifestarea reacției enzimatice.

Dezavantajele acestor metode sunt posibilitățile de contaminare intralaboratorie prin fragmente destul de scurte ale moleculelor de ADN. Când moleculele intră în noi probe, ele devin o matrice pentru PCR și duc la rezultate fals pozitive.

În acest sens, pentru a preveni rezultatele fals pozitive, sunt introduse reguli stricte pentru separarea și izolarea spațiilor: pentru a extrage ADN din probele biologice; premisele pentru detectarea rezultatelor (electroforeza) din zona curată. Aceste spații sunt o zonă de contaminare probabilă. O altă zonă izolată este o cameră curată pentru introducerea probelor de ADN care urmează să fie testate în tuburi cu un amestec de reacție pentru PCR. În cele din urmă, se presupune că dispozitivul principal - amplificatorul de ADN - ar trebui amplasat într-o cameră separată, eventual de birou.

Pentru a preveni contaminarea produselor reacțiilor precedente - unele sistem de testare Likon-amp PCR in loc dezoksinukleozidtimidina contin dezoksinukleoziduridin care, in vitro , circuitul de sinteză încorporat în locul în poziția corectă, adică, Baza azotată a timinei prezentă în ADN-ul nativ este înlocuită cu uracil. Glicozilaza uracil-ADN, adăugată la amestecul de reacție la materialul analizat, distruge numai fragmentele contaminante cu deoxiuridină, dar nu și ADN-ul nativ care urmează să fie analizat. De exemplu, Încălzirea ulterioară la 94 ^° C inactivează această enzimă și nu interferează cu amplificarea în PCR.

Există un sistem de testare bazat pe amplificarea izotermică a ARNm, pentru care se efectuează mai întâi transcripția inversă și sinteza moleculelor ADN. Care, la rândul său, este o matrice pentru sinteza ulterioară a moleculelor de ARN. Anticorpii ARN sunt detectați utilizând o probă de ADN colorată cu acridină, când este hibridizată într-o soluție de tub de reacție. Această metodă, pe lângă sensibilitatea ridicată, are avantajul de a analiza într-un tub, care împiedică contaminarea. Conform autorilor, sensibilitatea acestei metode în probele respiratorii atinge 90% cu o specificitate de 99-100%.

Noi metode de detectare sunt implementate în PCR în timp real. Aceste metode diferă în principal prin aceea că PCR și detectarea rezultatelor sale sunt efectuate simultan într-un tub închis. Acest lucru simplifică nu numai tehnologia de analiză, ci previne și contaminarea încăperilor de laborator și a probelor de testare cu produsele PCR anterioare.

In timp real rezultatele de detecție PCR se datorează fluorescență care apar în timpul unui ADN fluorogen sondă de hibridizare cu amplifitsi Rui-PCR în timpul unui fragment de ADN specific. Structura de sonde de ADN fîuorogenici construite astfel încât marker fluorescent este eliberat ca urmare a reacției enzimatice sau distantat de stingator molecula fluorescenta numai în hibridizare specifică cu molecula ADN dorit să fie amplificată în timpul PCR. Deoarece numărul de molecule sonda hibridizat cu creșterea fluorescenței este proporțională cu nivelul detectat al numărului de molecule ale produsului amplificat. Deoarece la fiecare număr ciclu de PCR moleculă ADN fragment este multiplicat cu jumătate, numărul ciclului în care fluorescența este determinată și crește invers proporțional cu numărul de molecule de ADN în eșantionul inițial. Dacă reacția este de a introduce ca calibrator mai multe concentrații cunoscute diferite de molecule fragment ADN de Mycobacterium tuberculosis corespunzătoare, cu ajutorul programului de calculator poate fi calculat și cantitatea de ADN genomic în materialul de testat.

Fiecare eșantion standard este duplicat. Criteriul cantitativ este numărul minim de cicluri PCR necesare pentru debutul și creșterea fluorescenței determinate. Pe abscisă - numărul de cicluri; ordonata este valoarea fluorescenta. Concentrațiile ADN sunt invers proporționale cu numărul de cicluri necesare pentru apariția fluorescenței. În coloana din dreapta (21-32), numerele ciclului pentru concentrațiile corespunzătoare sunt marcate. Diferențele între concentrație de 10 ori a fragmentelor de ADN din 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 ciclu. Pentru doi pacienți concentrațiile fragmente IS6110 au fost de aproximativ 10 ³ / ml și 10 ⁴ / ml. Având în vedere numărul de repetiții (6-20) ale fragmentelor analizate în genomul Mycobacterium tuberculosis număr micobacteriilor în probe clinice - aproximativ 100 și 1000 celule, respectiv.

Utilizarea PCR în diagnosticul tuberculozei

Metoda PCR este cea mai utilizată pentru diagnosticul accelerat de tuberculoză - detectarea tuberculozei mycobacterium în probele clinice: sputa. Iritarea bronșică, exsudatul pleural, urina, lichidul cefalorahidian, osteoliza punctată, aspirațiile pentru tractul genital feminin și diferite specimene de biopsie. In studiul in Olanda aproximativ 500 de spută și lavaj bronșică probe de la 340 de pacienți cu diagnostic confirmat de tuberculoză pulmonară au fost studiate pentru a compara sensibilitatea metodelor PCR, microscopie si frotiuri studii de cultură. Sensibilitatea analizei a fost de 92,6,88,9, respectiv de 52,4%. Specificitatea tuturor metodelor a fost de aproximativ 99%.

S-a comparat eficacitatea detectării tuberculozei mycobacterium prin microscopie frotiu, însămânțarea pe mediul Levenstein-Jensen, sistemul de testare VASTES și analiza PCR. PCR a arătat o sensibilitate de 74,4%, microscopie - 33,8%, însămânțare pe un mediu dens - 48,9% și VASTES - 55,8%. Timpul mediu de detectare pentru însămânțare pe un mediu Levenstein-Jensen este de 24 de zile. VASTES - 13 zile, PCR - 1 zi.

Se discută, de asemenea, posibilitățile de utilizare a PCR ca metodă sensibilă și rapidă pentru monitorizarea eficacității tratamentului tuberculozei.

Detectarea ADN Mycobacterium tuberculosis prin PCR cu chimioterapie eficace determinat pe o perioadă mai lungă - în medie de 1,7 luni, comparativ cu frotiu definit sub microscop fluorescent și cu 2,5 luni, comparativ cu examenul bacteriologic.

Diagnosticul formelor extrapulmonare de tuberculoză

Semnificația PCR ca metodă sensibilă este deosebit de importantă pentru formele extrapulmonare, deoarece prin aceste forme metodele clinico-radiologice și metodele bacteriologice tradiționale pentru determinarea micobacteriilor tuberculozei în materialele de diagnosticare sunt ineficiente.

In investigarea probelor de urină rezultatele PCR au fost pozitive la 16 din 17 pacienți cu TB activa si urinar negativ 4 pacienți tuberculoză renală inactivă și 39 pacienți cu boală urinară nontubercular sistem.

Eficacitatea analizei PCR în studiul aspirațiilor măduvei osoase la pacienții cu febră de origine necunoscută a fost demonstrată în cazurile de tuberculoză suspectată. Pentru a diagnostica limfadenita tuberculoasă, au fost studiate la copii 102 de aspirații de puncție și o probă de biopsie de 67 copii cu limfadenită tuberculoasă suspectată. Au fost obținute rezultate pozitive: 71,6% PCR în timp real. Fluorescență microscopie - 46,3%. Cercetare în domeniul culturii - 41,8%. În studiul a 50 de biopsii cu nodul limfatic la pacienții cu boala "zgârieturilor pisicii", toate rezultatele au fost negative. Astfel, a fost demonstrată specificitatea de 100% a analizei PCR. În aceeași lucrare, cu biopsie punctiformă a ganglionilor limfatici, sa demonstrat posibilitatea de detectare a M. Avium.

Diagnosticarea tuberculozei infertilității în zona genitală a femeii, după cum se știe, este una dintre cele mai dificile probleme ale diagnosticului. Când a fost examinat prin biopsii PCR ale endometrului, aspiratele endometrial probe lichide din spațiul Douglas 14 (56%) din 25 de pacienți suspectați examinate laparoscopic tuberculoza, au fost obținute rezultate pozitive. Folosind microscopia și cultura de frotiu, au fost obținute 1 și, respectiv, 2 rezultate. Aceste cazuri au fost de asemenea PCR pozitive. Majoritatea rezultatelor PCR pozitive au fost legate de cazuri cu semne caracteristice ale tuberculozei conform studiului histologic; un număr mai mic - cu suspiciune de tuberculoză conform datelor laparoscopice. Numai un rezultat pozitiv al analizei PCR a fost obținut în absența datelor laparoscopice pentru tuberculoză.

La diagnosticarea formelor extrapulmonare de tuberculoză, clinicienii au adesea o întrebare cu privire la posibilitatea de a detecta un agent patogen când se testează probe de sânge prin metoda PCR. Datele literare indică faptul că detectarea ADN din tuberculoza microbacteriană din probele de sânge este posibilă cu forme de infectare cu HIV. ADN-ul de Mycobacterium tuberculosis a fost detectat numai cu tuberculoză generalizată a diferitelor organe la pacienții cu rinichi transplantat și imunosupresie.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Identificarea speciilor de micobacterii

Metoda PCR poate fi destul de eficient pentru identificarea rapidă a micobacteriilor complexului tuberculozei și a unor specii de nontubercular micobacterii în urma creșterii lor inițială. În acest caz, utilizarea PCR poate economisi 7-10 zile, necesară pentru identificarea culturală ulterioară a unui rezultat pozitiv. Testul PCR este foarte simplu din punct de vedere tehnic, deoarece nu necesită prepararea complicată a probei a materialului clinic pentru a atinge o sensibilitate ridicată. In studiul 80 pozitiv în acest sistem de testare (compania MB Vasto. Organon) toate culturile pozitive ale PCR au fost strict specifice și a avut loc timp de 1 zi. Pentru a identifica alte specii de micobacterii în prepararea ADN-ului culturii patogen hibridizate cu sonde ADN specifice marcate cu acridină și tulpinile detectate prin apariția chemoluminescente prin fâșii chemiluminometru sau nitroceluloză cu o evaluare vizuală după hibridizare. Cu ajutorul unui astfel de set, se identifică un număr limitat de specii: complexul mycobacterium tuberculosis. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii și M. Gordonae.

A.Telenti și colab. De asemenea, a dezvoltat o metodă relativ simplă și necostisitoare de identificarea speciilor de specii importante clinic ale micobacterii prin PCR și tratamentul ulterior cu două enzime de restricție (enzime având proprietăți taie o moleculă de ADN la anumite puncte). Fragmentul ADN este amplificat. Care codifică o proteină de șoc termic (65 kDa), și apoi se tratează în fragmentul de ADN PCR 439 de perechi de nucleotide separat două enzime rezultat - BstE II și III Hae. Apoi a analizat utilizând electroforeza în gel de agaroză a obținut două produse, determinarea dimensiunii lor (numărul de perechi de baze), folosind un set standard de fragmente de ADN (moleculare ADN-markeri) in lungime de la 100 la 1000 de perechi de baze. In fiecare dintre tipurile specifice (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) detecta două sau trei fragmente de ADN de dimensiuni diferite pentru fiecare enzimă de restricție. Combinația de dimensiuni diferite de ADN obținută permite diferențierea acestor specii între ele.

Se dezvoltă tehnologia microarray-urilor biologice ale ADN-ului. Care va ajuta la identificarea a mai mult de 100 de specii de micobacterii intr-un studiu.

Identificarea speciilor poate fi de asemenea realizată prin amplificarea prin PCR a regiunii variabile rRNA 16S urmată de secvențierea ampliconului în comparație cu structura primară corespunzătoare, care permite identificarea a mai mult de 40 de specii de micobacterii.

Cu ajutorul PCR, se poate realiza și identificarea unei specii în complexul mycobacterium tuberculosis, incluzând diferențierea M. Bovis și M. Bovis BCG. Pentru a face acest lucru, se analizează prezența sau absența unor gene în regiunile genomice ale RD1. RD9 și RD10. RD1 este absent în M. Bovis BCG, dar este prezent în specii virulente, incluzând M. Bovis.

Determinarea sensibilității la medicament a Mycobacterium tuberculosis prin PCR

Obiectivele metode genetice moleculare pentru sensibilității la medicament sau rezistența la Mycobacterium tuberculosis reduce identificarea mutațiilor în secvențele de nucleotide specifice de gene cunoscute. Metode de bază se bazează fie pe prochityvanii directe (secvențiere) a acestor secvențe după amplificarea sau hibridizarea fragmentelor de ADN marcat cu biotină amplificate în timpul probelor de ADN PCR. Ambele alternative implică identificarea substituțiile de nucleotide în secvențele care utilizează sonde ADN duc la absența sau hibridizare incomplet la o membrană de nitroceluloză utilizând conjugat enzimă (streptavidin-fosfatază alcalină) - Metoda lipa-Rif-TB.

Metoda pentru măsurarea fluorescenței într-un fixat local pe microsections ADN sonde complementare cu mutatii cunoscute in regiunile genei PCR amplificate responsabile pentru rezistenta sau sensibilitatea la medicamente, numit mikrobiochipov metoda. Algoritmul principal pentru realizarea acestei cercetări este după cum urmează. După izolarea ADN-ului dintr-o probă clinică sau cultura micobacteriilor este necesară realizarea amplificării PCR a fragmentelor relevante ale genei rpoB responsabile pentru sensibilitatea la medicamente la rifampicina sau gene katG și INHA care codifică proteinele de Mycobacterium sunt responsabile pentru sensibilitatea la izoniazida. Rezultatele PCR au fost evaluate prin electroforeză în gel de agaroză, în care confirmă primirea fragmentelor de ADN corespunzătoare din lungimea dorită. Apoi, o a doua rundă de PCR este efectuată pentru a introduce o etichetă fluorescentă în ADN. Rezultatele PCR sunt confirmate din nou prin electroforeză pe gel. După aceea, hibridizarea a fost realizată (incubarea peste noapte), urmată de spălarea materialului rezultat pe biochip, care este un număr mare de fixat într-o placă de sticlă mică spiralele ADN scurte (sonde), care sunt complementare la secvențe de nucleotide de tip Mycobacterium tuberculosis sensibile la droguri, la punctele de mutatii posibile. Precum și la secvențele mutante responsabile pentru rezistența la medicament. Amplasarea sonde de ADN de pe placa - definite strict, iar nivelul de fluorescență observată la hibridizare pentru a determina rezultatul cu ajutorul unui dispozitiv special de citire este instalat. În acest sens, rezultatele analizei sunt determinate prin intermediul unui program informatic special.

În ultimii ani, au fost dezvoltate metode alternative pentru determinarea sensibilității la medicament a tuberculozei micobacteriene pe baza tehnologiei PCR în timp real, ceea ce face posibilă efectuarea acestor studii într-un test cu tub închis.

În Fig. 13-13 arată rezultatul analizei izolate clinice de Mycobacterium tuberculosis în determinarea rezistenței la rifampicină prin PCR în timp real: 218 - proba martor (sensibil la rifampicină); 93 - control pozitiv pentru mutația Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - control pozitiv pentru mutația Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - probe experimentale. Rezultatul calculului curbelor cinetice de amplificare pe 4 canale: canalul 1: 393 - control pozitiv pentru mutația Ser-Trp TCG-TGG; canalul 2: 4482 - control pozitiv pentru mutația Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - probe experimentale; canalul 4: curbe cinetice de amplificare a tuturor probelor care participă la experiment. Control pozitiv al reacției de amplificare. Concluzii: Pe baza rezultatelor analizei, au fost identificate următoarele mutații care determină rezistența la rifampicină: în probele 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. Același principiu a fost utilizat pentru a determina rezistența medicamentului la izoniazid pentru genele katG și inhA, care determină cele mai frecvente mutații.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Identificarea tulpinii de tuberculoză mycobacterium

Cel mai studiat minuțios metoda de identificare a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis este o tehnică numită restricție polimorfismul lungimii fragmentelor (RFLP RFLP,. Sau în versiunea în limba engleză) și care se bazează pe fragmentirovanin (restricție) a enzimei ADN de Mycobacterium tuberculosis Pvull și fragmentele obținute de hibridizare ulterioară cu anumite secvențe specifice de ADN elementul său repetat IS6110. Variabilitatea intraspecifică se realizează datorită numărului diferit de repetări ale IS6110 și localizării acestora pe ADN. Precum și varietatea distanțelor dintre anumite puncte de atac ale enzimei de restricție (situsuri de restricție) și elementul IS6110. Această tehnologie este foarte complicată și consumatoare de timp. După tratamentul cu ADN-ul extras dintr-o cultură de Mycobacterium tuberculosis, electroforeză în gel este efectuată cu o enzimă de restricție, și apoi transferat fragmente ADN de diferite lungimi pe o membrană de nitroceluloză, hibridizare a fost efectuată cu fragmente de IS6110 element și detectat prin intermediul unor reacții enzimatice. Forma specifică a benzilor care rezultă caracterizează ADN-ul unei tulpini specifice de Mycobacterium tuberculosis. Cu ajutorul analizei computerizate, se dezvăluie identitatea sau conexiunea tulpinilor. În ciuda faptului că metoda RFLP este cea mai discriminatorie, adică identifică cel mai mare număr de diferențe în tulpinile analizate, este ineficient pentru un număr mic (mai mic de 5) IS6110-repetiții observate în unele tulpini. În Fig. 13-14 prezintă rezultatele tipăririi RFLP a tulpinilor.

O alternativă poate fi metoda de copigotipare - analiza polimorfismului secvențelor de ADN - intermediar între repetițiile directe ale regiunii DR. Atunci când se efectuează combinarea tulpinilor, PCR se efectuează cu primeri care leagă regiunea DR, după care se formează fragmente de lungime diferite care hibridizează cu regiunile intermediare variabile ale ADN-ului. Este prezentată analiza secvențelor de distanțiere ale regiunii DR. Conform cercetătorilor, mai simple, mai productive și mai potrivite pentru screening-ul primar al tulpinilor și analizelor preliminare epidemiologice, precum și pentru cercetarea directă a materialelor clinice.

Evident, o metodă mai eficientă și mai accesibilă din punct de vedere tehnologic este VNTR (abrevierea cuvintelor în limba engleză) sau o metodă pentru determinarea numărului variabil de repetări tandem precise în ADN-ul de Mycobacterium tuberculosis. Această metodă se bazează numai pe utilizarea PCR și nu necesită manipulări suplimentare. Deoarece numărul de repetări tandem în tulpini diferite și în diferite loci este diferit, se determină fragmente de diferite mărimi și se analizează pe electroforegrama rezultată a produselor PCR. Potrivit cercetătorilor, utilizarea VNTR realizează un grad mai mare de discriminare a tulpinilor decât prin metoda RFLP.

O atenție deosebită a fost acordată în ultimii ani distribuției de tulpini de Mycobacterium tuberculosis din familia W-Beijing (numită uneori tulpina din Beijing), care sunt în mare parte rezistente la droguri.

Cerințe de bază privind calitatea cercetării biologice moleculare

[72], [73], [74], [75],

Documente de reglementare de bază pentru PCR

Comenzi de Ministerul rus al Sănătății: №45 din 02.07.2000 g .. Numărul 109 din 21.03.2003 g .. Numărul 64 din 21.02.2000, liniile directoare: 1.3.1888-04 „Organizarea lucrărilor în studii care utilizează materiale PCR infectate cu biologice patogene agenți ai grupurilor III-IV de patogenitate "; 1.3.1794-03 "Organizarea muncii în studiul materialului PCR, infectat cu microorganisme din grupele de patogenitate I-II". 2003.; 3.5.5.1034-01 „Decontaminarea materialului, infectate bacterii patogene grupele I-IV atunci când se utilizează PCR,“ 2001 Anexa 11 la instrucțiunile unificate pentru metodele de examinare microbiologice în identificarea, diagnosticarea și tratamentul tuberculozei.

[76], [77], [78]

Personalul

Executarea cercetării biologice moleculare poate deține medicii de diagnostic clinic de laborator, medici bacteriologi, virusologi, medici, biologi, laborator clinic de diagnostic, precum și specialiști cu studii medii medicale, a trecut de specializare și instruire avansată în modul prevăzut.

Amenajarea spațiilor de laborator

Sunt necesare următoarele încăperi de laborator:

• Zona de manipulare a probelor este un laborator adaptat pentru a lucra cu agenți infecțioși din grupurile de patogenitate III-IV, conform Instrucțiunilor Metodice 13.1888-04.
• Zonă pentru prepararea amestecurilor de reacție PCR - cameră de laborator, care asigură protecție împotriva contaminării interne a laboratorului - zonă "curată".
• • Dacă se utilizează electroforeză sau hibridizare pentru a analiza produsele PCR. Cameră de laborator în care fragmentele de ADN multiplicate sunt extrase din tuburi și amplificarea, respectiv, pot ajunge în mediul înconjurător, în conformitate cu cerințele pentru laboratoarele de PCR (1.3.1794-03 Orientări, orientare 1.3.1888-04) trebuie să fie pe deplin este izolat de spațiile indicate în paragrafele anterioare. Ar trebui să fie excluse din zona de circulație a electroforeză a zonei pentru manipularea probelor și o zonă „curată“ oricărui personal, echipament, orice materiale și obiecte, precum și transferul de aer prin sistemul de ventilație, sau ca urmare a unor proiecte. Această zonă nu este necesară pentru detectarea fluorimetrică a produselor PCR.
• Sala de documentare și prelucrare a rezultatelor este dotată cu calculatoare și echipamente de birou necesare. Această cameră poate conține echipamente care asigură detectarea produselor PCR fără a deschide tubul. - detectori fluorescenți PCR și cicluri termice pentru PCR în timp real.

Cerințele sanitare și epidemiologice pentru tratamentul primar al sputei sunt similare cerințelor microbiologice standard pentru tratarea tuberculozei cu micobacterii.

[79], [80], [81], [82],

Finalizarea echipamentului de laborator pentru diagnosticarea PCR

Laboratorul include echipamente pentru următoarele încăperi.

• cameră pentru prepararea probelor, conține următorul echipament: laminar din clasa II de protecție "SP-1.2": termostat solid cu capac de încălzire pentru eprubete de tip "Eppendorf"; microcentrifuga la 13000 rpm; o centrifugă (Vortex); frigider cu un interval de temperaturi de la -20 ^{până la} C 10 până la ^aproximativ C; pipete cu volum variabil din seria "Rroline"; o pompă cu un flacon OM-1; un trepied pentru pipeturi; trepied stație de lucru 200x0,5 ml; trepied stație de lucru 50x1,5 ml; Suporturi pentru depozitarea tuburilor de test 80x1,5 ml;
• Sala de preparare a amestecului de reacție: cameră de protecție PCR-box ("Laminar-C, 110 cm); centrifugă - Vortex; Pipete cu volum variabil din seria Proline; un trepied pentru pipeturi; trepied stație de lucru 200x0,2 ml; Suporturi pentru depozitarea tuburilor de test 80x1,5 ml; frigider cu un interval de temperatură de la -20 ^о С la + 10 ^о С;
• cameră pentru electroforeză: cameră pentru electroforeză orizontală; sursa de alimentare; transiluminator;
• Amplificatoare de ADN sau analizor de acid nucleic (PCR în timp real) cu un calculator și software; pot fi plasate în orice cameră de rezervă. Dacă se utilizează tehnologia PCR în timp real. Nu este necesară o cameră pentru electroforeză.

[83], [84], [85], [86]

Controlul extern al calității

Pentru a avea încredere în obținerea de rezultate fiabile în mod obiectiv, laboratoarele ar trebui să participe la sistemul de evaluare externă a calității cercetării de laborator.

Participanții la sistemul de control al calității primesc; 12 flacoane cu suspensii de celule bacteriene liofilizate, dintre care două conțin E. Coli E. COIR, 3 flacoane cu Mycobacterium tuberculosis (tulpina avirulent) la 10 ² / ml; 3 fiole cu celule de tulpină similară într-o concentrație de 10 ⁴ / ml; 2 fiole cu micobacterii non-tuberculoză M. Avium-intracellulare și M. Kansasii într-o concentrație de 10 ⁵ / ml.

Testele distribuite pentru evaluarea externă a calității sunt testate în prealabil în două laboratoare independente cu o vastă experiență în acest domeniu.

[87], [88]