Celule stem embrionare

Descoperirea celulelor stem embrionare nu a apărut întâmplător, ci a apărut pe terenul pregătit de cercetarea științifică în domeniul biologiei dezvoltării. Termenul „celulă stem” a fost introdus în medicină în 1908 la congresul societății hematologice de la Berlin de către Alexander Maximov în legătură cu celulele hematopoietice. Cu mult înainte de izolarea și producerea de linii stabile de celule stem embrionare pluripotente, celulele stem terato-(embrio-carcinom) au fost utilizate în studiile proceselor de dezvoltare timpurie, cu ajutorul cărora au fost studiate mecanisme necunoscute ale embriogenezei, inclusiv secvența de exprimare a genelor timpurii și produsele proteice ale activității lor.

Dar oare totipotența genomului uman se pierde iremediabil în procesul de evoluție? Nu, iar embriogeneza este o dovadă în acest sens. Dacă este așa, atunci când, în principiu, se va realiza a doua cale a dezvoltării evolutive? Probabil, când omul va intra în spațiu, unde condițiile de mediu vor fi relativ constante pentru o perioadă suficient de lungă. Pierderea țesutului osos (demineralizarea oaselor într-o stare de imponderabilitate), care este supusă foarte lent remodelării și regenerării, poate fi considerată primul pas în procesul de adaptare a omului, ca specie, la existența în condiții spațiale. Cu toate acestea, prețul pentru a doua cale a dezvoltării evolutive va fi altul - prețul pentru revenirea totipotenței și a plasticității absolute la toate celulele va fi sterilitatea. Așadar, în această lume a „cameleonilor evolutivi”, va trebui să ne reproducem fără meioză, prin înmugurire. Dar vom trăi mult timp. Nemurirea telomerazei este nemurirea unei amibe. Într-un organism multicelular, celulele stem sunt substratul longevității cantitative și calitative.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Surse de celule stem embrionare

Astăzi, sursele de celule stem embrionare pentru cercetarea de laborator sunt liniile de teratocarcinom de șoarece (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) și teratocarcinom uman (clona NTERA-2, TERA-2, H-9), precum și liniile ESC Trauneon. Cu toate acestea, disponibilitatea unui pașaport celular detaliat care indică fenotipul imun, rezultatele analizei cromozomiale, profilurile de expresie a ARNm, receptorii expuși și proteinele de semnalizare intracelulară nu compensează deficiențele semnificative ale liniilor ESC de teratocarcinom - pierderea rapidă a totipotenței și imposibilitatea utilizării lor în studiile clinice, în timp ce diferențierea mixtă în cultură face foarte dificilă izolarea unei linii specializate pure dintr-o populație celulară eterogenă. Prin urmare, sursa liniilor ESC create în scopuri clinice este de obicei masa celulară internă a blastocistului, blastomerii individuali ai embrionilor în stadiu de 8 celule, celulele morulei din stadiile ulterioare, precum și celulele germinale primordiale.

Trebuie menționat că celulele teratocarcinomatoase, deși au proprietatea de pluripotență, se caracterizează printr-un potențial pluripotent semnificativ mai mic în comparație cu celulele stem embrionare (ESC). Integrarea lor cu celulele embrionare duce rareori la formarea de himere, care, în plus, nu formează niciodată gameți cu genotipul celulelor teratocarcinomatoase. Se crede că acest lucru se datorează apariției frecvente a anomaliilor cromozomiale în timpul cultivării celulelor teratocarcinomatoase: pierderea cromozomului Y, diverse trisomii, deleții sau translocații.

S-au făcut în mod repetat încercări de izolare a unei linii ESC umane, dar această sarcină nu a fost rezolvată, deoarece blastocitele umane normale sunt dificil de accesat. În plus, frecvența anomaliilor cromozomiale la om este mai mare decât în embriogeneza animală. Marea majoritate a embrionilor umani timpurii obținuți după fertilizarea in vitro prezintă mozaicism cromozomial haotic și adesea au aberații numerice și structurale. Chiar și mai târziu, în stadiul de blastocist, doar 20-25% dintre embrionii umani constau din celule cu un cariotip normal. Era practic imposibil să se utilizeze astfel de embrioni pentru a crea ESC, deoarece zigoții erau de obicei cultivați până la stadiul de doi sau patru blastomeri și apoi transplantați în uter. Abia relativ recent a fost dezvoltată o tehnică fiabilă pentru cultivarea ovulelor umane fertilizate până la stadiul de blastocist. Introducerea acestei tehnici în practica fertilizării in vitro nu numai că a crescut frecvența rezultatelor implantării reușite, dar a făcut și ca blastocitele normale să fie un obiect mai accesibil.

O altă sursă de celule stem pluripotente sunt celulele germinale primordiale, care, spre deosebire de populațiile progenitoare mai avansate ale epiteliului germinal, nu au beta-integrină la suprafață, dar exprimă o activitate ridicată a fosfatazei alcaline. Trebuie menționat că populațiile de celule stem care s-au format din celule germinale primordiale au fost studiate experimental încă din anii 1980. La acea vreme, a fost dezvoltată o tehnică de izolare a celulelor germinale primordiale din rudimentul gonadei embrionului de șoarece. Primele rezultate nereușite ale cultivării celulelor germinale primordiale in vitro au sugerat inutilitatea acestor încercări, deoarece celulele, deși au supraviețuit, nu au proliferat și au murit în prima zi. Ulterior s-a stabilit că celulele germinale primordiale de șoarece se reproduc in vitro numai în prezența factorilor de creștere polipeptidici specifici solubili și legați de membrană în mediul de cultură. Rezultatele numeroaselor studii au arătat că pentru supraviețuirea și proliferarea celulelor germinale primare este necesară prezența nu numai a LIF, ci și a factorilor Steel (SIF) legați de membrană și solubili în mediul de cultură. Aceste peptide sunt produse de celulele somatice ale embrionilor homozigoți pentru mutația Steel, iar una dintre ele este un ligand al proto-oncogenei cKit.

Celulele germinale primare ale mamiferelor și oamenilor au o origine extragonadală și reprezintă sursa dezvoltării clonale a liniei celulare germinale. Originea liniei celulare germinale primordiale, precum și a tuturor țesuturilor embrionare și a mezodermului extraembrionar, este epiblastul (ectodermul primar) embrionilor timpurii, care are o organizare structurală mozaic. Folosind metoda de îndepărtare microchirurgicală a diferitelor părți ale embrionului timpuriu, a fost stabilită o zonă de localizare în epiblastul clonei a precursorilor dedicați ai celulelor germinale primordiale. Folosind rodamină dextran, care a fost utilizat ca marker celular, s-a stabilit că precursorii celulelor germinale primordiale sunt localizați în regiunea proximală a epiblastului, în apropierea ectodermului extraembrionar. Linia celulară germinală primordială provine dintr-o clonă de 45 de celule, a cărei alocare are loc chiar la începutul gastrulației. Apoi clona se segregă, iar în timpul gastrulației celulele germinale primare pătrund în mezodermul extraembrionar și se găsesc la baza rudimentului alantoid, în spatele striei primare. De acolo, celulele germinale primare migrează spre partea ventrală a endodermului intestinului posterior și apoi se deplasează activ de-a lungul mezenterului, populând crestele genitale la sfârșitul migrării. În timpul migrării, precum și în primele 2-3 zile de localizare în rudimentul gonadelor, celulele germinale primare proliferează activ și trec prin opt cicluri replicative. Dacă la începutul migrării există aproximativ 50 de celule germinale primare, atunci în crestele genitale ale embrionilor de șoarece de doisprezece zile de dezvoltare numărul de celule germinale primare depășește 25.000.

Similitudinea funcțională a ESC-urilor și a celulelor germinale primordiale este evidențiată prin integrarea completă a acestora din urmă în blastocist, cu înlocuirea masei celulare interne și dezvoltarea ulterioară completă a embrionului, ale cărui țesuturi constau doar din descendenții celulelor germinale primordiale. În alte proprietăți, celulele germinale primordiale de șoarece s-au dovedit a fi, de asemenea, identice cu ESC-urile, demonstrând capacitatea de a se diferenția într-o varietate de direcții, de a forma corpuri embrionare in vitro și de a forma teratoame in vivo atunci când sunt administrate subcutanat șoarecilor imunodeficienți, asemănându-se cu teratoamele testiculare spontane la șoarecii 129/ter.

S-a constatat că atunci când se adaugă în mediu LIF, SIF legat de membrană și SIF solubil, celulele germinale primare izolate de la embrioni de șoarece în vârstă de 8 zile supraviețuiesc și se reproduc în cultură timp de 4 zile, dar apoi mor. Mai mult, perioada în care se observă moartea celulelor germinale primare în cultură coincide cu stadiul de dezvoltare al embrionilor de șoarece (12,5-13,5 zile), când celulele germinale primare femele intră în meioză în rudimentele gonadelor, iar diviziunile mitotice sunt blocate în celulele germinale primare masculine. Cu toate acestea, dacă se adaugă în mediu nu numai factorii de creștere LIF și SIF, ci și FGF2, celulele germinale primare continuă să prolifereze, iar în subculturi se formează colonii de celule capabile să se multiplice chiar și după îndepărtarea factorilor de creștere (SIF și FGF) din mediu. Astfel de celule pot fi cultivate mult timp pe un substrat de fibroblaste embrionare fără adăugarea factorului de creștere solubil LIF. S-a propus ca aceste linii celulare stabile obținute din celule germinale primordiale să fie numite celule germinale embrionare. Acest termen nu este deloc reușit, deoarece este imposibil să se obțină celule germinale embrionare capabile să efectueze etapele ulterioare ale ovogenezei sau spermatogenezei atunci când se cultivă celule EG. Acest lucru se datorează faptului că liniile celulare EG, deși provin din celule germinale primordiale, dobândind proprietățile celulelor stem pluripotente embrionare în cultură, pierd capacitatea de a se angaja în linii germinale. Cu alte cuvinte, celulele germinale primordiale, atunci când sunt cultivate, pierd proprietățile precursorilor gameților și se transformă în celule pluripotente de tip ESC.

S-a observat că teratomele nu apar atunci când celulele EG sunt introduse la șoareci imunodeficienți. Se presupune că pierderea capacității celulelor EG umane de a da naștere la teratom se datorează faptului că aceste linii nu au fost create direct din celule germinale primare cultivate, ci au fost obținute din celule izolate din corpuri embrionare. Prin urmare, este posibil ca acestea să fie descendente ale unor celule pluripotente, dar deja angajate.

Trebuie menționat că există diferențe fundamentale între celulele EG și celulele germinale primordiale. Acestea din urmă nu permit obținerea de embrioni himerici de șoarece, ceea ce indică lipsa capacității celulelor germinale primordiale de a se integra în masa celulară internă sau trofectoderm. Caracteristicile populației de celule germinale primordiale sunt mai asemănătoare cu liniile dedicate de celule somatice ale embrionilor ulteriori, a căror introducere în blastocist, de asemenea, nu duce la formarea de embrioni himerici.

Modificarea tehnicii de cultivare a corpurilor embrionare obținute prin agregarea celulelor EG a făcut posibilă obținerea unei alte populații de celule pluripotente, numite „celule derivate din corpurile embrionare” (celule EBD), utilizând selecția pe medii selective. Capacitatea celulelor EBD de a prolifera în cultură pentru o perioadă lungă de timp a făcut posibilă crearea de linii celulare stabile de celule dedicate. Au fost obținute clone de celule care exprimă o gamă largă de markeri ARNm și proteici ai celulelor specializate. Această abordare a dovedit în cele din urmă că celulele germinale primare umane sunt pluripotente și se diferențiază in vitro în diferite tipuri de celule: neuroni, neuroglie, endoteliu vascular, celule hematopoietice, celule musculare și endodermale.

Surse alternative de celule stem embrionare

O sursă alternativă de linii ESC umane pot fi celulele hibride. Implantarea în uterul vacilor pseudo-gestante a unui construct eterogen obținut prin fuziunea prin electroporare a celulelor somatice ale fătului uman cu un ovul de vacă din care pronucleul a fost îndepărtat în prealabil face posibilă obținerea unei mase celulare interne dintr-un embrion artificial aflat în stadii de dezvoltare pre-implantare. În acest scop, în prima etapă se obține un blastocist dintr-un ovul de vacă cu un nucleu celular uman transplantat.

În a doua etapă, se izolează un embrioblast din blastocist, iar din acesta se izolează celulele stem embrionare (ESC) folosind metoda Thomson. Este demn de remarcat faptul că cele mai bune rezultate în izolarea liniilor ESC folosind această metodă au fost obținute folosind nuclei de celule foliculare sau celule germinale primare care rămân în corpul uman în stare de hibernare. Acest lucru se datorează faptului că nucleii celulelor umane transplantate într-un ou de vacă trebuie să aibă telomeri nescurtați și o activitate telomeazică ridicată, ceea ce ajută la evitarea îmbătrânirii premature a clonelor ESC obținute dintr-un ou hibrid (Repin, 2001). Se știe că cele mai importante proteine marker intracelulare ale ESC sunt Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, care aparțin așa-numitelor proteine silențioase de cromatină. Silențioasele oferă un pachet deosebit de compact de heterocromatină, care previne formarea buclelor de eucromatină. Ambalarea cromatinei mediată de aceste proteine se corelează cu totipotența genomului ESC. Până în prezent s-a stabilit că ovocitele bovine și umane mature sunt singurul tip de celule specializate care conțin concentrații mari de proteine silențiatoare în citoplasmă. Pe această bază, a fost dezvoltată o metodă pentru obținerea ESC hibride prin transferul nucleilor celulelor somatice în ovocite bovine enucleate. Studiile preliminare in vitro au arătat că citoplasma ovocitelor bovine restabilește totipotența genomului nucleilor celulelor somatice umane după 12-24 de ore de cultivare.

De un interes deosebit sunt datele privind particularitățile dezvoltării preimplantatorii a embrionilor umani, indicând o înlocuire ulterioară a celulelor totipotente cu o populație de celule pluripotente decât la șoareci. Un studiu al transformărilor celulare a arătat că celulele trofoblastice apar și din celulele masei celulare interne a blastocistilor umani, pe lângă celulele stem embrionare stem (ESC), ceea ce indică potența lor totală.

Se știe că în stadiul de blastocist apar două populații celulare cu angajamente diferite. Una dintre ele formează stratul exterior al blastocistului - trofoectodermul, derivatele acestuia fiind celulele trofoblastice și alte componente embrionare ale placentei. A doua populație de celule este grupată într-o masă densă care intră în contact cu suprafața interioară a trofoectodermului. Derivații populației de celule din masa celulară internă sunt toate țesuturile și rudimentele organelor embrionului. În stadiul de blastocist târziu, din masa celulară internă se formează endodermul extraembrionar și se formează epiblastul (ectodermul primar). În acest caz, celulele epiblastice își păstrează pluripotența, în timp ce capacitatea de diferențiere a celulelor endodermului extraembrionar este limitată.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Obținerea de celule stem embrionare umane

Până de curând, se credea că este imposibil să se obțină celule stem stem din trofoblast. Cu toate acestea, o linie de celule stem diploide din trofoectoderm, izolată dintr-un blastocist, proliferează și se transformă în celule stem într-un mediu care conține FGF2 și heparină în loc de LIF. Dacă FGF2 este îndepărtat din mediu, celulele trofoectodermului încetează să se înmulțească, începe endoreduplicarea cromozomilor în ele, iar elementele celulare ale trofoectodermului se transformă treptat în celule trofoblaste gigantice. Probabil, LIF nu stimulează proliferarea celulelor trofoectodermului datorită faptului că FGF2 declanșează un mecanism de trans-semnalizare diferit, deoarece FGF2, legându-se de receptorul plasmatic (FGFR2), activează kinazele MAP din citoplasmă - ERK1 și ERK2. În consecință, atunci când o cale de semnalizare (LIF - gpl30 - JAK kinaza - STAT3) este activată în celulele blastocistului, celulele masei celulare interne sunt transformate în ESC pluripotente, iar când al doilea mecanism de transducție a semnalului transmembranar (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaza ERK1/ERK2) este activat, în blastocist se formează celule stem trofectodermice. Alegerea căii de semnalizare, la rândul ei, depinde de activitatea genei oct4. Această genă, care aparține domeniului POU, este localizată în locusul t al autosomului 17 și este exprimată în timpul oogenezei, în perioada de clivaj, precum și în celulele masei celulare interne a blastocistului și în celulele germinale primare. Rolul funcțional al genei oct4 este de a codifica un factor de transcripție necesar pentru apariția celulelor pluripotente, diferențierea și dediferențierea acestora.

Expresia genei oct4 în celulele stem embrionare (CSM) variază în funcție de interacțiunea acestui factor de transcripție cu cofactorii. Reglarea direcționată a expresiei oct4 în blastociste a arătat că atunci când activitatea sa este redusă, jumătate din celule formează trofectoderm, în timp ce atunci când expresia indusă a oct4 crește, apar predominant CSM.

În cadrul experimentului, celulele germinale embrionare (CSE) nu pot fi transferate într-o linie în timpul cultivării blastomerilor totipotenți în stadiul de clivaj, precum și în stadiul de gastrulație și în etapele ulterioare ale dezvoltării embrionare. CSE de șoarece sunt de obicei izolate în ziua 3,5-4,5 de sarcină, ceea ce corespunde etapei a șasea (blastocist cu un singur strat) și a șaptea (blastocist cu două straturi - cilindrul ovulului timpuriu) ale embriogenezei normale. Evident, embrionii de șoarece conțin populații celulare capabile să se transforme în CSE. În consecință, izolarea liniilor CSE este posibilă numai în anumite etape ale embriogenezei. Zigotul și blastomerii care apar în timpul clivajului sunt totipotenți, din punctul de vedere al posibilității de a dezvolta un embrion viabil cu membrane embrionare și placentă. Pierderea potenței totale a celulelor germinale începe în stadiul târziu de morulă, când angajarea ulterioară a blastomerilor depinde de localizarea lor. Blastomerele morulei timpurii își păstrează totipotența, deoarece manipulările experimentale cu modificări ale localizării lor, cum ar fi inversarea locației lor, nu împiedică dezvoltarea unui embrion complet.

S-a stabilit că eficiența izolării celulelor stem embrionare (ESC) într-o linie este afectată de starea blastocistelor în momentul explantării lor. Utilizarea blastocistelor după modelarea unei diapauze de șapte zile în tractul reproducător al șoarecilor ovariectomizați în a 3,5-a zi de sarcină și cărora li s-a administrat progesteron facilitează izolarea mai reușită a liniilor de celule stem embrionare. Se presupune că, în astfel de condiții, numărul de blastomeri care formează masa celulară internă crește. De asemenea, este posibil ca ciclul celular să fie prelungit și majoritatea blastomerelor să intre în faza G0.

În plus, crearea unor linii ESC pluripotente stabile depinde de genotipul embrionilor: ESC-urile sunt izolate destul de ușor din blastociștii liniei de șoareci 129, sunt mult mai dificil de obținut folosind șoareci CS7BL/6 și este practic imposibil să se izoleze o linie ESC din blastociștii șoarecilor CBA/Ca. Evident, embrionii timpurii au unele caracteristici genetice care afectează dezvoltarea unei linii ESC pluripotente. Cu toate acestea, la cultivarea epiblastelor izolate, precum și prin selecția selectivă a celulelor diferențiate, liniile ESC au fost totuși izolate din embrionii timpurii ai șoarecilor CBA/Ca.

O tehnică standard dovedită pentru obținerea liniilor ESC din blastociste este prezentată în manualele de laborator privind tehnica experimentelor cu embrioni timpurii. Liniile ESC experimentale pot fi obținute și prin cultivarea epiblastului izolat (ectoderm primar) din embrioni de șoarece în vârstă de 4,5 zile, utilizând o tehnică microchirurgicală destul de complexă și condiții de cultură modificate. Intensitatea muncii acestei proceduri este justificată, deoarece frecvența formării liniilor ESC în acest caz s-a dovedit a fi semnificativ mai mare decât în lucrările cu masa celulară internă a blastocistului.

Pentru a izola liniile ESC, fiecare clonă este transferată într-un microgodeu, se cultivă un agregat de 40-60 de celule și apoi se dispersează din nou. Repetările multiple ale acestei proceduri ne permit să obținem o linie ESC imortalizată cu rata maximă de proliferare a celulelor normocariotipe atașate la plastic, care își păstrează totipotența și activitatea telomerazei ridicată după 50-100 de pasaje. În procesul de menținere a liniilor ESC, cel mai mare pericol este contaminarea mediului sau serului cu endotoxine bacteriene - chiar și urme de endotoxină în mediul de cultură provoacă moartea în masă a celulelor germinale imature. Cu o monitorizare atentă a creșterii liniare și a dispersiei la timp, ESC-urile din cultură sunt capabile de diviziune simetrică, în care ambele celule fiice rămân pluripotente și capabile să efectueze un număr nelimitat de cicluri celulare, menținând un cariotip diploid și o potență totală.

Selecția unei populații pure de ESC umane poate fi efectuată după transfecția genomului lor cu molecule de ADN recombinant care conțin gena care codifică sinteza proteinei fluorescente verzi (GFP). Expresia GFP crește atunci când ESC-urile sunt cultivate în condiții care le susțin proliferarea, în timp ce odată cu debutul diferențierii, nivelul de expresie al acestei gene scade, ceea ce permite selecția unor linii celulare pluripotente pure și stabile pe un mediu selectiv. La cultivarea ESC-urilor izolate folosind selecția GFP, frecvența formării coloniilor crește de multe ori, deoarece efectul antiproliferativ puternic al celulelor diferențiate este eliminat în condițiile culturilor de selecție.

Translația celulelor stem embrionare umane într-o linie se realizează folosind metoda izolării lor din embrionii preimplantatorii (în stadiul de 80-120 de celule), care rămân după procedura de fertilizare in vitro. În acest scop, embrionii „în exces” obținuți artificial sunt dispersați mecanic în mediul Delbecco-Eagle. După marcarea celulelor cu anticorpi monoclonali selectivi cu un marker fluorescent, celulele embrioblastice sunt izolate. Embrioblastul este dispersat în celule individuale folosind un amestec de dispază-colagenază. Celulele disociate sunt cultivate într-un mediu special (80% mediu Delbecco + 20% ser fetal de vițel în prezența a 500 μg/ml IL-6, LIF și SCF) peste un monostrat de fibroblaste embrionare din primele 3 pasaje. În acest caz, supraviețuirea și proliferarea celulelor stem și progenitoare sunt menținute datorită efectului IL-6, LIF și SCF. Într-un astfel de mediu, ESC-urile cresc ca clone în suspensie de celule globuloase neatașate, care trebuie disociate prin pipetare ușoară și repetată. Clone noi apar în cultura suspendată în ziua 5-7. Rata maximă de creștere a ESC-urilor se obține prin disocierea repetată a clonelor în stadiul de 10-15 celule. Apoi, fiecare clonă este transferată într-un microgodeu și crescută până la un agregat de 40-50 de celule. Procedura se repetă de mai multe ori în pasaje, crescând volumul culturii la o densitate de 5-10 milioane de celule pe placă de 6 cm. Folosind o astfel de pasare, Thomson a izolat 10 clone nemuritoare de ESC umane, care după 100 de pasaje au păstrat o activitate telomerazică ridicată, capacitatea de a prolifera viguros, caracteristici fenotipice minime și potență totală, cu capacitatea de a se diferenția în oricare dintre cele 350 de linii celulare specializate derivate din ecto-, mezo- și endoderm. Diferențierea celulelor stem embrionare (ESC) umane a început (la schimbarea mediului, adăugarea de ser și eliminarea LIF) odată cu atașarea celulelor la substrat, indicând dezvoltarea citoscheletului și exprimarea receptorilor de adeziune. Este important de menționat că, odată cu proliferarea nelimitată, ESC-urile umane au păstrat un cariotip normal.

A doua metodă de izolare a liniilor ESC umane se bazează pe utilizarea celulelor germinale primare. Studiile experimentale au arătat că liniile de celule E pot fi obținute din pliurile genitale ale embrionilor de șoarece în vârstă de 12,5 zile. Cu toate acestea, în aceste cazuri, frecvența formării liniilor celulare progenitoare a fost semnificativ mai mică decât în experimentele cu embrioni mai timpurii. În același timp, celulele germinale primare din gonadele embrionilor de șoarece cu vârsta gestațională de 13,5 zile nu sunt capabile să se transforme deloc în linii.

Primele linii stabile de celule EG umane pluripotente au fost obținute din gonocite primare izolate din gonadele embrionilor cu vârsta cuprinsă între 5 și 9 săptămâni. Celulele izolate au fost cultivate pe un substrat de fibroblaste embrionare de șoarece inactivate în mediu DMEM cu ser fetal suplimentat cu mercaptoetanol, forskolină și factori de creștere umani recombinanți (FGF și LIF). După 7-12 zile, în cultură au apărut colonii multicelulare, corespunzătoare celulelor EG umane prin caracteristici morfologice și markeri moleculari. După agregare, aceste celule au format corpuri embrioide, odată cu dezvoltarea ulterioară a cărora au apărut celule specializate caracteristice derivaților tuturor celor trei straturi germinale. Pe parcursul a 10-20 de pasaje, liniile celulare EG au păstrat un cariotip normal și nu și-au pierdut pluripotența.

De asemenea, s-a demonstrat că acțiunea combinată a LIF, a factorilor Steel legați de membrană și solubili și a TGF-β modifică programul de dezvoltare al celulelor germinale primordiale. În loc să înceteze diviziunile mitotice și să înceapă să se diferențieze spre oogeneză sau spermatogeneză, celulele germinale primordiale continuă să prolifereze. După câteva cicluri mitotice suplimentare, acestea devin similare cu celulele epiblastice și, pierzând proprietățile precursorilor celulelor germinale, se transformă în celule stem embrionare pluripotente (EG).

Astfel, în 1998, linii imortalizate de celule germinale primordiale au fost izolate pentru prima dată din rudimentul genital al țesutului autoptic fetal uman. În embriogeneza umană, celulele germinale primordiale apar în sacul vitelin în a 3-a săptămână de dezvoltare, iar în săptămânile a 4-a-5-a, aceste celule migrează în zona tuberculului genital, unde formează populații latente de gonocite primare. Într-o stare inactivă, celulele germinale primordiale sunt conservate în embrion până la naștere. Liniile de celule germinale primordiale sunt izolate din tuberculul genital fetal al embrionilor de 5-9 săptămâni, al cărui țesut extras este tratat ex tempore cu un amestec de colagenaze de tipuri IV-V, hialuronidază și DNază pentru a crește randamentul cantitativ și calitativ al celulelor. Celulele germinale primordiale din țesutul tuberculului genital fetal sunt înconjurate de celule Sertoli stromale (mezenchimale). Scopul funcțional al celulelor Sertoli este de a produce factori antiapoptotici (ligand Fas), mitogeni și imunosupresoare care protejează celulele germinale de atacul imun al organismului. În plus, micromediul stromal al tuberculului genital joacă un rol important în maturarea gameților. Celulele germinale primare izolate sunt plantate în cultură peste un strat stromal hrănitor format din fibroblaste fetale din primele trei pasaje. Cea mai eficientă combinație de mitogeni este un complex format din LIF, FGF și forskolină (un stimulator al formării cAMP). Proliferarea celulelor germinale primare in vitro necesită adăugarea de ser fetal, în prezența căruia reproducerea gonocitelor primare în cultură este însoțită de formarea de clone de celule sferice neatașate la substrat.

La Institutele Naționale de Sănătate din SUA, pe baza unui rezumat al datelor existente privind metodele de izolare a liniilor de celule stem stem umane din blastociste, s-a tras o concluzie preliminară conform căreia izolarea cu succes a celulelor stem stem este cel mai probabilă atunci când se cultivă blastociste cu o masă celulară internă bine formată (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Din acest punct de vedere, sursa optimă de celule stem stem pentru crearea de linii sunt blastociștii umani aflați în a 5-a zi de dezvoltare, din care trofectodermul trebuie îndepărtat cu grijă la izolarea masei celulare interne. Masa celulară internă izolată, formată din 30-35 de celule în acest stadiu, trebuie cultivată pe un substrat de fibroblaste embrionare de șoarece, ceea ce reprezintă o condiție decisivă pentru formarea coloniilor de celule stem stem în cultură.

Analiza caracteristicilor fenotipice ale celulelor stem embrionare

De interes deosebit este analiza comparativă interspecifică a caracteristicilor fenotipice ale celulelor stem embrionare (CSE). S-a constatat că coloniile de CSE umane sunt grupuri dense de celule aplatizate, de tip epitelial, în timp ce corpurile embrionare de șoarece constau dintr-un conglomerat lax de celule rotunjite. În CSE umane, indicele raportului nucleu-plasmă este mai mic decât în CSE de șoarece. Celulele stem embrionare ale maimuțelor formează colonii mai plate de celule cu margini neuniforme. Celulele individuale sunt ușor vizibile în clonele timpurii ale CSE de primate. CSE proliferative ale tuturor speciilor de animale studiate nu exprimă molecule MHC clasa I și II. În același timp, CSE umane dau o reacție pozitivă la anticorpii TERA 1-60 și GCTM-2, ceea ce indică prezența proteoglicanilor keratină/condroitină sulfat pe suprafața lor, caracteristice celulelor stem embrionare-(terato)-carcinom. Expresia genei oct4 în celulele stem embrionare (CSE) ale tuturor speciilor de animale sugerează că, în ciuda diferențelor fenotipice, același set de gene responsabile pentru menținerea pluripotenței este aparent activat în CSE umane și de șoarece (Peru, 2001). În plus, liniile CSE izolate de la embrioni de șobolan, porc, iepure, primate și bovine au caracteristici morfologice similare, un set similar de markeri de identificare moleculară și un mecanism molecular aproape identic pentru implementarea programelor de embriogeneză, ceea ce ne permite să aruncăm o nouă perspectivă asupra problemei xenotransplantului.

Spre deosebire de embriogeneza normală in vivo, proliferarea ESC in vitro nu este însoțită de formarea straturilor germinale și are loc pe fondul blocării genelor Hox homeotice, adică fără organogeneză. Deoarece genele de segmentare nu funcționează, este imposibil să se reproducă în cultura ESC perioade ale embriogenezei precum depunerea somitelor, segmentarea embrionilor, formarea sacului vitelin, alantoidei și a altor organe și țesuturi provizorii. ESC cultivate par să fi înghețat la începutul procesului de formare a 350 de linii de restricție de celule specializate. Astfel, o clonă de celule progenitoare fiice și o ESC localizată central reprezintă doar un model de embrion, în timpul dezvoltării căruia se formează simultan diferite linii de celule specializate în diferite regiuni tisulare, care, totuși, provin din precursori comuni. În ciuda nivelului minim de receptori de pe suprafața ESC, acestea își păstrează capacitatea de a desfășura procese morfogenetice primitive, imitând structurile volumetrice ale unui embrion timpuriu: o suspensie de ESC în cultură se agregă și formează structuri asemănătoare blastocistelor sau chiar embrionilor ulteriori (cilindri de ou). Astfel de agregate în suspensie se numesc, respectiv, corpuri embrioide simple și complexe.

În diferențierea mixtă, genele timpurii ale ectodermului (oct3, fgf-5, nodal), endodermului (gata-4), mezodermului (brachiurie), mezodermului cardiogen (pkh-2.5), tubului neural (msx3) și hematopoiezei (elkf) sunt exprimate simultan în diferite celule ale aceluiași corp embrionar. Folosind diverse combinații de factori de creștere și citokine pentru acțiunea țintită asupra formării celulelor stratului germinativ in vitro, a fost posibil în mai multe cazuri să se obțină corpuri embrionare în care genele ectodermului sau mezodermului au fost exprimate preferențial, ceea ce deschide calea către modelarea gastrulației și a fazelor inițiale ale organogenezei.

Creșterea clonală a celulelor stem embrionare (CSE) este o dovadă a diviziunii celulare asimetrice, în care doar o CSE din centrul clonei păstrează un potențial de proliferare nelimitat, în timp ce a doua celulă fiică generează o generație de celule progenitoare care sunt deja în curs de diferențiere. Prin urmare, rata de proliferare a clonei la periferia corpului embrionar este mai mare decât în centru. Celulele marginale ale clonei în creștere suferă o diferențiere dezordonată spontană, migrează sau mor prin mecanisme apoptotice. Aceste evenimente determină soarta clonei: dacă rata de proliferare depășește rata de migrare și moarte celulară apoptotică, clona continuă să crească în dimensiune, stabilizarea are loc atunci când rata de apoptoză și rata de formare a celulelor noi sunt egale, iar regresia are loc atunci când raportul acestor procese este invers. Celulele progenitoare se divid simetric, adică ambele celule fiice se diferențiază ulterior în linii celulare specializate mature. Raportul dintre CSE și celulele progenitoare variază, dar numărul de CSE este întotdeauna doar o fracțiune de procent din populația de celule progenitoare. Prin urmare, doar pipetarea atentă și dezagregarea la timp a clonelor pot crește numărul de CSE din cultură. Dezagregarea clonelor în stadiul de 10-12 celule s-a dovedit a fi cea mai eficientă pentru obținerea randamentului maxim de ESC. Direcția și gradul de diferențiere a celulelor din corpul embrionar depind de locația lor. Celulele externe ale corpului embrionar nu exprimă gena oct4 și se diferențiază în celule ale endodermului primar, din care se formează ulterior celule epiteliale ale endodermului extraembrionar parietal și visceral. Celulele interne ale corpului embrionar exprimă gena oct4 și își păstrează pluripotența timp de 48 de ore de cultivare. Cu toate acestea, cultura este apoi restructurată morfologic într-un monostrat epitelial și începe exprimarea genelor care controlează dezvoltarea ectodermului primar. În continuare, începe procesul de citodiferențiere totală dezordonată, odată cu apariția diferitelor tipuri de celule care sunt derivate din toate cele trei straturi germinale. În procesul de diferențiere spontană a celulelor corpului embrionar, primele care apar sunt agregatele cu markeri endodermici sub formă de fragmente (chisturi) ale sacului vitelin. Apoi, în aceste structuri apar angioblaste și celule endoteliale ale capilarelor în creștere. În stadiile finale ale diferențierii spontane, din celulele interne ale corpului embrionar se dezvoltă diverse celule diferențiate terminal, inclusiv neuroni, elemente gliale, cardiomiocite, macrofage și eritrocite. Într-o anumită măsură (ținând cont de inversiunea spațială a formării straturilor de țesut germinativ), folosind corpuri embrionare, este posibil să se studieze procesele morfogenetice in vitro și să se analizeze mecanismele moleculare ale perioadelor inițiale de citodiferențiere embrionară.precum și pentru a stabili rolul unor gene specifice în implementarea acestor procese.

Astfel, în cadrul clonei există celule în care au fost descoperite diferite programe de dezvoltare genetică - ESC-uri, progenitori timpurii și populații de progenitori diferențiate. Cultivarea ESC-urilor prin metode de cultură în masă sau prin metoda picăturii suspendate, fără un strat hrănitor și fără adăugarea de LIF în mediu, duce inevitabil la formarea corpurilor embrioide. Morfologia celulelor din straturile exterioare și interioare ale corpurilor embrioide diferă. Stratul exterior este format din celule mari, ramificate. Suprafața lor orientată spre mediu este acoperită cu numeroși microvilii. Stratul exterior de celule este separat de stratul interior printr-o membrană bazală asemănătoare membranei lui Reichert, în timp ce celulele stratului interior al corpurilor embrioide sunt epiteliu columnar. Morfologic, stratul interior, deși conține multe celule care se divizează, seamănă mai mult cu coloniile nediferențiate de ESC-uri.

Caracteristicile celulelor stem embrionare umane

Absența interacțiunilor de semnalizare parenchimato-mezenchimale pe fondul blocării genelor homeotice duce la o creștere dezordonată a ESC-urilor în cultură, deoarece aceasta perturbă formarea și dezvoltarea infrastructurii organelor provizorii. Creșterea dezorganizată și diferențierea spontană dezordonată a ESC-urilor în cultură se datorează absenței marcajului mezenchimal al cadrului stromal al organelor viitoare: in vitro, este foarte posibil să se formeze milioane de hepatocite, dar este imposibil să se obțină un singur lobul hepatic care să includă elemente structurale și funcționale precum sinusurile, spațiile Disse și celulele Kupffer.

Se crede că pluripotența celulelor stem embrionare (CSE) se realizează exclusiv în embriogeneză, odată cu formarea țesuturilor și organelor embrionare, în timp ce placenta și cordonul ombilical sunt derivate ale trofoblastului. CSE închise în membrana trofectodermală generează secvențial clone de celule provizorii care implementează programul de dezvoltare prin ARNm combinatorial al matricei topografice volumetrice Nokhteyov, care predetermină aranjamentul spațial, forma și dimensiunea, numărul de celule ale organelor provizorii și definitive, precum și asamblarea parenchimului în unități structurale și funcționale. În același timp, CSE rămân singurul tip de celule în care mecanismul molecular pentru implementarea potenței lor este complet deconectat de programul de dezvoltare genetică, iar CSE în sine sunt private de capacitatea de a interacționa cu alte celule din cauza blocării atât a percepțiilor receptorilor, cât și a sistemelor de transsemnalizare. Cu toate acestea, activarea adecvată a CSE duce la o dezvoltare pas cu pas a programului de embriogeneză, care se încheie cu nașterea unui organism complet format, format din miliarde de celule, pregătit pentru viața extrauterină. Pe această cale pe termen scurt, dar de neimaginat de lungă, în spațiul celular, apar inevitabil erori atât în mecanismele moleculare care asigură activitatea vitală a celulelor, cât și în programele care controlează proliferarea, diferențierea și specializarea acestora. Prin urmare, în farmacogenomica modernă, bolile structurii moleculare și bolile programării celulare sunt considerate separat. Mai mult, acțiunea majorității medicamentelor noi vizează corectarea programelor de diferențiere, proliferare și organogeneză, precum și regenerarea organelor și țesuturilor. Într-un organism adult, celulele stem stem (ESC) permit controlul comportamentului celulelor stem/progenitoare transplantate în creier, ficat, splină, măduvă osoasă și alte organe umane pentru a restabili parenchimul deteriorat al organelor receptorului prin diferențierea și specializarea celulelor donatoare pe matricea mezenchimală conservată. În esență, programul de totipotență începe să se realizeze la nivelul genomului ovocitului, zigotului și blastomerului; cu toate acestea, aceste celule nu au fost încă clonate și pasate în cantitățile necesare pentru nevoile medicinei experimentale și practice. Prin urmare, celulele stem embrionare (ESC) rămân o sursă unică de informații genetice, conținând coduri pentru o hartă tridimensională a embrionului și coduri pentru restricția liniară a liniilor celulare specializate în timpul gastrulației.

Potențialul regenerativ practic nelimitat al celulelor stem embrionare (ESC) se datorează faptului că genomul lor, spre deosebire de aparatul genetic al celulelor somatice diferențiate, își păstrează pluripotența. Una dintre manifestările stării latente a informației genetice încorporate în ESC este așa-numitul fenotip minimal - un număr limitat de receptori sunt exprimați pe suprafața ESC și, în consecință, foarte puține programe de transsemnalizare sunt implementate pentru interacțiunea aparatului nuclear al celulei cu micromediul său. Pe fondul hibernării genelor responsabile de restricționarea liniilor celulare specializate și diferențierea celulară, doar aproximativ 30 din 500 de gene sunt activate, ale căror produse asigură conexiunea celulei cu micromediul înconjurător. Folosind metoda analizei seriale a expresiei genelor, s-a demonstrat că, odată cu activitatea comună a principalelor compartimente funcționale ale genomului care reglează energetica și metabolismul în celulele somatice și ESC, acestea din urmă au un nivel foarte scăzut de ARNm al receptorilor, proteinelor G, mesagerilor secundari, transcriptazelor, cofactorilor de expresie și represie, adică întregul sistem de transmitere transmembranară a semnalului de reglare către celulă. Acest lucru se datorează absenței sau expresiei foarte scăzute a genelor de transsemnalizare. În perioada de diferențiere indusă în genomul ESC, 18 gene funcționale își încetează activitatea sincron pe fondul activării a 61 de gene de transsemnalizare care controlează sinteza receptorilor de adeziune celulară, a componentelor matricei extracelulare, a transcriptazelor de restricție și a elementelor mesagere ale sistemului de transmitere a semnalului către aparatul nuclear de la receptorii membranei plasmatice celulare. În același timp, este blocată expresia genelor responsabile de sinteza proteinelor silențioase, precum și a co-inhibitorilor expresiei genelor care asigură totipotența genomului ESC.

Markeri genetici au fost găsiți pentru celulele tuturor celor trei straturi germinale. Identificarea stratului celular ectodermal se realizează prin exprimarea genelor nodale, oct3 și fgf-5, a celulelor mezodermice - prin genele brahiuriei, zeta-globinei, iar a endodermului - prin exprimarea genei gata-4. În embriogeneza normală, în perioada de gastrulație, se observă migrarea activă a populațiilor imature de celule stem și progenitoare, marcând local zonele de dezvoltare ale oaselor faciale ale craniului, unele părți ale creierului, sistemul nervos periferic, sistemul de conducere cardiacă și timusul, ale căror țesuturi sunt formate din clone de celule migrante. Marcarea celulelor prin gene timpurii ale straturilor germinale facilitează sarcina analizei topografice a proceselor de migrare a celulelor precursoare în embrionul în curs de dezvoltare. S-a stabilit, în special, că în agregatele de celule de embriocarcinom P19, expresia primei gene de mezoderm brachiurie începe în perioada de scădere a expresiei genelor activatorului tisular al plasminogenului, α-fetoproteinei, keratinei 8 și keratinei 19, care sunt markeri ai primelor populații de mezoderm migratoare. În consecință, formarea țesuturilor de origine mezodermică începe numai după finalizarea procesului de migrare punctuală și dispersare a celulelor progenitoare mezodermale.

În ciuda caracteristicilor fenotipice extrem de limitate și a absenței majorității unităților de transsemnalizare, ESC-urile exprimă încă unele molecule receptor care pot fi utilizate pentru identificarea lor. Este demn de remarcat faptul că antigenele marker ESC la oameni și primate s-au dovedit a fi comune. Cel mai adesea, pentru marcarea ESC se utilizează anticorpi marcați împotriva antigenelor legate de membrană SSEA-3, SSEA-4 (antigene lipidice unice reprezentând un complex de glicolipid GL7 cu acid sialic), precum și glicoproteine cu polimeri de înaltă calitate TRA-1-81, TRA-1-60. În plus, ESC-urile exprimă antigenul embrionar specific SSEA-1 și fosfataza alcalină endogenă, precum și factorul de transcripție specific Oct4. Acesta din urmă este necesar pentru menținerea mecanismelor de proliferare a ESC - factorul de transcripție specific Oct4 activează expresia genei factorului de creștere a fibroblastelor 4 și stabilizează expresia cutiei de gene responsabile de replicarea nelimitată a ADN-ului în celulele imature. Cele mai importante proteine marker intracelulare sunt Oct3, Oct4, Tcf și Groucho, care sunt înrudite cu proteinele silențioase ale cromatinei.

Aproape imediat după mulți ani de încercări de cultivare a ESC-urilor în afara corpului, care au avut succes și au fost obținute primele culturi de celule stem izolate din blastociste de șoarece și culturi de celule germinale primare, a început o etapă de cercetare a potențialului pluripotent al ESC-urilor, odată cu introducerea acestora în embrioni în stadii incipiente de dezvoltare. S-a demonstrat că în stadiile de morulă și blastocist, ESC-urile sunt capabile să formeze embrioni himerici, în care descendenții ESC-urilor donatoare sunt detectați în toate țesuturile somatice și chiar în gameți. Astfel, în biologia dezvoltării, folosind ESC-uri, s-a stabilit o „punte” între studiile experimentale in vivo și in vitro, ceea ce a extins semnificativ posibilitățile de studiere a proceselor de depunere a țesuturilor și organelor primare, a diferențierii acestora și a organogenezei embrionare.

Este clar stabilit că in vivo, în timpul embriogenezei, celulele stem embrionare (CSE) sunt integrate în masa celulară a embrionului timpuriu, iar derivații lor se găsesc în toate organele și țesuturile. CSE colonizează o linie de celule germinale în embrionul himeric, ai căror descendenți formează ovule și spermatozoizi completi. Celulele stem embrionare sunt clonogene - o singură CSE este capabilă să creeze o colonie de celule identice genetic cu markeri moleculari, care includ exprimarea genei oct4 și a fosfatazei alcaline, activitate telomerazică ridicată și exprimarea anumitor antigene embrionare.

Pentru a studia mecanismele embriogenezei folosind celule stem embrionare (CSE), a fost dezvoltată o metodă de himerizare a morulei prin crearea unui construct biologic, în exteriorul căruia există un strat de blastomeri tetraploizi receptori, iar în interior sunt introduse CSE donatoare. Astfel, trofoblastul este format din descendenții blastomerilor tetraploizi ai receptorului, ceea ce asigură implantarea și placentarea, iar CSE donatoare acționează ca o masă celulară internă din care se formează corpul unui embrion viabil și o linie de celule germinale progenitoare primare. Valoarea de cercetare a CSE constă nu numai în faptul că pluripotența este păstrată în timpul manipulărilor in vitro cu genomul lor, ci și în faptul că este păstrată capacitatea CSE de a participa la formarea celulelor germinale primare ale unui embrion himeric. S-a demonstrat că descendenții unei singure CSE modificate genetic populează toate rudimentele primare și țesuturile în curs de dezvoltare ale unui embrion himeric obținut prin agregarea sau cocultivarea acestei celule cu un embrion cu 8 celule. Când celulele stem embrionare (CSE) transfectate cu gena proteinei fluorescente verzi au fost transplantate în morula șoarecilor, descendenți fluorescenți ai acestei celule au fost găsiți în toate țesuturile studiate ale embrionului în curs de dezvoltare (Shimada, 1999). Transplantarea CSE în morula permite crearea de șoareci viabili al căror organism este format doar din descendenții CSE donatoare, ceea ce deschide perspective pentru diverse opțiuni de clonare terapeutică. Această abordare metodologică este acum utilizată cu succes pentru a studia problemele de biologie a dezvoltării, în special, este utilizată pentru a analiza mecanismele de inactivare genetică a cromozomului X sau instabilitatea epigenetică a CSE. Transplantarea CSE într-un embrion timpuriu este utilizată și în biotehnologia agricolă, precum și în experimentele de terapie genică.

Transplantarea de ESC modificate genetic este utilizată pentru a testa celulele țintă ale genelor mutante. ESC cultivate in vitro sunt utilizate în biotehnologie pentru a crea șoareci knockout. În acest scop, gena care urmează a fi studiată este îndepărtată din ESC prin recombinare omoloagă (knockout), iar celulele cărora le lipsește această genă sunt izolate pe medii selective. ESC knockout sunt apoi introduse în blastocist sau agregate cu blastomeri de morulă. Embrionii himerici timpurii obținuți în acest mod sunt transplantați la femele receptoare, iar indivizii cu gameți nulizigoți pentru o anumită genă sunt selectați dintre șoarecii nou-născuți. Această tehnologie a fost utilizată pentru a crea numeroase linii de șoareci knockout, care sunt utilizate pe scară largă în biologia experimentală și medicina experimentală. Astfel de modele biologice sunt utilizate pentru a studia semnificația anumitor gene în dezvoltarea embrionară, precum și rolul lor în mecanismele bolilor umane și ale condițiilor patologice. În plus, liniile animale knockout sunt utilizate în testarea preclinică a noilor metode de terapie genică. De exemplu, prin transfectarea alelei normale a unei gene mutante în genomul ESC, este posibilă corectarea eficientă a unei mutații care afectează sistemul hematopoietic. Introducerea de gene străine în ESC permite crearea rapidă de linii de animale de laborator transgenice homozigote. Cu toate acestea, trebuie menționat că tehnica de ștergere a genelor prin recombinare țintită a fost dezvoltată până în prezent în mod fiabil doar în raport cu ESC de șoarece. Folosind ESC de șoarece cu dublu knockout, a fost stabilit rolul funcțional al regiunii clusterului de gene de pe cromozomul 7 (o copie a regiunii genomice de pe cromozomul 19 uman) și al regiunii proximale a cromozomului 11 (o copie a cromozomului uman 5g) - ștergerea acestor gene în ESC de șoarece a făcut posibilă evaluarea funcției analogilor lor la om.

Posibilitățile de studiere a funcției genelor embriogenezei umane s-au extins, transfecția cărora în genomul celulelor stem embrionare (CSE) ale animalelor de laborator a permis, în special, clarificarea rolului genei cripto în formarea și dezvoltarea mezodermului cardiogen, gena pax-6 - în embriogeneza oculară. Primele hărți ale expresiei genelor în CSE proliferative imature de teratocarcinom și blastociste de șoarece sunt în curs de compilare, iar represia supresoare a genelor de transsemnalizare în CSE a fost confirmată. O combinație de 60-80 de CSE mutante și 20-30 de celule de embrioni normali de șoarece preimplantați duce la dezvoltarea de embrioni himerici în care primordiile organelor sunt formate din celule donatoare și receptoare, ceea ce face posibilă clarificarea rolului genelor necunoscute în gastrulație și organogeneză. Harta funcțională a genelor embrionilor de șoarece în curs de dezvoltare a fost completată cu informații despre rolul genei sf-1 în formarea glandei suprarenale și a gonadelor, genei wt-1 în formarea rinichiului, genelor familiei myoD în formarea mușchilor scheletici și genelor familiei gata-1-4 în maturarea restrictivă a rudimentelor de eritropoieză și limfopoieză.

Dezactivarea direcționată a alelelor materne și paterne ale genelor din ESC folosind recombinaze vectoriale a permis clarificarea funcțiilor diferitelor gene în perioada incipientă a embriogenezei, iar tehnologia transferului direcționat de gene umane necunoscute în ESC de șoarece contribuie la descoperirea de noi gene mutante responsabile de dezvoltarea patologiilor ereditare severe. Folosind metoda knockout, a fost determinată semnificația obligatorie a unor gene pentru formarea țesuturilor embrionare: gata-4 - pentru miocard, gata-1 - pentru linia eritroidă a țesutului hematopoietic, myoD - pentru mușchii scheletici, brahiurie - pentru mezoderm, transcriptazele de restricție hnf3 și hnf4 - pentru celulele stem hepatice, rag-2 - pentru formarea clonelor limfocitelor T și B (Repin, 2001). Ștergerea dublă a genelor din ESC a deschis accesul la studiul rolului funcțional al genelor stratului germinativ, segmentării și homeozei, iar transplantul de ESC a făcut posibilă obținerea de embrioni hibrizi interspecii viabili. Folosind o tehnică îmbunătățită de transplantare a unei ESC de la un singur donator într-un embrion cu 8 celule, a fost demonstrat faptul himerizării la nivel celular al multor organe ale embrionului receptor. Trebuie menționat că germeni celulari de țesut uman au fost găsiți în organele șoarecilor receptori după introducerea celulelor stem hematopoietice umane în blastocist. S-a stabilit că ESC pluripotente circulă în sângele embrionilor de șoarece în perioada de formare a organelor. Este posibil ca funcția lor biologică să rezide în organizarea embrionară a viitorului sistem imunitar. Cu ajutorul ESC, au fost reproduse modele adecvate de patologie genetică umană în condiții de laborator: dubla eliminare a genei distrofinei în distrofia musculară Duchenne la șoareci și oprirea genei atm (controlul sintezei kinazei semnalului cromatinei) - ataxie-telangectazie. În această boală ereditară fatală la copii, degenerarea celulelor Purkinje din cerebel se dezvoltă din cauza defectelor de reparare a ADN-ului, care este însoțită de involuția timusului din cauza morții celulelor proliferative. Tabloul clinic, fiziopatologia și patomorfologia ataxiei-telangectaziei, reproduse prin introducerea informațiilor genetice patologice în ESC-uri, la șoarecii himeri corespund cu cele de la om. Pe lângă ataxie-telangectazie, utilizând ESC-uri și șoareci knockout, au fost dezvoltate modele experimentale ale unor boli umane homozigote ereditare asociate cu patologia metabolismului carbohidraților și lipidelor, catabolismului aminoacizilor și excreției de cupru și bilirubină, ceea ce a extins semnificativ capacitățile medicinei experimentale în stadiul de testare preclinică a noilor metode de tratare a bolilor umane corespunzătoare.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Utilizarea citohibrizilor de celule stem

Celulele hibride obținute prin fuzionarea ESC-urilor cu celule somatice reprezintă un model adecvat și promițător pentru studierea pluripotenței celulelor stem și reprogramarea cromozomilor celulelor diferențiate. Citohibrizii obținuți prin fuzionarea ESC-urilor cu celule diferențiate ale unui animal adult fac posibilă studierea relațiilor dintre genomurile de diferite „vârste”: o situație unică apare atunci când cromozomii omologi proveniți din celule aflate în diferite stadii de diferențiere și diferite grade de maturitate sunt localizați în același nucleu, unde pot schimba cu ușurință semnale de reglare trans-acționale. Este dificil de prezis cum vor reacționa sistemele epigenetice cisreglatoare ale cromozomilor omologi, formate în timpul dezvoltării individuale, la influența semnalelor de reglare trans-acționale emanate de genomurile înrudite embrionare. În plus, segregarea cromozomilor parentali are loc în celulele hibride, ceea ce ne permite să studiem interacțiunea genomurilor la nivelul cromozomilor individuali, adică să identificăm potențial participarea unor cromozomi specifici la menținerea pluripotenței sau, dimpotrivă, ieșirea la diferențiere.

Citohibrizii obținuți prin fuzionarea celulelor de teratocarcinom pluripotent cu celule somatice diferențiate au fost utilizați ca prim model experimental pentru studierea interacțiunii genomurilor cu diferite „istorii de dezvoltare”. În unele cazuri, astfel de celule hibride și-au păstrat proprietățile pluripotente la un nivel destul de ridicat. În special, celulele hibride teratocarcinom-somatice in vivo au indus dezvoltarea de teratoame adevărate conținând derivați din toate cele trei straturi germinale, iar in vitro, în culturi în suspensie, au format corpuri embrionare. Chiar și în citohibrizii interspecifici de acest tip, prezența antigenelor embrionare a fost observată în cazurile în care partenerii somatici în fuziunea cu celulele de teratocarcinom au fost limfocite sau timocite. Este demn de remarcat faptul că citohibrizii creați prin fuzionarea celulelor de teratocarcinom cu fibroblaste au corespuns fibroblastelor ca fenotip.

Cel mai important fapt stabilit este că în celulele hibride teratocarcinom-somatic au apărut semne de reprogramare a genomului celular diferențiat, caracterizată fie prin reactivarea unor gene individuale, fie prin cromozomul X inactiv al partenerului somatic. Astfel, rezultatele studiilor asupra citohibrizilor de tip celular teratocarcinom-somatic indică faptul că pluripotența este adesea păstrată în celulele hibride și există semne de reprogramare a genomului partenerului somatic.

În experimentele privind obținerea de celule hibride embrionare intraspecifice prin fuzionarea celulelor embrionare stem de șoarece cu splenocite adulte, au fost studiate caracteristicile acestor citohibrizi, a fost analizată segregarea cromozomilor parentali și a fost evaluată pluripotența genomului hibrid. Celulele hibride intraspecifice obținute prin fuzionarea celulelor de teratocarcinom cu celule somatice sunt de obicei caracterizate printr-un nivel scăzut de segregare cromozomială, cu un cariotip tetraploid sau aproape tetraploid. O compoziție cromozomială similară a fost observată la citohibrizi în timpul fuzionării celulelor germinale primare cu limfocite. În același timp, celulele hibride interspecifice obținute prin fuzionarea celulelor de teratocarcinom de șoarece cu limfocite de nurcă au prezentat o segregare intensă a cromozomilor partenerului somatic.

O etapă calitativ nouă în studiul segregării cromozomilor parentali în hibrizii intraspecifici a început după dezvoltarea unei metode de analiză a microsateliților folosind reacția în lanț a polimerazei, datorită căreia au fost găsite câteva sute de markeri pentru fiecare cromozom de șoarece, permițând discriminarea fiabilă a oricărei perechi de cromozomi omologi în celulele hibride.

Prin fuzionarea ESC-urilor (celule HM-1 cu deficit de activitate a hipoxantin fosforiboziltransferazei, 2n = 40, XY, izolate din blastociste de șoareci 129/01a) cu splenocite de la șoareci DD/c congenici, a fost posibilă obținerea unui set de clone hibride similare din punct de vedere morfologic cu ESC-urile. Toate clonele au fost izolate pe un mediu selectiv în care pot crește doar celulele cu hipoxantin fosforiboziltransferază activă. Analiza electroforetică a arătat că toate clonele aveau o variantă alelică a hipoxantin fosforiboziltransferazei, caracteristică șoarecilor DD/c. Analiza citogenetică a arătat că trei dintre cele patru clone hibride aveau un set de cromozomi aproape diploid. O clonă aproape tetraploidă conținea două populații de celule hibride, dintre care una era tetraploidă, iar a doua, mai mică, era diploidă.

Analiza microsateliților, care permite discriminarea oricărei perechi de cromozomi omologi ai șoarecilor 129/01a și DD/c, în clonele hibride cu un set aproape diploid, a arătat că în două clone a existat o eliminare preferențială clară a autozomilor partenerului somatic. Majoritatea autozomilor din clonele HESS2 și HESS3 au avut markeri ai liniei 129/01a, adică ai partenerului pluripotent. Excepție au făcut cromozomii 1 și I: în clonele HESS2 și HESS3, alături de markerii celulelor HM-1, markerii partenerului somatic au fost prezenți în cantități mici. Astfel de rezultate pot reflecta o segregare incompletă a cromozomilor 1 și I ai partenerului somatic și sunt în concordanță cu datele citogenetice conform cărora trisomia pentru acești cromozomi este observată în 30-40% din celulele clonelor HESS2 și HESS3. Clona HESS4 a diferit semnificativ în ceea ce privește compoziția cromozomială: mulți autozomi din această clonă provin din genomul ESC (cromozomii 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 și 17), dar cromozomii 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 și 19 au fost reprezentați de omologi ai ambilor părinți. Raportul cantitativ al microsateliților care marchează acești cromozomi omologi a fost de aproximativ 1:1. Acest lucru le-a permis autorilor să presupună că un omolog provine din genomul ESC, iar celălalt din celule diferențiate. În unele subclone ale clonei HESS4, au fost prezenți doar markerii cromozomilor 18 și 19 ai partenerului somatic. Rezultatele obținute indică faptul că în celulele clonei HESS4, pe lângă segregarea cromozomilor partenerului somatic, a avut loc eliminarea unuia sau a ambilor omologi ai cromozomilor enumerați mai sus ai genomului pluripotent, adică a existat o segregare bilaterală a cromozomilor ambilor părinți - un fenomen foarte neobișnuit, deoarece segregarea cromozomilor doar a unuia dintre părinți este caracteristică citohibrizilor.

În plus, după a 20-a pasaj, toate clonele celulelor hibride conțineau doar markeri ai cromozomului X al partenerului somatic, adică cromozomul X al ESC a fost înlocuit în clone cu cromozomul X al partenerului somatic. Acest fapt important este confirmat de datele de hibridizare in situ utilizând o sondă marcată cu FITC specifică pentru cromozomul X de șoarece: un semnal pozitiv a fost detectat doar pe un cromozom. Trebuie menționat că în stadiile anterioare ale cultivării (înainte de a 15-a pasaj), conform datelor citogenetice, multe celule conțineau doi cromozomi X. Prin urmare, utilizarea mediilor selective permite manipularea compoziției cromozomiale a celulelor hibride și selectarea selectivă a clonelor purtătoare de cromozomi singulari ai partenerului somatic pe fundalul genomului ESC.

Întrucât o caracteristică unică a genomului citohibrid este localizarea genomurilor parentale într-un singur nucleu, se pune în mod firesc întrebarea cu privire la conservarea proprietăților pluripotente ale genomului embrionar în hibrizii ESC-celule somatice în condițiile contactului strâns cu genomul unei celule diferențiate. Din punct de vedere morfologic, citohibrizii ESC și ai celulelor somatice au fost similari cu linia ESC parentală. Evaluarea pluripotenței a arătat că toate clonele cu un set aproape diploid de cromozomi au fost capabile să formeze corpuri embrionare în culturi în suspensie, în care au fost prezenți derivați ai trei straturi germinale.

Majoritatea celulelor hibride conțineau antigenul ECMA-7, un marker caracteristic embrionilor timpurii de șoarece, și aveau, de asemenea, o activitate ridicată a fosfatazei alcaline. Cele mai convingătoare date privind proprietățile de pluripotență ridicată ale celulelor hibride au fost obținute în experimente privind obținerea unei serii de himere injectate care implică celule hibride ale clonei HESS2. Analiza markerilor biochimici a arătat că descendenții celulelor hibride donatoare erau prezenți în majoritatea țesuturilor himerelor. Prin urmare, celulele hibride obținute prin fuzionarea ESC-urilor și a celulelor diferențiate somatic își păstrează pluripotența la un nivel ridicat, inclusiv capacitatea de a forma himere atunci când sunt injectate în cavitatea blastocistului.

Clonele HESS2 și HESS4 au diferit semnificativ în ceea ce privește compoziția cromozomilor parentali, dar au avut proprietăți pluripotente similare. S-ar putea presupune că pluripotența în genomul hibrid se manifestă ca o trăsătură dominantă, dar este posibil ca nu toți cromozomii genomului embrionar să fie implicați în procesul de menținere a pluripotenței. Dacă această presupunere este corectă, atunci ne putem aștepta ca eliminarea unor cromozomi ai partenerului pluripotent din genomul celulelor hibride să nu fie însoțită de o modificare a statutului lor pluripotent. În acest caz, analiza segregării cromozomilor parentali în celulele hibride embrionare ne-ar permite să abordăm îndeaproape identificarea cromozomilor responsabili de controlul pluripotenței celulelor embrionare.

O. Serov și colab. (2001) nu au găsit niciun urmaș printre cei 50 de urmași obținuți prin încrucișarea himerelor cu șoareci normali care aveau genotipul de șoarece 129/01a și purtau cromozomul X al șoarecilor DD. Autorii consideră că acest lucru se datorează unei scăderi a pluripotenței în celulele hibride sub influența genomului somatic. O explicație alternativă ar putea fi efectul negativ al trisomiei asupra unor autozomi și dezechilibrul cromozomilor sexuali (XXY au fost observați în celule până la al 15-lea pasaj) în celulele hibride în timpul meiozei. Se știe că celulele XXY sunt incapabile să sufere meioză și să formeze gameți. Trisomia poate provoca, de asemenea, o scădere a activității proliferative a celulelor hibride, drept urmare avantajul selectiv în dezvoltarea himerelor poate aparține celulelor embrionului receptor. Rezultă că, pentru o evaluare adecvată a potențialului pluripotent al celulelor hibride, este necesar să se obțină clone hibride cu un set diploid normal de cromozomi.

În experimentele lui O. Serov și coautorilor (2001), a fost demonstrată pentru prima dată posibilitatea reprogramării cromozomului X al unei celule somatice în genomul celulelor hibride. Această concluzie a autorilor rezultă din analiza expresiei genei hprt (un marker al cromozomului X) în himere: prezența variantei alele a hprt la șoareci DD/c a fost detectată în toate țesuturile himerice analizate. Este oportun să subliniem faptul că, după introducerea celulelor hibride în cavitatea blastocistului, citohibrizii intră în condiții neselective, iar conservarea cromozomului X în genomul celulelor hibride înseamnă că acesta a devenit componenta sa obligatorie și genomul nu îl diferențiază de cromozomul Y al partenerului pluripotent.

Rezumând rezultatele analizei interacțiunii genomurilor somatice și pluripotente în celulele embrionare hibride, autorii concluzionează că în unele citohibrizi pluripotența se manifestă ca o trăsătură dominantă. Genomul hibrid este capabil să reprogrameze cromozomi individuali ai celulelor diferențiate, ceea ce, însă, nu exclude posibilitatea unui efect invers al genomului somatic asupra pluripotenței genomului embrionar. La cultivarea celulelor hibride, inducerea diferențierii are loc semnificativ mai des decât în linia parentală originală de ESC HM-1. Un efect similar se observă în timpul formării coloniilor primare: multe colonii primare de celule hibride embrionare se diferențiază în stadii incipiente de formare, cu pierderi mari de clone în timpul selecției și reproducerii lor.

Astfel, citohibridele create prin fuziunea ESC-urilor cu celule somatice, în ciuda contactului strâns cu genomul celulelor diferențiate, își păstrează pluripotența ca o proprietate unică a genomului embrionar. Mai mult, în astfel de celule hibride, este posibilă reprogramarea cromozomilor individuali proveniți din celule diferențiate. Rămâne neclar în ce măsură proprietățile pluripotente ale genomului embrionar sunt păstrate în celulele hibride, în special capacitatea lor de a participa la formarea liniei germinale în himere. Acest lucru necesită obținerea de celule hibride embrionare cu un cariotip normal. În orice caz, celulele hibride embrionare pluripotente pot deveni un model genetic real pentru identificarea cromozomilor implicați în menținerea pluripotenței sau controlul acesteia, deoarece segregarea bilaterală a cromozomilor parentali oferă potențial o astfel de oportunitate.

Nu mai puțin atractiv este studiul fenomenului pe care O. Serov și colab. (2001) îl definesc drept „memorie cromozomială”. În genomul hibrid, cromozomii omologi se află în două configurații alternative: omologii partenerului somatic au suferit o dată o diferențiere, în timp ce la omologii partenerului pluripotent acest proces abia începe. În consecință, păstrarea proprietăților pluripotente ridicate de către celulele hibride indică faptul că configurația „pluripotentă” a omologilor ESC este suficient de stabilă în genomul hibrid, în ciuda influenței factorilor de transacțiune care emană de la partenerul somatic. Semnele descrise mai sus de reprogramare a cromozomilor omologi ai genomului diferențiat în timpul dezvoltării himerelor nu exclud posibilitatea ca în primele etape de formare și cultivare a citohibrizilor in vitro să își păstreze statutul dobândit în timpul diferențierii in vivo. Conform datelor obținute recent, atunci când celulele hibride embrionare sunt transferate într-un mediu neselectiv, acestea prezintă o eliminare intensivă a cromozomilor doar ai partenerului somatic, adică genomul celulelor hibride discriminează ușor omologii după cultivarea in vitro timp de 10-15 pasaje. Astfel, celulele hibride embrionare reprezintă un model experimental promițător pentru studierea nu numai a unei proprietăți fundamentale a genomului embrionar precum pluripotența, ci și a alternativei sale - diferențierea embrionară.

Eficacitatea terapeutică a transplantului de celule stem embrionare

Înainte de a analiza eficacitatea terapeutică a transplantului de celule stem stem embrionare (CSE) și a derivaților acestora, vom rezuma materialul de mai sus. Capacitățile CSE în ceea ce privește implementarea completă a embriogenezei in vitro sunt insuficiente, deoarece defectele de dezvoltare în acest caz se datorează absenței celulelor stem mezenchimale, care apar în organism autonom și independent de CSE. Potențialul genetic al CSE este mai mic decât potențialul genetic al zigotului, prin urmare, CSE nu sunt utilizate direct pentru clonarea embrionilor. Potențialul biologic unic al CSE, ca singurele celule în care programele de dezvoltare sunt implementate pe deplin într-o implementare consecventă, este utilizat în studiile funcției genelor. Cu ajutorul CSE, sunt decodificate primele combinații de semnale care activează expresia genelor timpurii și tardive care codifică dezvoltarea a trei straturi germinale. Păstrarea pluripotenței genomului CSE in vitro le face un instrument unic pentru regenerarea reparativă, capabil să completeze automat pierderile celulare în cazul deteriorării organelor și țesuturilor. Într-un scenariu ipotetic ideal, se poate presupune că „...la transplantul de ESC-uri de la donatori, programe compacte sunt transferate în corpul receptorului, care, în condiții favorabile, sunt realizate prin construirea de țesut nou'7, capabil să „... fie integrat eficient în corpul receptorului atât la nivel morfologic, cât și funcțional”.

În mod firesc, în urma dezvoltării metodelor de monodiferențiere a celulelor stem stem (CSE), a început studiul in vivo al activității funcționale a celulelor obținute in vitro dintr-o clonă specializată. O clonă CSE proliferantă generează populații de celule progenitoare migratoare, care sunt cu adevărat capabile să se integreze activ în zonele cu leziuni ale țesutului receptor, ceea ce este utilizat în medicina regenerativ-plastică. S-a stabilit că transplantul de neuroni DOPA în substantia nigra reduce manifestările clinice în hemiparkinsonismul experimental. Transplanturile regionale de celule stem neuronale donatoare reduc gradul de tulburări motorii cauzate de traumatisme sau contuzii ale măduvei spinării și creierului. De asemenea, au fost obținute primele rezultate pozitive ale transplantului de celule stem în bolile demielinizante. S-ar părea că potențialul regenerativ-plastic al CSE deschide posibilități nelimitate pentru utilizarea transplantului de celule în medicina practică. Cu toate acestea, atunci când sunt transplantate în zone ectopice, CSE se transformă inevitabil în tumori. Teratoamele se formează atunci când CSE sunt injectate subcutanat la șoareci imunodeficienți. Când suspensiile de ESC sunt transplantate sub capsula testiculară la șoareci singenici, se formează și teratoame, constând din diferite țesuturi, ale căror celule sunt derivate din toate cele trei straturi germinale. În astfel de teratoame, procesele de organogeneză redusă sunt extrem de rare.

O serie de studii oferă informații despre rezultatele pozitive ale transplantării derivaților ESC timpurii la animale cu patologie experimentală. Neurotransplantul celular utilizând derivați ESC este dezvoltat în continuare în experimente și în primele studii clinice pentru corectarea tulburărilor funcționale în leziunile cerebrale și spinale și pentru tratarea siringomieliei și a sclerozei multiple (Repin, 2001). Odată cu apariția tehnicii de neurogeneză in vitro din ESC, în loc să se utilizeze țesut cerebral embrionar, se dezvoltă metode pentru transplantarea derivaților de neurosfere obținute din culturi de țesut nervos embrionar. Astfel de suspensii de transplant sunt semnificativ mai omogene și conțin precursori dedicați ai neuronilor și neurogliei.

Prin adăugarea regulată de acid retinoic în mediul de cultură, în doză de 10 μg/ml, timp de 6 săptămâni, se formează peste 80% dintre neuronii postmitotici în linia de carcinom embrionar (terato) uman NTERA-2. Omogenitatea completă a populației neuronale se realizează prin sortarea în flux a neuronilor maturi marcați cu markeri imunofenotipici, ceea ce permite eliminarea resturilor de teratocarcinom și a celulelor imature. După transplantul în diferite regiuni ale creierului animalelor de experiment, acești neuroni nu numai că supraviețuiesc, dar se integrează și în rețele neuronale regionale. La animalele cu modele experimentale de defecte locale ale SNC, neurotransplantarea reduce manifestările clinice ale unor patologii umane, cum ar fi consecințele traumatismelor cerebrale, accidentului vascular cerebral, bolilor demielinizante, defectelor ereditare în dezvoltarea cerebelului, bolilor de depunere a lipidelor și polizaharidelor.

Pentru a optimiza procesele de regenerare în bolile degenerative ale sistemului nervos central, se dezvoltă tehnologii pentru obținerea de oligodendrocite producătoare de mielină din celule stem embrionare (CSM). Prima etapă include în mod tradițional proliferarea CSM cu reproducerea numărului de celule necesar pentru transplant. În a doua etapă, se realizează diferențierea țintită a celulelor într-o populație de precursori de oligodendrocite producătoare de mielină, care este controlată de antigeni marker selectivi.

Se deschid anumite perspective pentru utilizarea derivaților de ESC pentru dezvoltarea de metode de corectare a imunodeficiențelor cauzate de defecte genetice în maturarea timusului. În studiile efectuate pe șoareci knockout (rag 1) cu un defect genetic indus - o perturbare a mecanismului de recombinare a locusurilor V(D)J ale genelor TCR, ducând la pierderea funcției limfocitelor T, transplantul de derivați de ESC timpurii în timusul animalelor restabilește maturarea populațiilor normale de clone imune responsabile de imunitatea celulară. Studiile clinice privind transplantul de ESC preformate in vitro pentru tratamentul anemiilor ereditare fatale la copii sunt în curs de desfășurare.

Obiecțiile la introducerea rapidă a transplantului de celule stem în clinică se bazează pe numărul limitat de linii stabile de celule stem embrionare umane și pe necesitatea standardizării acestora. Pentru a crește puritatea liniilor ESC standardizate, precum și a celulelor stem umane adulte, se propune utilizarea unei metode de selecție a liniilor bazate pe analiza genetică moleculară a repetițiilor scurte de ADN în tandem. De asemenea, este necesar să se testeze liniile ESC pentru prezența unor mici rearanjări cromozomiale și mutații genetice, al căror potențial de apariție în condiții de cultură celulară este destul de mare. Se prezintă o teză despre testarea obligatorie a proprietăților tuturor tipurilor de ESC și a celulelor stem pluripotente regionale, deoarece reproducerea lor in vitro poate duce la apariția unor noi caracteristici care nu sunt inerente celulelor stem embrionare sau țesuturilor definitive. În special, se presupune că cultivarea pe termen lung în medii cu citokine apropie liniile ESC de celulele tumorale, deoarece acestea suferă modificări similare în căile de reglare a ciclului celular, odată cu dobândirea capacității de a efectua un număr nelimitat de diviziuni celulare. Unii autori, pe baza potențialului de dezvoltare tumorală, consideră transplantul de derivate de celule stem embrionare timpurii la oameni ca fiind imprudent. În opinia lor, este mult mai sigur să se utilizeze descendenți dedicați ai ESC-urilor, adică linii de progenitori celulari diferențiați. Cu toate acestea, în prezent, nu a fost încă dezvoltată o tehnică fiabilă pentru obținerea unor linii celulare umane stabile care se diferențiază în direcția dorită.

Astfel, în literatura de specialitate apar tot mai multe date despre efectul terapeutic pozitiv al transplantului de derivate de celule stem embrionare umane. Cu toate acestea, multe dintre aceste studii sunt revizuite și criticate. Unii cercetători consideră că rezultatele studiilor clinice timpurii sunt preliminare și indică doar faptul că celulele stem sunt capabile să exercite un efect favorabil asupra evoluției clinice a unei anumite boli. Prin urmare, este necesar să se obțină date despre rezultatele îndepărtate ale transplantului de celule. Etapele de dezvoltare a neurotransplantologiei clinice sunt citate ca argument. Într-adevăr, la început, publicațiile despre eficiența ridicată a transplantului de fragmente de creier embrionar în boala Parkinson au predominat în literatura de specialitate, dar apoi au început să apară rapoarte care negau eficiența terapeutică a țesutului nervos embrionar sau fetal transplantat în creierul pacienților.

Primele studii clinice au fost efectuate pentru a evalua siguranța transplantului de neuroblaste derivate din ESC-uri de teratocarcinom NTERA-2, ale căror celule imature au fost supuse proliferării în cultură până la acumularea unei mase de 100 de milioane de celule. O parte dintre celulele obținute în acest mod au fost utilizate pentru a caracteriza fenotipul și a determina impuritățile celulare, precum și pentru a testa o posibilă contaminare cu virusuri și bacterii. LIF și stratul hrănitor al celulelor stromale fetale au fost îndepărtate din mediul de cultură și au fost create condiții pentru diferențierea țintită a ESC-urilor în neuroblaste folosind o combinație de citokine și factori de creștere. Apoi, neuroblastele au fost purificate din celulele de teratocarcinom imature pe un sortator de celule în flux. După purificarea secundară și caracterizarea fenotipului celulelor transplantate, o suspensie de neuroblaste (10-12 milioane) a fost injectată în nucleul bazal al creierului pacienților (în a șaptea lună după accidentul vascular cerebral hemoragic) folosind o microcanulă specială și o seringă sub control stereotaxic și tomografic computerizat. Screening-ul post-transplant la un an privind consecințele transplantului de neuroni în zona accidentului vascular cerebral nu a evidențiat efecte secundare sau nedorite. Jumătate dintre pacienți au prezentat o îmbunătățire a funcției motorii în perioada de la 6 la 12 luni după transplant. Modificările clinice pozitive au fost însoțite de o creștere a aportului de sânge către zona accidentului vascular cerebral după transplantul de celule: creșterea medie a absorbției 2-deoxiglucozei marcate fluorescent, conform tomografiei cu emisie de pozitroni, a atins 18%, iar la unii pacienți - 35%.

Cu toate acestea, Institutele Naționale de Sănătate din SUA au efectuat un studiu independent privind eficacitatea clinică a neurotransplantului la pacienții cu parkinsonism. Pacienților din primul grup li s-au transplantat secțiuni de țesut nervos embrionar care produc dopamină, în timp ce al doilea grup de pacienți a fost supus unei operații simulate. Rezultatele indică o eficacitate clinică zero a unui astfel de neurotransplant, în ciuda faptului că neuronii embrionari producători de dopamină au supraviețuit în creierul receptorilor. Mai mult, la 2 ani după transplantul de țesut nervos embrionar, 15% dintre pacienți au dezvoltat diskinezie persistentă, care a fost absentă la pacienții din grupul placebo (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Observațiile privind dezvoltarea ulterioară a bolii la acești pacienți sunt în curs de desfășurare.

Unii autori asociază datele contradictorii din literatura de specialitate privind evaluarea eficacității clinice a neurotransplantului cu abordări diferite ale selecției grupurilor de pacienți, alegerea inadecvată a metodelor pentru evaluarea obiectivă a stării acestora și, cel mai important, perioade diferite de dezvoltare a țesutului nervos embrionar și diferite zone ale creierului din care a fost obținut acest țesut, dimensiuni diferite ale transplantului și caracteristici metodologice ale intervenției chirurgicale.

Trebuie menționat că încercările de transplant direct de celule stem embrionare pluripotente în regiunea striată a creierului șobolanilor cu hemiparkinsonism experimental au fost însoțite de proliferarea celulelor stem embrionare stem (ESC) și diferențierea acestora în neuroni dopaminergici. Trebuie presupus că neuronii nou formați au fost integrați eficient în rețelele neuronale, deoarece după transplantul de ESC s-a observat corectarea anomaliilor comportamentale și a asimetriei motorii în testul cu apomorfină. În același timp, unele animale au murit din cauza transformării ESC transplantate în tumori cerebrale.

Experții de la Academiile Naționale și Medicale din SUA, specialiștii de la Institutul Național de Sănătate din SUA consideră că potențialul clinic al celulelor stem embrionare merită cea mai serioasă atenție, dar insistă asupra necesității unui studiu detaliat al proprietăților acestora, probabilității complicațiilor și consecințelor pe termen lung în experimente pe modele biologice adecvate ale bolilor umane (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Din acest punct de vedere, este important ca o analiză histologică comparativă a teratomelor experimentale obținute prin transplantul de suspensie de ESC în testicul cu teratomele formate ca urmare a transplantului unui embrion timpuriu, care conține și ESC, să arate că ESC, indiferent de sursa lor de origine sau de interacțiunea cu anumite celule înconjurătoare, își implementează potențialul tumorigen în același mod. S-a dovedit că astfel de teratomele au o origine clonală, deoarece tumorile constând din derivați ai tuturor celor trei straturi germinale pot apărea dintr-o singură ESC (Rega, 2001). Este demn de remarcat faptul că atunci când ESC clonate cu un cariotip normal au fost transplantate la șoareci imunodeficienți, s-au format și teratomele constând din diferite tipuri de celule somatice diferențiate. Aceste date experimentale reprezintă o dovadă impecabilă a originii clonale a teratomelor. Din punctul de vedere al biologiei dezvoltării, ele indică faptul că nu mai multe celule progenitoare dedicate, ci o singură celulă stem pluripotentă acționează ca sursă de derivați diferențiați ai tuturor celor trei straturi germinale care alcătuiesc un teratom. Cu toate acestea, pe calea transplantului practic de celule, rezultatele acestor studii sunt, dacă nu prohibitive, atunci un semn de avertizare al unui pericol potențial, deoarece inocularea celulelor stem stem embrionare (ESC) sau a celulelor germinale primordiale în diverse țesuturi ale șoarecilor imunodeficienți adulți determină inevitabil dezvoltarea de tumori din celulele stem transplantate. Degenerarea neoplazică a ESC transplantate ectopic este însoțită de apariția unor populații satelit de celule diferențiate - datorită diferențierii parțiale a ESC și a clonelor progenitoare în linii specializate. Interesant este că, atunci când ESC sunt transplantate în mușchii scheletici, neuronii se formează cel mai adesea lângă celulele teratocarcinomului. Cu toate acestea, introducerea ESC într-un ovul sau blastocist în diviziune este însoțită de integrarea completă a celulelor în embrion, fără formarea de elemente neoplastice. În acest caz, ESC sunt integrate în practic toate organele și țesuturile embrionului, inclusiv primordiul genital. Astfel de animale alofene au fost obținute pentru prima dată prin introducerea celulelor teratocarcinom 129 în embrioni timpurii, în stadiile de 8-100 de celule. La șoarecii alofeni, populațiile de celule eterogene derivate din ESC-uri donatoare sunt integrate în țesuturile măduvei osoase, intestinului, pielii, ficatului și organelor genitale, ceea ce face posibilă crearea unor himere celulare chiar și interspecifice în cadrul experimentului. Cu cât perioada de dezvoltare a embrionului timpuriu este mai scurtă, cu atât procentul de himerizare celulară este mai mare, cel mai mare grad de himerizare observându-se în sistemul hematopoietic, pielea, sistemul nervos, ficatul și intestinul subțire al embrionului alofen. Într-un organism adult, țesuturile protejate de sistemul imunitar al receptorului prin bariere histohematice sunt susceptibile la himerizare:Transplantarea celulelor germinale primare în parenchimul testicular este însoțită de încorporarea celulelor stem donatoare în stratul de țesut germinal al receptorului. Cu toate acestea, la transplantarea ESC într-un blastocist, nu are loc formarea rudimentelor himerice ale organelor sexuale cu generarea de celule germinale primare donatoare. Pluripotența ESC, atunci când sunt create condiții speciale, poate fi utilizată și pentru clonare: transplantarea ESC de șoarece într-un embrion de șoarece cu 8-16 celule, în care mitozele celulare sunt blocate de citocalsină, promovează implementarea embriogenezei normale cu dezvoltarea unui embrion din ESC donatoare.

Prin urmare, o alternativă la transplantul alogen de ESC este clonarea terapeutică bazată pe transplantul de nuclei de celule somatice într-un ovul enucleat pentru a crea un blastocist, din masa celulară internă a căruia sunt apoi izolate linii de ESC identice genetic cu donatorul nucleului somatic. Din punct de vedere tehnic, această idee este destul de fezabilă, deoarece posibilitatea creării de linii ESC din blastociste obținute după transplantul de nuclei somatici în ovule enucleate a fost demonstrată în mod repetat în experimente pe animale de laborator (Nagy, 1990; Munsie, 2000). În special, la șoarecii homozigoți pentru mutația genei rag2, fibroblastele obținute prin cultivarea celulelor tisulare subepidermice au fost utilizate ca donatori de nuclei, care au fost transplantate în ovocite enucleate. După activarea ovocitelor, „zigotul” a fost cultivat până la formarea blastocistului, din masa celulară internă a căruia au fost izolate ESC și transferate pe o linie de celule nulizigote pentru gena mutantă (rag2~/~). Mutația unei gene alelice a fost corectată în astfel de ESC prin metoda recombinării omoloage. În prima serie de experimente, corpurile embrionare au fost obținute din ESC cu o genă restaurată recombinantă, celulele acestora au fost transfectate cu un retrovirus recombinant (HoxB4i/GFP) și, după reproducere, au fost injectate în vena șoarecilor rag2~/~. În a doua serie, blastomerii tetraploizi au fost agregați cu ESC modificate genetic și transplantați la femele receptoare. Șoarecii imunocompetenți rezultați au servit ca donatori de măduvă osoasă pentru transplant la șoareci mutanți rag2~/~. În ambele serii rezultatul a fost pozitiv: după 3-4 săptămâni, la toți șoarecii s-au găsit celule mieloide și limfoide normale mature, capabile să producă imunoglobuline. Astfel, transplantul de nuclei ai celulelor somatice în ovocite poate fi utilizat nu numai pentru obținerea de linii ESC, ci și pentru citogenoterapie - corectarea anomaliilor ereditare, utilizând ESC ca vector pentru transportul informațiilor genetice corective. Dar această direcție de transplant celular, pe lângă problemele bioetice, are limitele sale. Nu este clar cât de sigur va fi transplantul de celule clonate terapeutic cu un genotip identic cu genotipul unui anumit pacient, deoarece astfel de celule pot introduce mutații care creează o predispoziție la alte boli. Ovulele umane normale rămân un obiect dificil de accesat, în timp ce chiar și cu transplantul de nuclei somatici în ovule de animale enucleate, doar 15-25% din „zigoții” construiți se dezvoltă până la stadiul de blastocist. Nu este încă stabilit câte blastociste sunt necesare pentru a obține o linie de ESC clonate pluripotente. De asemenea, merită menționat nivelul ridicat al costurilor financiare asociate cu complexitatea metodologiei de clonare terapeutică.

În concluzie, trebuie menționat că, în cazul celulelor stem embrionare (ESC), pluripotența genomului cu ADN hipometilat este combinată cu o activitate telomerazică ridicată și o fază C^ scurtă a ciclului celular, ceea ce asigură reproducerea lor intensivă și potențial infinită, timp în care ESC păstrează un set diploid de cromozomi și un set „juvenil” de caracteristici fenotipice. Creșterea clonală a ESC în cultură nu interferează cu diferențierea lor în nicio linie celulară specializată a organismului atunci când proliferarea este oprită și se adaugă semnale de reglare adecvate. Diferențierea restrictivă a ESC în linii celulare somatice in vitro se realizează fără participarea mezenchimului, ocolind Nochteys, în afara organogenezei și fără formarea de embrioni. Introducerea ectopică a ESC in vivo duce inevitabil la formarea de teratocarcinoame. Transplantarea ESC într-un blastocist sau embrion timpuriu este însoțită de integrarea lor cu țesuturile embrionare și de himerizarea stabilă a organelor sale.

Tehnologiile regenerativ-plastice bazate pe transplantul celular reprezintă punctul de intersecție al intereselor reprezentanților biologiei celulare, biologiei dezvoltării, geneticii experimentale, imunologiei, neurologiei, cardiologiei, hematologiei și multor alte ramuri ale medicinei experimentale și practice. Cele mai importante rezultate ale studiilor experimentale dovedesc posibilitatea reprogramării celulelor stem cu o modificare țintită a proprietăților acestora, ceea ce deschide perspective pentru controlul proceselor de citodiferențiere folosind factori de creștere - pentru regenerarea miocardică, restaurarea leziunilor SNC și normalizarea funcției aparatului insular al pancreasului. Cu toate acestea, pentru introducerea pe scară largă a transplantului de derivați de ESC în medicina practică, este necesar să se studieze mai detaliat proprietățile celulelor stem umane și să se continue experimentele cu ESC pe modele experimentale de boli.

Problemele bioetice și problema respingerii unui transplant de celule alogene ar putea fi rezolvate prin plasticitatea descoperită a genomului celulelor stem regionale ale unui organism adult. Cu toate acestea, informațiile inițiale conform cărora, atunci când se transplantează în ficat celule autologe hematopoietice izolate și atent caracterizate, din care provin noi hepatocite, se integrează în lobulii hepatici, sunt acum revizuite și criticate. Cu toate acestea, au fost publicate date conform cărora transplantul de celule stem neuronale în timus provoacă formarea de noi germeni de limfocite T și B de la donatori, iar transplantul de celule stem neuronale cerebrale în măduva osoasă duce la formarea de germeni hematopoietici cu mielo- și eritropoieză donatoare pe termen lung. În consecință, celulele stem pluripotente capabile să reprogrameze genomul la potențialul celulelor stem embrionare (ESC) pot persista în organele unui organism adult.

Sursa de obținere a celulelor stem embrionare (CSE) în scopuri medicale rămâne embrionul uman, care predetermină inevitabilitatea unei noi intersecții de probleme morale, etice, juridice și religioase la punctul de origine al vieții umane. Descoperirea CSE a dat un impuls puternic reluării discuțiilor dificile despre linia de demarcație dintre celulele vii și materie, dintre ființă și personalitate. În același timp, nu există norme, reguli și legi universale privind utilizarea CSE în medicină, în ciuda încercărilor repetate de a le crea și adopta. Fiecare stat, în cadrul legislației sale, rezolvă această problemă în mod independent. La rândul lor, medicii din întreaga lume continuă să încerce să ducă medicina regenerativ-plastică dincolo de sfera unor astfel de discuții, în principal prin utilizarea rezervelor de celule stem adulte, mai degrabă decât a celulelor stem embrionare.

Un pic de istorie a izolării celulelor stem embrionare

Celulele de terato(embrion)carcinom au fost izolate din teratoame testiculare apărute spontan la șoareci 129/ter-Sv, teratoame ovariene spontane la șoareci Lt/Sv și din teratoame derivate din celule sau țesuturi embrionare transplantate ectopic. Printre liniile celulare de terato(embrion)carcinom de șoarece stabile obținute în acest mod, unele au fost pluripotente, altele s-au diferențiat doar într-un singur tip specific de celulă, iar unele au fost complet incapabile de citodiferențiere.

La un moment dat, accentul s-a pus pe studii ale căror rezultate indicau posibilitatea readucerii celulelor de terato-(embrion)-carcinom la un fenotip normal după introducerea lor în țesuturile unui embrion în curs de dezvoltare, precum și pe lucrări privind crearea in vitro a celulelor de terato-(embrion)-carcinom modificate genetic, cu ajutorul cărora s-au obținut șoareci mutanți pentru modelarea biologică a patologiei ereditare umane.

Cultivarea condiționată în suspensie a fost utilizată pentru izolarea liniilor celulare de terato-(embrion)-carcinom. În cultură, celulele de terato-(embrion)-carcinom, la fel ca celulele stem embrionare (ESC), cresc pentru a forma corpi embrionari și necesită disociere obligatorie pentru transferul liniei, menținând pluripotența pe un strat hrănitor de fibroblaste embrionare sau în timpul cultivării în suspensie într-un mediu condiționat. Celulele liniilor pluripotente de terato-(embrion)-carcinom sunt mari, sferice, caracterizate printr-o activitate ridicată a fosfatazei alcaline, formează agregate și sunt capabile de diferențiere multidirecțională. Când sunt introduse într-un blastocist, acestea se agregă cu morula, ceea ce duce la formarea de embrioni himerici, în compoziția diferitelor organe și țesuturi din care se găsesc derivați ai celulelor de terato-(embrion)-carcinom. Cu toate acestea, marea majoritate a acestor embrioni himerici mor in utero, iar în organele himerelor nou-născute supraviețuitoare, celulele străine sunt rareori detectate și au o densitate scăzută. În același timp, incidența tumorilor (fibrosarcom, rabdomiosarcom, alte tipuri de tumori maligne și adenom pancreatic) crește brusc, iar degenerarea tumorală apare adesea în perioada de dezvoltare intrauterină a embrionilor himerici.

Majoritatea celulelor de terato-(embrion)-carcinom din micromediul celulelor embrionare normale dobândesc aproape în mod natural caracteristici neoplazice maligne. Se crede că malignitatea ireversibilă se datorează activării proto-oncogenelor în procesul de rearanjări structurale. Una dintre excepții sunt celulele liniei de embrion SST3, obținute din teratoame testiculare de șoarece (linia 129/Sv-ter), care prezintă o capacitate ridicată de integrare în țesuturile și organele embrionului fără formarea ulterioară de tumori la șoarecii himerici. Derivații liniilor celulare de terato-(embrion)-carcinom la șoarecii himerici practic nu participă la formarea gonocitelor primare. Aparent, acest lucru se datorează frecvenței ridicate a aberațiilor cromozomiale caracteristice majorității liniilor de terato-(embrion)-carcinom, în celulele cărora se observă atât aneuploidie, cât și anomalii cromozomiale.

În condiții de laborator au fost obținute mai multe linii stabile de celule de terato-(embrion)-carcinom uman, caracterizate prin pluripotență, activitate proliferativă ridicată și capacitatea de diferențiere în timpul creșterii în culturi. În special, linia de celule de terato-(embrion)-carcinom uman NTERA-2 a fost utilizată pentru a studia mecanismele citodiferențierii neuronale. După transplantul de celule din această linie în regiunea subventriculară a prozencefalului șobolanilor nou-născuți, s-au observat migrarea și neurogeneza acestora. S-au făcut chiar încercări de transplant de neuroni obținuți prin cultivarea celulelor din linia de terato-(embrion)-carcinom NTERA-2 la pacienți cu accidente vasculare cerebrale, ceea ce, potrivit autorilor, a dus la o ameliorare a evoluției clinice a bolii. În același timp, nu au existat cazuri de malignitate a celulelor transplantate din linia de terato-(embrion)-carcinom NTERA-2 la pacienții cu accident vascular cerebral.

Primele linii de celule stem embrionare pluripotente nediferențiate de șoarece au fost obținute la începutul anilor 1980 de către Evans și Martin, care le-au izolat din masa celulară internă a blastocistului - embrioblastul. Liniile ESC izolate și-au păstrat pluripotența și capacitatea de a se diferenția în diverse tipuri de celule sub influența factorilor într-un mediu de cultură special pentru o lungă perioadă de timp.

Termenul „celule stem pluripotente embrionare” îi aparține lui Leroy Stevens, care, în timp ce studia efectul gudronului de tutun asupra incidenței dezvoltării tumorale, a atras atenția asupra apariției spontane a teratocarcinomului testicular la șoarecii liniari (129/v) din grupul de control. Celulele teratocarcinoamelor testiculare au fost caracterizate printr-o rată ridicată de proliferare, iar în prezența lichidului din cavitatea abdominală s-au diferențiat spontan cu formarea de neuroni, keratinocite, condrocite, cardiomiocite, precum și fragmente de păr și oase, dar fără semne de citoarhitectură ordonată a țesutului corespunzător. Când au fost plasate în cultură, celulele teratocarcinomului au crescut ca clone pluripotente neatașate de substrat și au format corpi embrionari, după care au încetat să se dividă și au suferit o diferențiere dezordonată spontană în neuroni, glie, celule musculare și cardiomiocite. Stevens a descoperit că teratocarcinomul de șoarece 129/v conține mai puțin de 1% celule capabile să se diferențieze într-o varietate de linii somatice specializate, iar diferențierea în sine depinde de factorii care îi afectează (compoziția fluidului peritoneal, produsele celulelor mature sau țesuturilor adăugate la cultură). Ipoteza lui Leroy Stevenson despre prezența celulelor progenitoare embrionare ale liniei germinale printre celulele teratocarcinomului a fost confirmată: o suspensie de celule embrioblastice din embrionii preimplantați în țesuturile șoarecilor adulți a format teratocarcinoame, iar liniile celulare pure izolate din acestea după administrarea intraperitoneală la animalele receptoare s-au diferențiat în neuroni, cardiomiocite și alte celule somatice derivate din toate cele trei straturi germinale. În experimentele in vivo, transplantul de ESC (obținute din embrioblast, dar nu din trofoblast) în embrioni de șoarece dintr-o altă linie, în stadiile de blastomeri 8-32, a dus la nașterea unor animale himerice (fără dezvoltarea de tumori), în organele cărora s-au găsit germeni de țesut donator. Himerismul a fost observat chiar și în linia de celule germinale.

Celulele germinale progenitoare primare izolate din rudimentul genital al unui embrion de șoarece au corespuns ca morfologie, fenotip imunologic și caracteristici funcționale cu celulele stem embrionare (ESC) obținute de Stevenson din teratocarcinom și embrioblast. La himerele născute după introducerea ESC într-un blastocist, morfogeneza alofenă a organelor a fost caracterizată printr-o alternanță mozaică a unităților structurale și funcționale donatoare și receptoare ale ficatului, plămânilor și rinichilor. În unele cazuri, s-a observat formarea de cripte intestinale sau lobuli hepatici constând atât din celule receptoare, cât și din celule donatoare. Cu toate acestea, morfogeneza a fost întotdeauna realizată conform programului genetic al speciei căreia îi aparținea receptorul, iar himerismul a fost limitat exclusiv la nivel celular.

S-a stabilit apoi că proliferarea celulelor stem embrionare (ESC) fără citodiferențiere pe un strat hrănitor de celule derivate din mezenchim (fibroblaste fetale) are loc cu prezența obligatorie a LIF în medii nutritive selective, care asigură selectiv supraviețuirea doar a celulelor stem și progenitoare, în timp ce marea majoritate a elementelor celulare specializate mor. Folosind astfel de metode, în 1998, James Thomson a izolat cinci linii imortalizate de celule stem embrionare din masa celulară internă a unui blastocist uman. În același an, John Gerhart a dezvoltat o metodă pentru izolarea liniilor ESC nemuritoare din tuberculul genital al embrionilor umani cu vârsta de patru până la cinci săptămâni. Datorită proprietăților lor unice, doar doi ani mai târziu, celulele stem embrionare și celulele stem din țesuturi definitive au început să fie utilizate în practica medicinei regenerative și a terapiei genice.