Celulele stem embrionare

Descoperirea celulelor stem embrionare - nu a existat nici un accident, și a apărut pe cercetarea solului pregătit în domeniul cercetării biologie de dezvoltare. Termenul de "celule stem" a fost introdus în medicină încă din 1908 la congresul societății hematologice de la Berlin de Alexander Maksimov în legătură cu celulele hematopoietice. Cu mult înainte de izolarea și pregătirea liniilor stabile de celule stem embrionare pluripotente in dezvoltarea timpurie a procesului de cercetare utilizate terato- stem (celule de embrion-carcinom cu care a studiat mecanismele necunoscute ale embriogenezei, inclusiv secvența expresiei genelor timpurii și a produselor proteice ale muncii lor.

Dar este totuotența genomului uman pierdută iremediabil în procesul de evoluție? Nu, și embriogeneza este o dovadă. Dacă este așa, atunci când, în principiu, va fi realizată a doua cale de evoluție evolutivă? Probabil, atunci când o persoană părăsește Cosmosul, unde condițiile de mediu vor fi relativ constante de foarte mult timp. Pierderea osoasă (demineralizarea oaselor într-o stare fără greutate) remodelarea foarte lent justificabil și regenerare poate fi considerat ca fiind primul pas pentru procesul de adaptare umană ca specie a existenței în spațiu. Cu toate acestea, plata celei de-a doua căi de dezvoltare evolutivă va fi diferită - sterilitatea va fi prețul de plată a tuturor celulelor de atopotență și plasticitate absolută. Deci, înmulțirea în această lume a "chameleonilor evoluționiști" nu va avea nicio meioză, otpochkovaniem. Dar vom trăi mult. Imortalitatea telomerazei este nemurirea amoebei. Într-un organism multicelulare, celulele stem sunt substratul longevității cantitative și calitative.

[1], [2], [3], [4]

Surse de celule stem embrionare

Sursele de azi de celule stem embrionare pentru testele de laborator sunt Linia murine teratocarcinomul (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rj, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) și teratocarcinomul uman (NTERA-2, TERA-2 , H-9 clone), precum și HESS Trauneona. Cu toate acestea, prezența detaliate pașaport celular care indică fenotipul imun, rezultatele analizei cromozomiale ale profilelor de expresie mRNA expuse receptori și proteine de semnalizare intracelulară nu compensează dezavantaje semnificative teratokartsinomnyh linii ESC - pierderea rapidă a totipotența și imposibilitatea aplicării în studiile clinice și diferențierea mixtă în cultură este foarte dificil de a izola curat linie dedicată dintr-o populație heterogenă de celule. De aceea, de obicei, o sursă de linii ESC produse în scopuri clinice, serveste ca masa de celule interioare din blastocist, embrioni blastomeres individuale etapa 8 celule de dezvoltare, celulele morulă stadiile ulterioare și celulelor germinative primare.

Trebuie remarcat faptul că celulele de teratocarcinom, deși au proprietatea pluripotenței, au un potențial pluripotent semnificativ mai mic comparativ cu ESC. Integrarea lor cu celule embrionare duce rareori la formarea de himere, în care, în plus, jocurile cu genotip de celule de teratocarcinom nu se formează niciodată. Se crede că acest lucru se datorează apariției frecvente a anomaliilor cromozomiale în cultivarea celulelor teratocarcinice: o pierdere a cromozomului Y, o varietate de trisomii, ștergeri sau translocații.

Încercările de a distinge linia ESC umană au fost întreprinse de mai multe ori, însă această sarcină nu a putut fi rezolvată, deoarece blastocistele umane normale sunt dificil de accesat obiecte. În plus, la om, frecvența anomaliilor cromozomiale este mai mare decât la embriogeneza animalelor. Majoritatea preponderentă a embrionilor umani precoce obținute după fertilizarea in vitro prezintă mozaicismul cromozomial haotic și adesea există aberații numerice și structurale. Chiar și mai târziu, în stadiul de blastocist, doar 20-25% din embrionii umani constau din celule cu cariotip normal. Era aproape imposibil să se folosească astfel de embrioni pentru a crea un ESC, deoarece zigoturile erau cultivate de obicei în stadiile a două sau patru blastomeri și apoi transplantate în uter. Doar relativ recent a fost o tehnică fiabilă dezvoltată pentru cultivarea ovulelor umane fertilizate în stadiul de blastocist. Introducerea acestei tehnici în practica fertilizării in vitro nu numai că a mărit frecvența succesului în implantare, dar și a făcut ca blastocistele normale să fie un obiect mai accesibil.

O altă sursă de celule stem pluripotente este celulele sexuale primare, care, spre deosebire de populațiile progenitoare mai avansate germenativnogo epiteliu, nu sunt pe suprafața beta-integrina, dar exprimă activitate ridicată shelochnoy fosfatazei. Trebuie remarcat faptul că, în cadrul experimentului, populația de celule stem, care au fost formate din celule sexuale primare, a fost studiată începând cu anii 80 ai secolului trecut. În același timp, a fost dezvoltată o tehnică pentru izolarea celulelor germinale primare din rudimentul embrionului gonad de șoarece. Primele rezultate nereușite de cultivare a celulelor germinale primordiale in vitro sugerează inutilitatea acestor eforturi, ca celulele, deși a supraviețuit, dar nu proliferează și a murit în prima zi. Mai târziu, s-a descoperit că celulele germinale primare de șoarece reproduc in vitro numai în prezența factorilor de creștere ai polipeptidei solubile și legate de membrană în mediul de cultură. Numeroase studii au indicat faptul că este necesară prezența în mediul de cultură nu numai LIF, dar membrannosvyazannyh și factor solubil în oțel (SIF) pentru supraviețuirea și proliferarea celulelor germinale primordiale. Aceste peptide sunt produse de embrioni de celule somatice homozigoți pentru mutația Steel, iar unul dintre ele este un ligand al Ckit proto-oncogena.

Celulele germinale primare ale mamiferelor și ale oamenilor sunt de origine extragonadală și sunt sursa dezvoltării clonale a liniei celulare sexuale. Pornind linia celulelor germinale primordiale, precum și toate țesuturile embrionului și mezoderm extraembryonic dă epiblast (ectoderm primar) embrioni timpurii cu organizare structurală mozaic. Îndepărtarea microchirurgicală a diferitelor părți ale embrionului timpuriu a stabilit o zonă de localizare în epiblastul unei clone de precursori comuni ai celulelor germinale primare. Cu ajutorul dehodranului de rodamină, care a fost folosit ca marker de celule, sa stabilit că precursorii celulelor sexuale primare sunt localizați în regiunea epibastă proximală, lângă ectodermul extra-embrionar. Linia celulară primară sexuală izvorăște din clona cu 45 de celule, a cărei repartizare are loc chiar la începutul gastruării. Apoi segregarea clonei are loc, iar în timpul gastrulare, celulele sexuale primare intră în mezodermul extraembrionic și se găsesc în baza mugurelui allantois, în spatele benzii primare. De acolo, celulele germinale primare migrează spre capătul ventral al endodermic endocervix și apoi se mișcă activ de-a lungul mesenteriei, populând rolele genitale la sfârșitul migrării. În procesul de migrare, precum și în primele 2-3 zile de localizare în rudimentul gonadic, celulele sexuale primare proliferă activ și suferă opt cicluri replicative. Dacă la începutul migrării există aproximativ 50 de celule germinale primare, în chisturile reproductive ale embrionilor de șoarece de o dezvoltare de 12 zile, numărul de celule sexuale primare depășește 25.000.

Asemănarea funcțională a CSE și a celulelor germinale primordiale demonstrează integrarea deplină a acestuia din urmă, în masa de celule interioare blastocist înlocuirea și dezvoltarea ulterioară deplină a embrionului, tesutul care constau numai din descendenții celulelor germinale primordiale. Conform altor caracteristici murine celulelor embrionare primare PGCs au fost de asemenea identice, care arată capacitatea de a se diferenția în direcții diferite, pentru a forma corpuri embryoid in vitro, o forma in vivo toamele când se injectează subcutanat în șoareci imunodeficienți asemănătoare cu toamele spontane șoareci testicul linia 129 / ter.

Este stabilit că, atunci când sunt adăugate la mediu LIF și membrannosvyazannogo solubil SIF izolat celule embrionare primare de 8 zile embrioni murine supraviețuiesc și proliferează în cultură timp de 4 zile, dar apoi mor. În plus, perioada când cultura morții observate celulelor germinale primordiale coincide cu stadiul de dezvoltare a embrionilor de șoarece (12,5-13,5 zile), când gonadali celulelor germinale feminine mugurilor primari intra meiozei, mitotic și în celulele germinale primordiale masculine sunt blocate diviziune. Cu toate acestea, dacă adăugați la mediu nu numai de factori de creștere LIF și al SIF-urilor, dar și a FGF2, celulele germinale primare continua proliferirovat, și subculturi sunt formate colonii de celule se pot reproduce chiar și după ce a fost scos din mediul de factori de creștere (SIF și FGF). Astfel de celule pot fi cultivate pentru o lungă perioadă de timp pe substratul fibroblastului embrionar fără adăugarea factorului de creștere solubil LIF. Aceste linii celulare stabile derivate din celulele germinale primare au fost sugerate a fi numite celule germinale embrionare. Acest termen nu poate fi considerat de succes ca atunci când culturile EG-celule nu pot fi obtinute celulele germinale embrionare, capabile de a realiza etapele următoare ale oogenesis sau spermatogenezei. Acest lucru se datorează faptului că liniile EG-celule, deși derivate din celule germinale primordiale, ci în cultura dobândirii proprietăților celulelor stem pluripotente embrionare pierd capacitatea de a comite linia germenativnye. Cu alte cuvinte, celulele sexuale primare pierd proprietățile precursorilor gameților la cultivare și se transformă în celule pluripotent-like ESC.

Se observă că atunci când se administrează șoareci imunodeficienți EG, nu apar teratome. Se presupune că pierderea capacității celulelor EG de inițiere a teratomilor se datorează faptului că aceste linii nu au fost create direct din celulele germinale primare cultivate, dar au fost obținute din celule izolate din corpurile embrioloide. Prin urmare, este posibil ca ei să fie descendenți ai celulelor pluripotent, dar deja angajate.

Trebuie remarcat faptul că există diferențe fundamentale între celulele EG și celulele germinale primare. Acestea din urmă nu fac posibilă obținerea de embrioni de șoarece himerici, ceea ce indică lipsa capacității celulelor germinale primare de a se integra în masa internă de celule sau trophectoderm. Caracteristicile populației celulelor sexuale primare sunt mai asemănătoare cu liniile dedicate de celule somatice ale embrionilor mai târziu, introducerea cărora în blastocist nu conduce, de asemenea, la formarea de embrioni himerici.

Tehnici de modificare cultivarea organismelor embryoid obținute cu EG-agregarea celulelor permise de selecție pe medii selective pentru a primi o altă populație de celule pluripotente, numite celule“derivate din organisme embryoid (celule derivate ale corpului embryoid - EBD-celule). Capacitatea celulelor EBD de a se multiplica pentru o lungă perioadă de timp în cultură a permis crearea de linii celulare stabile de celule angajate. Au fost obținute clone ale celulelor care exprimă un spectru larg de ARNm și markeri de proteine de celule specializate. Această abordare ca urmare a demonstrat că celulele primare de sex pluripotente umane, și se diferențiază in vitro în diferite tipuri de celule: neuroni, Glia, endoteliul vascular, celulele hematopoietice, mușchi și celule endodermica.

Surse alternative de celule stem embrionare

Sursa alternativă a liniilor ESC umane poate fi celule hibride. Implantarea în uterul structurii vacilor pseudoînsămânțare geterogenomnoy obținute atunci când fuzionează prin electroporație fetusa celulelor somatice umane cu vacile de ou, care au fost scoase anterior din pronucleul, face posibilă primirea masei de celule din interior de pre-implantare de embrion stadii de dezvoltare artificiale. În acest sens, în prima etapă, se obține dintr-o vaca ou blastocist cu un nucleu de celule umane transplantate.

În a doua etapă, embrioblastul este extras din blastocist, iar din acesta - ESC conform metodei Thomson. Este de remarcat că cele mai bune rezultate în liniile ESC separare prin această metodă au fost obținute folosind miezuri de celule foliculare sau celule germinale primordiale care persistă în corpul uman într-o stare de hibernare. Acest lucru se datorează faptului că un ou de vaca transplantat celule umane neukorochennye nucleu ar trebui să aibă o activitate ridicată și telomeazy telomerilor care evită clonele ESC îmbătrânirea prematură derivate din ou hibrid (Repin, 2001). Se știe că cele mai importante proteine EGF ale markerului intracelular sunt Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, care aparțin așa-numitelor proteine de amortizare a cromatinei. Amortizoarele asigură un ambalaj deosebit de compact al heterocromatinei, care împiedică formarea de bucle de eucromatină. Pachetul de cromatină mediat de aceste proteine se corelează cu atopotența genomului ESC. Până în prezent, sa stabilit că ovulele mature ale bovinelor și ale oamenilor sunt singurul tip de celule specializate care conțin concentrații ridicate de proteine de amortizor în citoplasmă. Pe această bază, a fost elaborată o metodă pentru producerea de ESC hibride prin transferarea nucleelor de celule somatice la ovule non-nucleare de vaci. Preliminar in studiile in vitro au arătat că citoplasmă ovocitelor vaci reface totipotența genomului de nuclee de celule somatice umane după 12-24 ore de cultură.

De interes deosebit sunt date despre caracteristicile dezvoltării preimplantare a embrionilor umani, care indică o înlocuire ulterioară a celulelor totipotentă de către o populație de celule pluripotentă decât la șoareci. Studiul transformărilor celulare a arătat că celulele din masa internă a celulelor blastociste umane, în plus față de ESC, generează de asemenea celule de trofoblast, ceea ce indică potența lor totală.

Se știe că în stadiul blastocistului există două populații celulare diferite angajate. Unul dintre ele este stratul exterior al blastocistului, trofectoderm, derivat din celulele trofoblastice și alte componente embrionare ale placentei. A doua populație de celule este grupată într-o masă densă, care intră în contact cu suprafața interioară a trophectodermei. Populația celulară a masei celulare interne este derivată din toate țesuturile și germenii organelor embrionare. În stadiul blastocistului târziu, se formează un endoderm extra-embrionar din masa celulei interne și se formează un epiblast (ectodermul primar). În același timp, celulele epiblaste păstrează pluripotența, în timp ce capacitatea de a diferenția celulele endodermului extra-germen este limitată.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Obținerea celulelor stem embrionare umane

Până de curând, se credea că trofoblast obținut din hESCs imposibile. Celulele diploide Cu toate acestea stem linie trophectodermului izolate din blastocist într-un mediu care conține, în loc de LIF si heparina FGF2, proliferează și este transformat în celule stem. Dacă eliminați din mijlocul FGF2, celulele trophectodermului nu mai procreeze, ei încep endoreduplicarea de cromozomi și a elementelor celulare trofektodermalnye transformat treptat într-un celule trofoblastice gigant. Probabil, LIF nu stimulează proliferarea celulelor trophectodermului datorită faptului că FGF2 declanșează un mecanism transsignalizatsii ca FGF2, legarea de receptorul citoplasmatic (FGFR2), activarea MAP kinazei în citoplasmă - ERK1 și ERK2. Prin urmare, atunci când sunt încorporate în celulele blastocistului de o cale de semnalizare (LIF - gpl30 - Jak-Kinază - STAT3) celule de masă de celule interioare sunt transformate in hESCs pluripotente, în timp ce activarea al doilea mecanism de transmembranar de semnalizare (FGF2 - FGFR2 - MAP kinazelor ERK1 / ERK2) celulele din trophectodermului blastocist formate stem. Selectarea căii de semnalizare, la rândul său, depinde de activitatea OCT4 genei. Această genă aparținând domeniului POU, situat la locul t 17 autozomi și este exprimat în timpul ovogeneză, în perioada de strivire precum și în celulele masa de celule interioare din blastocist, și în celulele germinale primordiale. Genă funcțională Rolul Oct4 este codifică un factor de transcripție necesar pentru apariția celulelor pluripotente, diferențierea și dedifferentiation lor.

Expresia genei oct4 în ESC variază în funcție de interacțiunea acestui factor de transcripție cu cofactorii. O reglare direcțională a expresiei oct4 în blastociste a arătat că, atunci când activitatea sa scade, jumătate dintre celule formează un trophectoderm, în timp ce cu o creștere a expresiei induse de oct4, apare predominant ESC.

În cadrul experimentului, ESC nu poate fi transformat într-o linie atunci când se cultivă blastomele totipotent în stadiul de zdrobire, precum și în stadiul de gastrulare și etapele ulterioare de dezvoltare embrionară. Mouse-ul CSE aloca de obicei la 3,5-4,5 zile de gestație, care corespunde celui de al șaselea (un singur strat al blastocistului) și etapele a șaptea (cu două straturi din blastocist - un cilindru ou timpuriu) embriogenezei normal. Evident, numai în perioada de preimplantare embrionii de șoareci conțin populații celulare care pot fi transformate în ESC. În consecință, izolarea liniilor ESC este posibilă numai în anumite stadii de embriogeneză. Totuși, din punctul de vedere al posibilității de a dezvolta un embrion viabil cu membrane embrionare și placentă, sunt zigotul și blastomerele care apar în timpul zdrobitorii. Pierderea potenței totale a celulelor germinale începe la stadiul morlei târzii, în timp ce distribuția suplimentară de blastomeri depinde de locația lor. Early Morula blaetomers păstrează totipotency, deoarece manipulările experimentale cu schimbări în locația lor, de exemplu, inversarea locației lor, nu împiedică dezvoltarea unui embrion complet.

Sa constatat că eficiența eliberării ESC în linie este afectată de starea blastocistului la momentul explantei. Utilizarea blastocysts după o simulare de șapte zile de diapause in tractul genital al șoarecilor, ovariectomizat la 3,5 zile de gestație și tratate cu progesteron, contribuie la o separare mai eficientă a liniilor de celule stem embrionare. Se presupune că în astfel de condiții numărul blastomerilor care formează masa celulară interioară crește. De asemenea, este posibil ca ciclul celular să se extindă și cele mai multe blastomeri să intre în faza G0.

Mai mult, crearea de linii hESC pluripotente stabile depinde de embrioni genotip: destul de ușor diferențiate de CSE Murine blastocysts linia 129, este mult mai dificil de a le obține folosind șoareci CS7BL / 6 și practic imposibil de a izola linia de hESCs blastocysts șoareci CBA / Ca. Evident, embrionii timpurii posedă anumite trăsături genetice care afectează dezvoltarea liniei ESC pluripotent. Cu toate acestea, atunci când epiblast cultivate izolate, precum și prin selectarea selectivă diferențierii liniei celulare hESCs de la embrioni timpurii au fost încă alocate șoareci CBA / Ca.

O tehnică standard dovedită pentru obținerea de linii ESK din blastociste este dată în manualele de laborator privind tehnica de experimentare a embrionilor timpurii. Liniile ESK experimentale pot fi de asemenea obținute prin cultivarea unui epiblast izolat (ectoderm primar) de embrioni de șoarece de 4,5 zile cu o tehnică microchirurgicală destul de complexă și cu condiții de cultivare modificate. Complexitatea acestei proceduri este justificată, deoarece frecvența formării liniilor ESC a fost mult mai mare decât în cazul lucrului cu masa celulară internă a blastocistului.

Pentru a izola liniile ESC, fiecare clonă este transferată într-un micro-godeu, un agregat de 40-60 celule este crescut, este din nou dispersat. Repetări multiple ale acestei proceduri permite obținerea unor linii ESK imortalizate cu celule maxime normokariotipnyh rata de proliferare atașate de plastic, care prin pasaje 50-100 păstrează activitate ridicată telomerazei totipotența și. În procesul de susținere linii ESC pentru cel mai mare pericol este poluare sau ser de endotoxine bacteriene - chiar urme de concentrare endotoxinei în mediul de cultură a cauzat moartea în masă a celulelor germinale imature. Cu un control atent al creșterii liniare și dispersia în timp util a CSE în cultură sunt capabile de fisiune simetrică, în care ambele celule fiice rămân pluripotente și capabil de a efectua un număr nelimitat de cicluri celulare, menținând un cariotip diploid și potența totală.

Selectarea unei populații curate de ESC uman poate fi efectuată după transfecția în genomul lor a moleculelor de ADN recombinant care conțin o genă care codifică sinteza unei proteine fluorescente verde (GFP). Expresia GFP crește odată cu creșterea ESC în condiții care susțin proliferarea lor, în timp ce odată cu debutul diferențierii, nivelul de expresie al acestei gene este redus, ceea ce permite selectarea liniilor celulare pluripotent stabile pe un mediu selectiv. Când se cultivă cu selecția GFP a CES, frecvența coloniilor este mult crescută, deoarece în condițiile culturilor selective se elimină efectul puternic antiproliferativ al celulelor diferențiate.

Traducerea celulelor stem embrionare umane in linie, prin metoda de izolare a embrionilor preimplantare (etapa 80-120 celule), care rămân după procedura de fertilizare in vitro. Pentru aceasta, embrionii "în exces" obținuți artificial sunt dispersați mecanic în mediul Delbecco-Needle. După marcarea celulelor cu anticorpi monoclonali etichetă fluorescentă selectivă embryoblast celule izolate. Embrioblastul este dispersat în celule individuale utilizând un amestec de dezaspază-colagenază. Celulele disociate au fost crescute într-un mediu special (80% mediu Delbekko + 20% ser fetal de vițel în prezența a 500 pg / ml de IL-6, LIF și SCF) pe monostrat de fibroblaste embrionare de alimentare 3 primele treceri. Astfel, supraviețuirea și proliferarea celulelor stern și progenitor este menținută prin expunerea la IL-6, LIF și SCF. În acest mediu, hESCs de suspensie cresc clone osharennyh celulele neatașate să fie disociate prin pipetare multiple blând. Clonele noi apar în cultura suspendată în ziua a 5-a și a 7-a. Rata maximă de creștere a ESC se realizează prin disocierea repetată a clonelor în stadiul de 10-15 celule. Apoi, fiecare clonă este transferată într-o microcelula și crescută la un agregat de 40-50 celule. Procedura se repetă de mai multe ori în pasajele, creșterea volumului culturii la o densitate de 5-10 milioane de celule pe vas de 6 cm. Folosind o astfel de Thomson pasajul a fost izolat 10 clone CSE umane nemuritoare care prin canalele 100 păstrează activitatea ridicată a telomerazei, capacitatea de proliferare intensă și caracteristicile fenotipice potența minimă totală, cu diferențierea în oricare dintre cele 350 de linii de celule specializate, care sunt derivate ecto-, mezo- - și endoderm. Diferențierea ESC umane a început (la schimbarea mediului, adăugarea și eliminarea LIF ser) cu atașarea celulelor la substrat, indicând dezvoltarea citoscheletului și expresia receptorilor de adeziune. Este important ca, cu proliferarea nerestricționată a CES umană, să se păstreze un cariotip normal.

A doua metodă de izolare a liniilor ESC umane se bazează pe utilizarea celulelor sexuale primare. Studiile experimentale au arătat că liniile de celule Eu pot fi obținute din plăcile genitale ale embrionilor de șoareci de 12,5 zile. Cu toate acestea, în aceste cazuri, frecvența formării liniilor celulare progenitoare a fost semnificativ mai mică decât în cazul experimentelor cu embrioni anteriori. În același timp, celulele sexuale primare din gonade de embrioni de șoarece de vârstă gestațională de 13,5 zile sunt, în general, incapabile să se transforme în linii.

Primele linii stabile de celule EG pluripotentă umană au fost obținute din gonocite primare izolate din mugurii genitale de embrioni vechi de 5-9 săptămâni. Celulele izolate au fost cultivate pe un substrat de șoarece inactivate fibroblastele embrionare în mediu DMEM cu ser fetal, la care sa adăugat mercaptoetanol, forskolin, precum și factori de creștere uman recombinant (FGF și LIF). După 7-12 zile, coloniile multicelulare au apărut în cultură, în funcție de trăsăturile morfologice și markerii moleculari care corespund celulelor EG umane. După agregare, aceste celule au format corpuri embrioloide, cu dezvoltarea ulterioară a căreia apar celule specializate, caracteristice pentru derivații tuturor celor trei frunze embrionare. Pe parcursul a 10-20 de pasaje liniile celulare EG au păstrat cariotipul normal și nu au pierdut pluripotența.

Se arată, de asemenea, că efectul combinat al LIF, factori de oțel legați la membrană și solubili, precum și TGF-b, modifică programul pentru dezvoltarea celulelor germinale primare. În loc să oprească diviziunile mitotice și să înceapă să se diferențieze față de oogeneză sau spermatogeneză, celulele sexuale primare continuă să se prolifereze. După câteva cicluri mitotice suplimentare, ele devin similare cu celulele epiblaste și, pierzând proprietățile precursorilor celulelor germinative, sunt transformate în celule EG de tip embrionic stem pluripotente.

Astfel, în 1998, liniile imortalizate ale celulelor sexuale primare au fost izolate mai întâi de rudimentul sexual al țesutului uman de autopsie fetală. Embriogenezei celulelor embrionare umane primare apar în sacul vitelin în a treia săptămână de dezvoltare, și în săptămânile 4-5, aceste celule migrează în zona tubercul sexuale, în cazul în care acestea formează o populație de gonocytes dormantnye primare. În starea inactivă, celulele germinale primare rămân în mugură până la naștere. Linii de celule germinale primare au fost extrase din fetale tuberculoși genitale embrionilor de 5-9 săptămâni vechi extrase tesatura ex tempore care este tratat cu un amestec de colagenază tip IV-V, hialuronidaza și DNază pentru randament cantitativ și calitativ creșterea celulară. Celulele germinale primare din țesuturile tuberculilor genitali fetali sunt înconjurate de celule stromale (mezenchimale) Sertoli. Scopul funcțională a celulelor Sertoli este producerea de factori anti-apoptotice (Fas-ligand), mitogeni și agenți imunosupresori care protejează celulele stem sexuale de atac imun de către organism. În plus, micromediul stromal al tuberculilor genitali joacă un rol important în maturarea gameților. Celulele germinale primare izolate sunt plantate în cultură pe stratul stromal feeder care constă din fibroblastele fetale din primele trei pasaje. Cea mai eficientă combinație de mitogeni este un complex format din LIF, FGF și forskolin (un stimulant pentru formarea cAMP). Proliferare celulelor germinale primordiale in vitro necesită adăugarea de ser fetal, în prezența unei gonocytes reproducere primare în clone de cultură, însoțite de formarea de celule globulare, non-aderente la substrat.

US National Institutes of Health, pe baza rezumarea informațiilor existente privind metodele de alocare a liniilor ESC umane din blastocite a fost făcută o concluzie preliminară că alocarea cu succes a CES este cel mai probabil atunci când blastocite de cultura cu masa de celule interior bine formate (celule stem: progresul științific și direcții viitoare de cercetare Nat. Inst, din Health USA). Din acest punct de vedere, cea mai bună sursă de CSE pentru a crea linii sunt umane blastocist a 5-a zi de dezvoltare, din care alocarea a masei de celule din interior trebuie să fie îndepărtați cu atenție trophectoderm. Izolat masa de celule din interior care constă în această etapă a 30-35 de celule trebuie sa fie cultivate pe un substrat de fibroblaste embrionare murine, care este o condiție decisivă pentru formarea coloniilor în cultura hESCs.

Analiza caracteristicilor fenotipice ale celulelor stem embrionare

De interes deosebit este analiza comparativă interspecifică a caracteristicilor fenotipice ale CES. Sa constatat că coloniile umane ESC - un cluster dense de epiteliale celule aplatizate, în timp ce șoarecii de vițel embryoid constau conglomerat în vrac de celule rotunjite. În ESC uman, indicele raportului nuclear-plasmă este mai mic decât în ESK de șoarece. Celulele stem embrionare ale maimuțelor formează mai multe colonii celulare plate cu muchii inegale. În clonele timpurii ale primatelor ESC, celulele singulare sunt ușor de văzut. ESC proliferativă a tuturor speciilor de animale studiate nu exprimă molecule MHC din clasele I și II. În același timp, CSE uman da un răspuns pozitiv la anticorpii TERA 1-60 și GCTM-2, ceea ce indică prezența pe cheratinei suprafață / condroitin sulfat, proteoglicani caracteristice embrionare (teratoamelor) celulele stem -kartsinomnyh. Exprimarea în hESCs toate tipurile de animale gena Oct4 sugerează că, în ciuda diferențelor fenotipice în CSE umane și de șoarece, aparent activate de același set de gene responsabile pentru mentinerea pluripotency (Peru, 2001). În plus, liniile ESC derivate de la șobolani embrionice, porci, iepuri, primate și bovine, au caracteristici morfologice similare, un set similar de identificare moleculară a markerilor și un mecanism molecular aproape identic pentru punerea în aplicare a programului embriogeneză care vă permite să ia o privire proaspătă la problema xenotransplantul .

Spre deosebire de embriogeneză normale in vivo, proliferarea in vitro a hESCs nu este însoțită de formarea de straturi germinale și continuă pentru a bloca fundal Nohgenov mutațional, adică fără organogeneză. Deoarece genele segmentare nu funcționează în cultura hESCs imposibil de reprodus astfel de perioade embriogenezei ca segmentare tab somite a nucleului, formarea de sac vitelin, alantoida organe și țesuturi și altele provizorii. CES de cultură au fost înghețate la începutul formării a 350 de linii de restricție ale celulelor specializate. Astfel, celulele progenitoare clona subsidiare si PGCs localizate central sunt doar embrion de model în timpul dezvoltării, în care regiunile de țesuturi diferite sunt formate într-o singură etapă sunt diferite de celule specializate derivate, cu toate acestea, din precursori comuni. Deși nivelul minim de receptori de pe suprafața hESCs, își păstrează capacitatea de a efectua procese morfogenetice primitive simulând cea mai mare parte a structurii embrionului timpuriu: hESCs șlam în cultură și agregate formează o structură asemănătoare cu blastocist sau chiar mai târziu embrioni (cilindri de ou). Astfel de agregate de suspensie au fost denumite în mod corespunzător organisme simple și complexe embrioloide.

Când se amestecă diferenția în diferite celule ale corpului embryoid exprimate simultan de ectoderm precoce gene (Oct3, FGF-5, nodal), endodermului (GATA-4), mezoderm (brachyury), mezoderm cardiogen (PKH-2,5), tub neural (msx3 ) și hematopoieza (elkf). Folosind diferite combinații de citokine și factori de creștere pentru țintirea formarea celulelor din stratul germene in vitro într-un număr de cazuri, a fost posibil să se obțină corpuri embryoid, care au fost exprimate de preferință gene ectoderm sau mesoderm, care deschide calea spre modelarea gastrulation si faza organogeneza timpurie.

Creștere Clonal hESCs este dovada diviziunii celulare asimetrice, în care doar unul dintre ESC în clona centru își păstrează nelimitativ capacitatea de reproducere, în timp ce cealaltă celulă fiică dă naștere la producerea de celule precursoare, diferențierea este deja vine. Prin urmare, rata de multiplicare a clonei la periferia corpului embrionar este mai mare decât în centru. Celulele marginale ale clonei în creștere suferă o diferențiere spontană dezordonată, migrează sau mor prin mecanismele de apoptoză. Aceste evenimente determina soarta clonei în cazul în care rata de proliferare depășește rata migrației și moartea celulelor apoptotice, clona dimensiuni continuă să crească, stabilizarea are loc cu apoptoza egal și viteza de formare a vitezei de celule noi, regresie - raportul invers al acestor procese. Celulele progenitoare se împart în mod simetric, adică ambele celule fiice sunt în continuare diferențiate în linii de celule specializate mature. Raportul dintre celulele ESC / progenitoare variază, dar întotdeauna cantitatea de ESC este doar o fracție a unui procent din populația de celule progenitoare. Prin urmare, doar pipetarea atentă și dezagregarea în timp util a clonelor pot crește numărul de CES în cultură. Pentru a obține randamentul maxim al ESC, cea mai eficientă a fost dezagregarea clonelor în stadiul de 10-12 celule. Direcția și gradul de diferențiere a celulelor din corpul embrionar depind de localizarea acestora. Exterior celulele corpului embryoid nu exprimă gena si Oct4 sunt supuse diferențierea în celule endoderm primare care au format ulterior celule epiteloide și parietal extraembryonic endodermului visceral. Celulele interne ale corpului embrionar exprimă gena oct4 și păstrează pluripotența timp de 48 de ore de cultură. Dar apoi reorganizarea morfologică are loc în cultura monostrat epiteliale incepe si expresia genelor care controlează dezvoltarea ectoderm primare. Apoi începe procesul de citodiferențiere totală dezordonată cu apariția diferitelor tipuri de celule care sunt derivații tuturor celor trei foi germinale. În procesul de diferențiere spontană a celulelor corpului embryoid apar mai întâi agregate markeri endoderm sub formă de fragmente (chisturi) sac vitelin. În plus, în aceste structuri apar angioblaste și celule endoteliale ale capilarelor crescute. In stadiile finale ale diferențierii spontane a celulelor interne ale corpului embryoid dezvoltă diferite celule diferențiate terminal, inclusiv neuroni, elemente gliale, cardiomiocite, macrofage și eritrocite. În anumite aproximație (considerând inversarea spațială a foilor care formează țesutul embrionar) prin intermediul organelor embryoid in vitro pot explora procesele morfogenetice și analizează mecanismele moleculare ale perioadei inițiale citodiferentiere embrionare și stabilesc rolul genelor specifice în implementarea acestor procese.

Astfel, în cadrul clonei sunt celule în care sunt descoperite diferite programe de dezvoltare genetică - CES, progenitori timpurii și populații progenitoare diferențiate. Cultivarea ESC prin metodele unei picături de coborâre sau a unei culturi de masă fără un strat alimentator și fără adăugarea de LIF în mediu conduce în mod inevitabil la formarea de corpuri embrioloide. Morfologia celulelor straturilor exterioare și interioare ale corpurilor embrioloide este diferită. Stratul exterior constă din celule mari de proces. Suprafața lor, cu care se confruntă mediul, este acoperită cu numeroase microvilli. Stratul exterior al celulelor este separat de membrana bazală internă asemănătoare membranei Reichert, în timp ce celulele stratului interior al corpurilor embrioloide sunt un epiteliu cilindric. Din punct de vedere morfologic, stratul interior, deși conține multe celule divizante, reamintește mai mult coloniile ESC nediferențiate.

Caracteristicile celulelor stem embrionare umane

Absența interacțiunilor-parenchimatoase mezenchimale la semnalul de fond de blocare gene homeosis cauzează o creștere dezordonată a PGCs în cultură, deoarece această filă este rupt, iar infrastructura de formare a organelor provizorii. Creșterea neorganizat și diferențierea spontană dezordonată a hESCs în cultură din cauza lipsei de marcare cadru stromale organismelor viitoare mezenchimale: in vitro, este posibilă formarea de milioane de hepatocite, dar nu se poate obține orice segmente ale ficatului, inclusiv astfel de elemente structurale și funcționale, cum ar fi sinusurile, spațiul de celule Disse și Kupffer.

Se crede că pluripotency CSE realizate exclusiv în embriogeneza pentru a forma țesuturi și organe ale embrionului, în timp ce cordonul ombilical și placenta sunt derivate trofoblast. Închisă într-un înveliș trofektodermalnuyu ESK genera in mod constant clone de celule Provizoriu program de dezvoltare realizând prin ARNm combinatorii matrice topografic vrac Nohteyaov, care predetermină dispunerea spațială, forma, dimensiunile, numărul de celule de organe provizorii și definitive și ansamblul parenchimului în unitatea structurală și funcțională. În același timp, ESC sunt singurul tip de celule în care mecanismul molecular de realizare a potențialului lor complet disociat de programul genetic al dezvoltării și ESCOs înșiși lipsiți de posibilitatea interacțiunii cu alte celule din cauza blocării ambelor percepții receptorilor și sisteme transsignalizatsii. Cu toate acestea, CSE de activare rezultate adecvate în desfășurare treptată embriogenezei programul final de naștere este complet format și gata de viață extrauterină a unui organism compus din miliarde de celule. În acest timp scurt, dar datoria de neimaginat în calea celulară spațiu apariția inevitabilă a erorilor în mecanismele moleculare care asigură funcțiile vitale ale celulelor, precum și în programele care controlează proliferarea lor, diferențierea și specializarea. Prin urmare, în farmacogenomia modernă, luăm în considerare separat bolile structurii moleculare și boala programării celulare. Iar acțiunea majorității de noi medicamente pentru corectarea numele programului de diferențiere, proliferare și organogeneza, precum și regenerarea organelor și țesuturilor. În organismul adult prin CSE devine posibil controlul comportamentului celulelor stem / progenitoare transplantate in creier, ficat, splina, măduva osoasă și alte organe ale omului pentru a repara un recipient deteriorate organe parenchimatoase datorate celulelor mezenchimale donator de diferențiere și specializare matrice conservate. În esență, programul totipotența lansează un alt ovocit genomului nivel, zigoti si blastomeres, dar aceste celule nu este încă posibil să se cloneze și cantitățile în pasaj necesare pentru nevoile de medicina experiental și practice. Prin urmare, CES este o sursă unică de informații genetice care conține hartă tridimensională liniară de restricție a embrionului și codurile de linii de celule specializate în timpul gastrulation.

Practic, posibilitati nelimitate de regenerare ESC datorită faptului că genomul lor, in contrast cu aparatul genetic al celulelor somatice diferentiate, mentine pluripotenei. O manifestare a stat latente înrădăcinate în CSE informație genetică este așa-numitul fenotipul minim - pe suprafața ESC de exprimare a unui număr limitat de receptori, și, prin urmare, implementat foarte puține programe pentru a interacționa aparate nucleare transsignalizatsii a celulei cu micromediul sale. Pe fondul de gene responsabile de hibernare pentru restrângerea liniilor de celule specializate și diferențierea celulelor, activate doar aproximativ 30 din cele 500 de gene ale căror produse oferă celule de comunicare cu micromediul din jur. Folosind metoda de analiză serială a expresiei genelor arătat că generalitatea principale cutii genomului funcționale de reglare a energiei și a metabolismului în celulele somatice și CSE în ultima cantitate extrem de mică determinată de ARNm al receptorilor, proteinele G, mesagerilor secundari, transcriptases, cofactori expresie și represiune , adică întregul sistem de transfer transmembranar al semnalului de reglementare în celulă. Acest lucru se datorează lipsei sau exprimării foarte scăzute a genelor de transsanalizare. În timpul diferențierii induse în genomul ESC 18 oprirea funcționării sincronă gene pentru fond de activare transsignalizatsii 61 gene care controlează sinteza receptorilor de adeziune celulară, componente ale matricei extracelulare funcționale, restricție transcriptases elementelor messendzhernyh și a sistemului de transmisie a semnalului pentru o unitate nucleara cu receptorii plasma membranei celulare. Blocat simultan expresia genelor responsabile pentru sinteza proteinelor amortizoare de zgomot, precum și expresia genelor koingibitorov oferind hESCs totipotența genomului.

Au fost găsiți markeri genetici pentru celulele celor trei pliante embrionare. Strat celular ectodermal Identificare efectuat asupra expresiei genelor nodal, Oct3 și FGF-5, celule mesodermal - gena brachyury, zeta-globina, endodermului - la expresia genelor GATA-4. In embriogeneza normale, în timpul gastrulation observat o migrare activă a populațiilor imature de celule stem si a celulelor progenitoare, desemnând local zone ale oaselor faciale ale craniului, unele parti ale creierului, sistemului nervos periferic, sistemul de conducere cardiaca si tesutul timusului care sunt formate din clone de celule deplasate. Etichetare de celule genelor timpurii straturi germinale ușurează analiza topografica a migrării celulelor progenitoare în dezvoltarea embrionului. Se găsește în special că celulele din expresia P19 agregate embryocarcinoma primei brachyury genei mezoderm începe în timpul reducerii expresiei genei de activator tisular al plasminogenului, o-fetoproteina, keratina 8 și cheratină 19, care sunt markeri ai populațiilor migratoare din mezoderm timpurie. Prin urmare, formarea de țesuturi de origine mesodermal începe numai după procesul celulelor progenitoare mesodermal migrației și punct de sedimentare.

Cu caracteristici fenotipice extrem de limitate și absența majoritatea blocurilor transsignalizatsii totuși ESC exprimă unele molecule receptor care pot fi utilizate pentru a le identifica. Este demn de remarcat faptul că antigenii-markeri ai ESC la om și la primate s-au dovedit a fi obișnuiți. Cel mai des utilizat pentru hESCs etichetarea etichetate anticorpi la antigeni membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (antigene lipidice unice reprezentând GL7 glycolipid complex cu acid sialic), precum și glicoproteine polimer de mare TRA-1-81, TRA-1-60. Mai mult, hESCs exprimă antigenul specific embrionar SSEA-1 și a fosfatazei alcaline endogene, precum și un factor specific de transcriere Oct4. Aceasta din urmă este necesară pentru menținerea hESCs mecanismelor de proliferare - genei factorului de transcripție specific Oct4 activeaza expresia factor de creștere fibroblastic 4 expresia genelor si stabilizeaza box responsabil pentru non-limitativ reduplicare ADN în celule imature. Cele mai importante proteine intracelulare sunt markeri Oct3, Oct4, TCF și Groucho, legate de proteinele cromatinei-amortizoare de zgomot.

Aproape imediat după cultura de CES incercarile pe termen lung nu are succes, iar organismul a fost preparat mai întâi prin cultura de celule stem izolate din blastocite de șoarece, și cultura de celule germinative primare, a început etapă ESC pluripotența studii de capacitate atunci când este administrat în primele stadii ale dezvoltării embrionului. Sa demonstrat că la morulă și PGCs blastocist sunt capabili să formeze embrioni himerici în care PGCs donator descendenții detectați în toate țesuturile somatice și chiar în gârneți. Astfel, in Developmental Biology folosind ESC scripting „punte“ între studiile experimentale in vivo și in vitro, care a crescut în mod semnificativ posibilitatea de a studia procesele Bookmarks țesuturi primare și organe, diferențierea lor și organogeneză embrionare.

Este bine stabilit faptul că, in vivo în timpul embriogenezei ESK integrate in masa de celule de embrion timpuriu și derivații lor se găsesc în toate organele și țesuturile. PGCs coloniza germinativă unei celule germinale himerici, dintre care descendenți formează ou integral și sperma. Celulele stem embrionare sunt clonogenic - PGCs singulare pot crea genetic identice cu o colonie de celule cu markeri moleculari, care includ expresia Oct4 genei și fosfataza alcalină, activitate ridicată telomerazei, precum și exprimarea antigenelor embrionare specifice.

Pentru a studia mecanismele de embriogeneză folosind tehnica hESCs himerizare morula prin crearea unei structuri biologice, care este situată în afara PGCs strat blastomeres tetraploid recipient si de donatori sunt administrate în. Astfel, trophoblast formată din descendenții blastomeres tetraploid recipient care permite implantarea și placentația și PGCs donator care acționează ca masa de celule interioare, care este format dintr-o linie germene viabilă a corpului și progenitoare gârneți primari. Valoarea de studiu ESC constă nu numai în faptul că, atunci când manipularea in vitro cu genomul lor păstrat pluripotency, ci și în faptul că, în timp ce conservând capacitatea de a participa la formarea hESCs celulelor germinale primordiale ale embrionului himeric. Se arată că numai un puii de PGCs modificate genetic coloniza toți germenii primari și care formează tesatura embrion himeric obținut prin agregarea sau cocultură celulelor cu embrion 8 celule. Când transplantate în șoareci CSE morula transfectate cu gena proteina verde fluorescentă, descendenții fluorescente ale celulelor au fost găsite în toate țesuturile investigate ale embrionului in curs de dezvoltare (Shimada, 1999). Transplantul de ESC în morulă poate crea soareci viabile, corpul care constă numai din descendenții donat CES, care deschide oportunități pentru o varietate de opțiuni de donare terapeutice. Acum, o astfel de abordare metodică a fost aplicată cu succes pentru a studia problemele de biologie de dezvoltare, în special, se poate analiza mecanismele genetice de inactivare a cromozomului X sau instabilitatea epigenetic hESCs. Transplantarea ESC in embrion timpuriu este utilizat în domeniul biotehnologiei agricole, precum și în terapia genică experimentală.

Transplanturile de ESC modificate genetic sunt utilizate pentru a testa celulele țintă ale genelor mutante. Culturile ESC cultivate in vitro sunt utilizate în biotehnologie pentru a crea șoareci knock-out. În acest scop, prin recombinare omoloagă să fie îndepărtat din gena CSE studiu (knock-out) și medii selective secreta celule lipsit de aceasta gena. Apoi, ESCs sunt injectate în blastocist sau agregate cu blastomere de morula. Astfel obținuți embrionii timpurii himerice sunt transplantate într-o femelă recipient și șoarecii nou-născuți selectați dintre indivizi cu gârneți, nullizigotnymi acestei gene. Cu această tehnologie, multe linii de șoareci knock-out au fost create, care sunt utilizate pe scară largă în biologia experimentală și medicina experimentală. La aceste modele biologice a studiat valoarea anumitor gene in dezvoltarea embrionara, precum și rolul acestora în mecanismele de boli și stări patologice la om. În plus, liniile animalelor knock-out sunt folosite în faza de testare preclinică a noilor metode de terapie genică. De exemplu, folosind transfecția genei în ESK alelă normală a genei mutante gestiona eficient corectate mutație, lovește sistemul hematopoietic. Introducerea genelor străine în ESC permite crearea de linii de animale de laborator transgenice homozigote la o rată accelerată. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că tehnica direcționată de recombinare a genei deleția credibil a lucrat ca inca numai relativ soareci ESC. Folosind CSE murine knock-out dublu instalat de cluster funcțional rol zona de gene de pe cromozomul 7 (regiune genomică copie cromozomului 19 minute uman), iar porțiunea proximală a cromozomului 11 (copie cromozom 5d uman) - eliminarea acestor gene în Șoarecii ESK au permis evaluarea funcției analogilor lor la om.

Studiile funcționale capacitate de gene embrionare umane, transfectarea in gene care animalele de laborator au permis hESCs în special cripto clarifice rolul genei în tab-ul și care formează gena mezoderm cardiogen, pax-6 - in ochi embriogeneza. Constituie prima expresie a genelor în imature carte de proliferante ESC teratocarcinom și șoarecii blastocist au confirmat represiune coplesitoare in gene transsignalizatsii ESK. Combinația de CSE mutante 60-80 și 20-30 celule de embrioni mouse-ul normal de pre-implantare duce la dezvoltarea de embrioni himere în care semne de carte corpurile sunt formate din celule donatoare și beneficiare, care ne permite de a determina rolul genelor necunoscute în gastrulation și organogeneza. Harta funcțională a genei în curs de dezvoltare embrioni mouse-ului detalii mărite ale rolului genei filei SF-1 în glanda suprarenală și primordii genitale, greutate-1 gena - in rinichi gene de familie fila MyoD - în fila familiei scheletic de gene musculare GATA-1-4 - în maturizarea restricție rudimentele de eritro- și limfopoieză.

Regizat off de alele materne si paterne ale genelor in hESCs folosind recombinaza vector a servit pentru a clarifica funcțiile diferitelor gene în timpul embriogenezei timpurii si tehnologia țintire a genelor necunoscute umane in CSE mouse-ul contribuie la descoperirea de noi gene mutante responsabile pentru dezvoltarea unor boli ereditare grave. Folosind metoda knockout definit semnificația unor gene obligatorii pentru pozarea țesuturi embrionare: GATA-4 - pentru infarct, GATA-1 - la eritroide tesut hematopoietic, MyoD - musculaturii scheletice, brachyury - pentru restricție mesodermului transcriptases hnf3 și hnf4 - pentru celulele stem hepatice,-rag 2 - marcaje pentru clone de limfocitele T și B (Repin, 2001). ștergerea dublu de gene in hESCs a deschis accesul la studiul rolului funcțional al genelor a straturilor germinativ, segmentarea și homeosis și transplantul CES dat posibilitatea de a obține embrioni hibrizi interspecifici viabile. Cu metode îmbunătățite de transplant de PGCs donator într-un singur embrion 8 celule dovedit că himerizare la nivel celular al multor organe ale embrionului destinatar. Rețineți că varza de celule se gasesc in tesuturi organe șoarecii primitori umani după administrarea de celule stem hematopoietice umane într-un blastocist. Sa constatat că în embrioni de șoarece în timpul formării organelor sanguine hESCs pluripotente circulante. Este posibil ca funcția lor biologică este organizarea viitorului sistemului imunitar fetal. Cu ESC in vitro reproduce modele adecvate de boli genetice umane: modele de knock-out dublu gena distrofină la șoarecii de distrofie musculară Duchenne, gena shutdown atm (control semnal de sinteza kinazei cromatina) - ataxie-teleangektaziyu. În acest caz, o boală ereditară fatală la copii din cauza unor defecte repararea ADN-ului se dezvolta degenerarea celulelor Purkinje din cerebel, care este însoțită de o involuție a timusului din cauza moartea celulelor proliferante. Clinic, fiziopatologia și patomorfologija tazii-ataxie teleangek- reproduse prin introducerea în ESC informații genetice anormale de la șoareci himere corespund celor la om. Mai mult ataxia-teleangektazii folosind PGCs și șoareci knockout dezvoltat model experimental, unele ereditare boli umane homozigote asociate cu tulburări ale metabolismului glucidic și lipidic, catabolismul aminoacizilor, îndepărtarea cuprului și bilirubinei, care a crescut în mod semnificativ posibilitatea de medicina experimentala pentru testarea preclinice de noi metode pentru tratarea bolilor relevante persoană.

[12], [13], [14], [15]

Utilizarea citochiblului de celule stem

Celulele hibride obținute prin fuziunea celulelor somatice din hESCs, sunt modelul adecvat și promițător pentru studierea pluripotența de celule stem si reprogramarea cromozomi de celule diferențiate. Tsitogibridy obținut prin fuziunea ESC cu celule diferențiate ale animalului adult, oferă o oportunitate de a studia relația dintre genomul de diferite „vârste“: dezvoltă o situație unică în care cromozomi omologi derivate din celule de diferite stadii de diferențiere și grade de maturitate care variază, sunt în același nucleu, unde ele pot cu ușurință transdeystvuyuschimi partaja semnale de reglementare. Este dificil de prevăzut cum va reacționa tsisregulyatornye sistemul epigenetice de cromozomi omologi existente în timpul yN dezvoltare împărțit, ca răspuns la semnalele de impact transdeystvuyuschih din genomul conexe embrionice. Mai mult decât atât, în celulele hibride se produce segregarea cromozomilor parental, care permite de a studia interacțiunea dintre gene la nivelul cromozomului separat, adică identifica potential partea de cromozomi specifici in mentinerea pluripotency sau dimpotrivă, o ieșire în diferențiere.

Ca primul model experimental pentru studierea interactiunii genomurilor de diferite „istoria de dezvoltare“ utilizat tsitogibridy obținut prin fuziunea teratokartsinomnyh pluripotente și celule somatice diferențiate. În unele cazuri, astfel de celule hibride au păstrat proprietăți pluripotent la un nivel suficient de ridicat. In particular, teratokartsinomno celulele hibride somatice in vivo au fost induse dezvoltarea teratoamelor adevărate care conțin derivați de toate cele trei straturi germinale, o in vitro în culturi în suspensie formate corpurile embryoid. Chiar și în acest tip de interspecies tsitogibridov remarcat prezența antigenelor fetale în cazurile în care partenerul somatic în fuziunea cu celule de teratocarcinom au fost limfocite sau timocite. Este de remarcat faptul că cito-hibrizii creați prin fuziunea celulelor de teratocarcinom cu fibroblaste corespund fibroblastelor în funcție de fenotip.

Cel mai important este faptul că un fapt stabilit că în teratokartsinomno celule hibride somatice au apărut semne genomului reprogramarea celulelor diferentiate, caracterizate printr-o reactivare a genelor individuale sau inactive X-cromozom partener somatic. Astfel, rezultatele cercetării asupra celulelor somatice de tip teratokartsinomno-tsitogibridah indică faptul că celulele hibride reținute de multe ori pluripotența si reprogramarea genomului, există semne de partener somatice.

In experimente pentru a obține celule hibride intraspecifice embrionare prin fuzionarea splenocitelor cu animalul CSE șoarece adult studiat caracteristici precum tsitogibridov, analiza segregarea cromozomilor parentale si a genomului pluripotency hibrid evaluat. Pentru celulele hibride interspecifice produse de celulele teratocarcinom de fuziune cu celulele somatice, în general caracterizate prin segregare redusă de cromozomi cu cariotip tetraploid sau aproape tetraploid. O compoziție cromozomală similară a fost observată în citotoxibul prin fuziunea celulelor sexuale primare cu limfocitele. În același timp, celulele hibride interspecifice obținute ca urmare a fuziunii de nurcă șoarece de limfocite teratokartsinomnyh de celule, a existat segregare intensă a cromozomilor partener somatic.

O etapă calitativ nouă în studiul segregării cromozomilor parentale în hibrizi interspecifici venit după dezvoltarea metodei de analiză microsatelit utilizând reacția de polimerizare în lanț, prin care fiecare cromozom șoarece gasit cateva sute de markeri, permițând o discriminare în mod fiabil între orice pereche de cromozomi omologi în celulele hibride.

Prin fuziunea ESK (folosind celule HM-1 cu deficit de activitate gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, izolată din tulpina blastocite de șoarece 129 / 01a) cu splenocite de la șoareci linie congenici DD / c nu a primit setul de clone hibride au avut morfológicamente similaritate cu hESCs. Toate clonele au fost izolate pe un mediu selectiv, în care este posibilă o creștere numai cu gipoksantinfosforiboziltransferazoy celula activă. Analiza electroforetică a relevat prezența tuturor clonelor alelice varianta gipoksantinfosforiboziltransferazy șoareci caracteristic DD / c. Folosind analiza citogenetică, sa constatat că patru au avut trei clone hibride okolodiploidny set de cromozomi. One aproape tetraploid clona conținea două populații de celule hibride, dintre care una era tetraploid, iar al doilea mai mic, - diploide.

Analiza microsatelit care permite să discrimineze orice pereche de cromozomi omologi șoarece 129 / 01A și DD / c, în clonele hibride cu set okolodiploidnym au arătat că clonele au avut loc în două eliminarea preferențială partener somatic autozomi distinct. Cele mai multe clone autozomale HESS2 și HESS3 au avut markeri linia 129 / 01A, și anume, partener pluripotente. Excepția a fost cromozomul 1 și I: clonele HESS2 și HESS3, împreună cu markeri de celule HM-1, un număr mic de markeri prezenți partener somatic. Aceste rezultate pot reflecta separarea incompletă a cromozomilor 1 și partenerul somatică și sunt în concordanță cu datele citogenetice care trisomie de cromozomi care apare la 30-40% HESS2 și clone de celule HESS3. HESS4 clona diferit semnificativ în compoziția cromozomală: multe autozomi Această clonă a provenit din genomul ESK (cromozomii 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 și 17), dar cromozomi 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 și 19 au fost reprezentate de omologii ambilor părinți. Raportul cantitativ al markerilor microsateliților acești cromozomi omologi au corespuns aproximativ 1: 1. Acest lucru a permis autorilor sa sugereze ca un omolog este derivat din genomul ESC și celălalt - din celule diferențiate. In unele subclones ale clona HESS4 observate doar prezența simbolică a cromozomilor 18 și 19 partener somatic. Rezultatele indică faptul că celulele clona HESS4, în plus față de segregarea de cromozomi partener somatice, a fost eliminarea unuia sau a ambelor Omologii ale pluripotente genomului cromozom de mai sus, de exemplu, a existat o segregare pe două fețe de cromozomi de la ambii părinți - fenomenul este destul de neobișnuit, deoarece tsitogibridov segregare caracteristică a cromozomilor numai unul dintre părinți.

În plus, după trecerea a 20, toate clonele de celule hibride conțin doar markerii cromozom X ale partenerului somatic, adică în clone a fost înlocuit de cromozomul X ESC pe cromozomul X al partenerului somatic. Acest lucru este confirmat de datele de hibridizare in situ utilizând o sondă marcată FITC specifică pentru cromozomul X al șoarecelui: un semnal pozitiv a fost detectat numai pe un singur cromozom. Trebuie remarcat faptul că, în stadiile anterioare de cultivare (până la pasajul 15), în conformitate cu datele citogenetice, în multe celule au existat două cromozomi X. Prin urmare, utilizarea de medii selective vă permite să manipuleze compoziția cromozomială a celulei hibride și direcționate pentru a selecta clone care transportă cromozom unic partener CSE somatice in genomul de fundal.

Ca o caracteristică unică a tsitogibridov genomului este localizarea genomurilor parentale într-un singur nucleu, desigur, ridică problema menținerii proprietăților genomului embrionare hibrizi de celule ESC-somatice pluripotente în condițiile contact strâns cu genomul celulelor diferențiate. Din punct de vedere morfologic, cytohybridul ESC și celulele somatice seamănă cu linia părintească a CES. Pluripotența calificare a arătat că toate clonele okolodiploidnym set de cromozomi au fost capabili de a forma suspensii de culturi ale organismelor embryoid în care derivatele cele trei straturi germinale prezente.

Cele mai multe celule hibride conțin antigenul ECMA-7, un marker caracteristic embrionilor de șoarece timpurii și, de asemenea, au o activitate înaltă a fosfatazei alcaline. Datele cele mai convingătoare despre proprietățile pluripotente înalte ale celulelor hibride au fost obținute în experimente pentru a obține o serie de himere injectabile care implică celule hibride din clona HESS2. O analiză a markerilor biochimici a arătat că descendenții celulelor hibride donoare au fost găsiți în cele mai multe țesuturi de himeră. Prin urmare, celulele hibride obținute prin fuziunea celulelor ESC și a celulelor diferențiate somatic păstrează pluripotența la un nivel ridicat, inclusiv capacitatea de a forma himere atunci când sunt inserate în cavitatea blastocistului.

Clonele HESS2 și HESS4 diferă semnificativ în compoziția cromozomilor mamă, dar au proprietăți pluripotent similare. S-ar putea presupune că plyuripotentnostv „în genomul hibrid se manifestă ca un semn dominant, dar este posibil ca nu toate cromozomi genomului embrionare sunt implicate în menținerea pluripotența. Dacă această ipoteză este corectă, se poate aștepta ca eliminarea unor cromozomi ai partenerului pluripotent din genomul hibridomului să nu fie însoțită de o schimbare a stării lor pluripotente. În acest caz, analiza segregarea cromozomilor parentale în celulele hibride embrionare ar permite să se apropie de a identifica cromozomi responsabil pentru controlarea pluripotency celulelor embrionare.

Serov O. și colab (2001) au descoperit printre 50 urmași obținute din încrucișările himerele cu șoareci normali, cei care ar avea șoarecii genotip 129 / 01a, și care transportă cromozom X șoareci DD. Autorii văd acest motiv în reducerea pluripotenței în celulele hibride sub influența genomului somatografic. O explicație alternativă poate fi efectul negativ al trisomiei asupra unor autozomi și a dezechilibrelor în cromozomii sexuali (XXY au fost observate în celule până la pasajul 15) în celule hibride când au trecut meiozei. Se știe că celulele din XXY nu pot trece prin meioză și formează gameți. Trisomia este, de asemenea, capabilă să determine o scădere a activității proliferative a celulelor hibride, ca rezultat al cărui avantaj selectiv în dezvoltarea de himere poate aparține celulelor embrionului primitor. Rezultă că pentru a evalua în mod adecvat potențialul pluripotent al celulelor hibride, este necesar să se obțină clone hibride cu un set de cromozomi diploidici normali.

In experimentele Serova O. și colab (2001) au demonstrat mai întâi posibilitatea reprogramării cromozomului X în genomul unei celule hibrid de celule somatice. Această concluzie rezultă din autorii analizează expresia genei himere hprt (marker de X-cromozom): prezența variantelor alelice hprt DD / c șoareci a fost detectată în toate țesuturile analizate chimeric. Trebuie subliniat faptul că după introducerea celulelor hibride în cavitatea blastocist tsitogibridy se încadrează în condiții de non-selective și conservarea cromozomului X in genomul celulelor hibride înseamnă că a devenit o componentă obligatorii a genomului său și nu o discriminare din Y partener cromozom pluripotente.

Rezumând rezultatele analizei interacțiunii embrionare genomului somatice si pluripotente in celulele hibride, autorii ajung la concluzia că, în anumite pluripotența tsitogibridah apare ca o trăsătură dominantă. Gena hibrid capabil de cromozomi individuali reprograma celulele diferentiate, care, cu toate acestea, nu exclude efectul invers asupra pluripotency genomului somatic embrionare genomului. În cultivarea celulelor hibride, inducerea diferențierii are loc mult mai des decât în linia părinte originală a ESC NM-1. Un efect similar este observat în formarea coloniilor primare: multe colonii primare de celule hibride embrionare se diferențiază în stadiile incipiente de formare cu pierderi mari de clone în timpul selecției și multiplicării lor.

Astfel, tsitogibridy prin fuziunea ESC cu celule somatice, în ciuda contactului apropiat cu genomul celulelor diferențiate păstrează pluripotența ca o caracteristică unică a genomului embrionar. Mai mult, în astfel de celule hibride, este posibilă reprogramarea cromozomilor individuali proveniți din celulele difuzate. Rămâne neclar cât de multe sunt proprietățile pluripotente ale genomului embrionar în celulele hibride, în special, capacitatea lor de a participa la formarea căii embrionare în himere. Pentru aceasta, este necesar să se obțină celule hibride embrionare cu un cariotip normal. În orice caz, celulele pluripotente hibride embrionare poate fi un real model pentru identificarea genetică a cromozomilor implicate în menținerea pluripotența sau a controlului ei ca segregarea bilaterală de cromozomi parentale potential ofera o astfel de oportunitate.

Nu mai puțin atractive sunt fenomenul studiului, care Serov G. și colab (2001), definit ca „memorie cromozomiale.“ In genomul hibrid cromozomi omologi sunt două configurații alternative: homologii somatice partener de diferențiere odată suferit, în timp ce homologs partener pluripotente, acest proces este doar începutul. Prin urmare, menținerea proprietăților pluripotente ridicate ale celulelor hibride indică faptul că „pluripotente“ Omologii de configurare ESC destul de stabil în genomul hibrid, în ciuda impactului factorilor transdeystvuyuschih care provin de la partenerul somatic. Caracteristicile descrise mai sus de reprogramare diferentiate cromozomi genomului omoloagă în timpul dezvoltării himerelor nu exclud posibilitatea ca primele stadii de formare in vitro și cultivarea tsitogibridov își păstrează statutul lor dobândite în timpul diferențierii in vivo. Conform datelor recente, atunci când transferul de celule hibride embrionare în mediu neselectiv, în care există o numai cromozomi eliminare partener somatic intensiv, adică genomul celulelor hibride discriminează ușor homologs după cultura in vitro pentru 10-15 treceri. Astfel, celulele hibride embrionare reprezintă un model experimental promițător pentru studiul nu numai din proprietățile fundamentale ale genomului embrionar ca pluripotency, dar și alternativele sale - diferențiere embrionară.

Eficacitatea terapeutică a transplantului de celule stem embrionare

Înainte de a analiza eficacitatea terapeutică a transplantului ESC și a derivaților săi, vom rezuma materialul de mai sus. Caracteristici ESC în ceea ce privește implementarea completă a embriogenezei in vitro, sunt insuficiente din cauza defectelor în acest caz, din cauza lipsei de celule stem mezenchimale, care apar în organism autonom și independent de hESCs. Genetic potenta ESK potențiale zygotes mai puțin genetice, prin urmare, în mod direct pentru clonarea embrionilor CSE nu este utilizat. Potențial biologic unic al hESCs ca singurele celule în care programele de dezvoltare sunt implementate de punere în aplicare pe deplin coerente, își găsește aplicarea în studiul studiilor funcției genei. Folosind ESK efectuat decodificare primele combinații de semnal care activeaza expresia genelor timpurii și târzii, care codifică pentru dezvoltarea celor trei straturi germinale. Conservarea genomului pluripotența de CSE in vitro le face instrument unic pentru regenerarea de reparații, care poate compensa în mod automat pentru pierderile de celule de organe și țesuturi deteriorate. Intr-o varianta ideală ipotetic se poate presupune că „... în transplantul PGCs donatoare în organismul receptor sunt transferate programe compact, ambalate, care, în condiții favorabile sunt realizate în construcția de noi tkani'7 capabile“ ... Efectiv integrate în corpul destinatarului ca morfologică, atât funcționale, cât și funcționale. "

Desigur, în urma dezvoltării metodelor de monodiferențiere a ESC, a început studiul in vivo al activității funcționale a celulelor obținute in vitro de la o singură clonă specializată. Clona ESO proliferativă generează populații de celule progenitoare migratoare care sunt într-adevăr capabile să se integreze activ în zonele de distrugere a țesuturilor din recipient, care sunt utilizate în medicina plastică regenerativă. Sa stabilit că transplantul de dopa-neuroni în substantia nigra reduce manifestările clinice în hemiparkinsonianismul experimental. Transplanturile regionale ale celulelor stem neuronale donatoare reduc gradul de tulburări motorii cauzate de traumă sau contuzie a măduvei spinării și a creierului. Primite și primele rezultate pozitive ale transplantului de celule stem în bolile demielinizante. Se pare că potențialul de regenerare-plastic al ESC deschide posibilități nelimitate de utilizare a transplantului celular în medicina practică. Cu toate acestea, la transplantul în zone ectopice, CES se transformă în mod inevitabil în tumori. Când se injectează subcutanat ESC la șoareci imunodeficienți se formează teratome. Atunci când suspensia ESK este transplantată sub capsula testiculelor la șoareci sângerini, se formează și un teratom, format din țesuturi diferite, ale căror celule sunt derivate din cele trei pliante embrionare. În astfel de teratome, procesele de organogeneză redusă sunt extrem de rare.

O serie de lucrări oferă informații privind rezultatele pozitive ale transplantului de derivați timpurii ai ESCO la animalele cu o patologie ex-perimentală. Neurotransplantation celulară folosind derivați de PGCs este dezvoltată în continuare în experiment și primele teste clinice cu privire la corectarea tulburărilor funcționale la nivelul creierului și traumatisme ale măduvei spinării, tratamentul syringomyelia și sclerozei multiple (Repin, 2001). Odată cu apariția tehnologiei CSE neyronogeneza in vitro, in loc de a folosi tehnici embrionar de transplant de țesut cerebral dezvoltat derivați de neurosferele, obținute din culturi de țesut neural embrionar. Astfel de suspensii de transplant sunt mult mai omogene și conțin precursori neuroni și neuroglii comuni.

În plus față de mediul de cultură regulat cu acid retinoic, la o doză de 10 ug / ml, timp de 6 săptămâni, în linii embrionare (toamele) NTERA-2 -kartsinomy umană a format peste 80% din neuronii post-mitotice. Omogenitatea completă a populației neuronale se realizează prin flux sortarea markeri immunophenotypic marcați neuroni maturi care pot scăpa de rămășițele teratokartsinomnyh și celule imature. După transplantul în diferite regiuni ale creierului animalelor experimentale, astfel de neuroni nu doar supraviețuiesc, ci și sunt construiți în rețele neuronale regionale. La animalele cu modele experimentale de defecte locale CNS neurotransplantation reduce manifestările clinice ale patologiei umane, cum ar fi efectele traumei craniocerebrale, accident vascular cerebral, boli demielinizante, defecte de dezvoltare cerebeloase ereditare, depunerea bolilor lipidelor și polizaharide.

Pentru a optimiza procesele de regenerare în bolile degenerative ale sistemului nervos central, se dezvoltă tehnologii pentru prepararea oligodendrocitelor producătoare de mielină din ESK. Prima etapă implică în mod tradițional proliferarea CES prin multiplicarea numărului de celule necesare transplantului. În cea de-a doua etapă, se efectuează diferențierea directă a celulelor într-o populație de precursori de oligodendrocite producătoare de mielină, care este controlată de antigeni marker selectivi.

Unele perspective sunt deschise pentru instrumente derivate utilizare CSE de a dezvolta metode pentru corectarea imunodeficienta cauzate de defecte genetice in maturizarea timusului. In studiile in knockout (rag 1) soareci cu defect genetic indus - încălcarea mecanism de recombinare V (D) gena J loci TCR, care duc la pierderea funcției de limfocite T, transplant derivaților timpurii de PGCs în timus animal recupereaza maturarea populațiilor normale de clone imunitare responsabile imunitatea celulară. Studiile clinice de transplant preformate in hESCs in vitro pentru tratarea anemiei la copii ereditară fatală.

Obiecțiile față de introducerea rapidă a transplantului de celule stem în clinică sunt justificate de un număr limitat de linii stabile de celule stem embrionare umane și de necesitatea standardizării lor. Pentru a crește puritatea liniilor ESC standardizate, precum și a celulelor stem adulte, este sugerată o metodă de selecție a liniei bazată pe analiza genetică moleculară a repetițiilor scurte de tandem ale ADN-ului. De asemenea, este necesar să se testeze liniile ESC pentru prezența rearanjamentelor cromozomiale mici și a mutațiilor genetice, posibila posibilitate de apariție a acestora în condiții de cultivare celulară este suficient de mare. Teză extinde obligatoriu testarea proprietăților tuturor tipurilor de PGCs și celule stem pluripotente regionale, deoarece propagarea lor in vitro, poate da naștere la noi caracteristici nu inerente celulelor stem embrionare la definitive sau țesuturi. În special, se presupune că cultivarea pe termen lung în medii cu citokine HESS mai aproape de celulele tumorale, deoarece acestea apar cai de schimbare similare de reglementare a ciclului celular cu achiziționarea de capacitatea de a implementa un număr nelimitat de diviziuni celulare. Unii autori, pe baza potențialului de dezvoltare a tumorilor, consideră transplantul uman al derivaților timpurii ai celulelor stem embrionare ca indiscutabil. În opinia lor, este mult mai sigur să se folosească descendenții comuni ai CES, adică liniile strămoșilor celulelor diferențiate. Cu toate acestea, nu a fost încă dezvoltată o tehnică fiabilă pentru obținerea liniilor de celule umane stabile care se diferențiază în direcția cea bună.

Astfel, în literatura de specialitate există tot mai multe date despre efectul terapeutic pozitiv al transplantului de derivate de celule stem embrionare umane. Cu toate acestea, multe dintre aceste lucrări sunt supuse revizuirii și criticii. Unii cercetători cred că rezultatele studiilor clinice inițiale sunt preliminare în natură și sugerează numai că celulele stem pot avea un efect benefic asupra cursului clinic al unei boli. Prin urmare, este necesar să se obțină date privind rezultatele pe termen lung ale transplantului de celule. Ca argument, sunt date etapele de dezvoltare a neurotransplantologiei clinice. Într-adevăr, în literatura de specialitate, inițial dominată de publicarea eficienței ridicate a transplanturilor creierului fragmente de embrioni in boala Parkinson, dar apoi a început să apară rapoarte negând eficacitatea terapeutica a tesutului neuronale embrionare sau fetale transplantate in creierul pacientilor.

Efectuat primele studii clinice care evaluează siguranța neuroblast transplantului - derivați ai PGCs NTERA-2 teratocarcinomul, celule imature care proliferează în cultură au fost supuse la depozitare 100 masa celulară milionime. O parte din celule astfel obținute a fost utilizată pentru a determina caracteristicile fenotipul celulei și a impurităților, precum și pentru a testa o potențială contaminare cu viruși și bacterii. Din mediul de cultură a fost îndepărtat și LIF strat de alimentare de celule stromale și condiții fetale create pentru diferențierea dirijata a hESCs in neuroblasts cu o combinație de citokine și factori de creștere. Apoi, neuroblaștii au fost purificați din celulele teratocarcinomului imatur pe un sorter cu colivie. După a doua purificarea si caracterizarea fenotipului neuroblasts celulelor transplantate (10-12 milioane), suspensie cu ajutorul unei seringi și microcannulas stereotaxy speciale și sub controlul CT injectat in nucleul bazal din creierul pacienților (luna a șaptea după accident vascular cerebral hemoragic). Post-transplant de screening de un an a efectelor transplantului neuronal în zona de accident vascular cerebral nu a arătat nici efecte secundare și efecte nedorite. Jumătate dintre pacienți au prezentat o îmbunătățire a funcției motorii în perioada de la 6 până la 12 luni după transplant. Modificări clinice pozitive au fost însoțite de o creștere în zona de accident vascular cerebral vascularizației după transplantul de celule: creștere medie de absorbție a marcat cu fluorescență 2-deoxiglucoză, conform tomografiei cu emisie de pozitroni a ajuns la 18%, iar la unii pacienți - 35%.

Cu toate acestea, Institutul Național de Sănătate al SUA a efectuat un studiu independent al eficacității clinice a neurotransplantului la pacienții cu Parkinsonism. Pacienții din primul grup au fost transplantați cu țesut nervos embrionic care produce dopamină, în timp ce al doilea grup de pacienți a suferit o operație falsă. Rezultatele indică o eficacitate clinică zero a unei astfel de neurotransplanturi, în ciuda faptului că neuronii embrionare producătoare de dopamină au supraviețuit în creierul primitorilor. Mai mult decât atât, după 2 ani dupa transplant de tesut neuronale fetale la 15% dintre pacienți au dezvoltat dischinezie persistenta, care este absent la pacienții din grupul placebo (celule stem: progresul științific și direcții de cercetare viitoare Nat Inst, Sănătății SUA ...). Observațiile privind dezvoltarea ulterioară a bolii la acești pacienți continuă.

Unii autori atribuie literatura contradictorii privind evaluarea datelor de eficacitate Neurotransplantation clinice cu o abordare diferită la selecția grupurilor de pacienți, alegerea neadecvată a metodelor obiective de evaluare a stării lor și, cel mai important, diferite termeni de dezvoltare a țesutului nervos fetal și în diferite părți ale creierului din care a fost produs materialul în diferite dimensiuni transplant și trăsături metodice ale chirurgiei.

Trebuie remarcat faptul că încercările de a direcționa transplantul de celule stem embrionare pluripotente in regiunea striatale a creierului șobolanilor cu gemiparkinsonizmom corp experimental însoțit de proliferare ESC și diferențierea acestora în neuronii dopaminergici. Trebuie să se presupune că neuronii nou format construit în mod eficient în rețeaua neuronală așa cum sa observat CSE după transplant corectarea anomaliilor de comportament și de asimetrie motorie în testul apomorfina. În același timp, unele animale au decedat din cauza transformării ESK transplantate în tumora cerebrală.

Experții Național și Academiei Medicale din SUA, specialiștii de la National Institutes of Health cred ca potentialul clinic al hESCs merită o atenție serioasă, cu toate acestea, insistă asupra necesității unui studiu detaliat al proprietăților lor, probabilitatea de complicații și efecte pe termen lung in experimente cu modele biologice adecvate ale bolilor umane (celule stern, iar medicina regenerativă viitoare, presa Academiei Naționale, celulele stem și viitoarele direcții de cercetare., Nat.Inst, of Health USA).

Din acest punct de vedere, este important ca analiza histologică comparativă a teratomului experimentale obținute prin transplant în PGCs slam testicul cu toamele care au dezvoltat din cauza transplantului de embrioni timpurii, care a inclus, de asemenea, prezenta CES a aratat ca ESK indiferent de originea sau interacțiunea lor cu de către aceia sau alte celule înconjurătoare, realizând în același mod potențele lor tumorigene. Sa dovedit că aceste toamele au o origine clonală, ca de la o CSE tumora poate să apară, constând din derivați de toate cele trei straturi germinale (.Rega, 2001). Este de remarcat că, atunci când transplantate la șoareci imunodeficienți PGCs cu cariotip normal și toamele formate constând dintr-o varietate de tipuri de celule somatice diferențiate clonate. Aceste date experimentale sunt dovada perfectă a originii clonale a teratomului. Din perspectiva biologiei de dezvoltare, ei sugerează că nu este multiplu de celule progenitoare angajate și identitatea de celule stem pluripotente este sursa de derivați diferențiate de toate cele trei straturi germinale, componente teratom. Cu toate acestea, în rezultatele practice de transplant de celule ale acestor studii sunt, în cazul în care nu prohibitiv, atunci un semn de avertizare de pericol potențial, deoarece ESC inoculare sau a celulelor germinale primordiale în diferite țesuturi ale șoarecilor imunodeficienți adulți duce inevitabil la dezvoltarea de tumori din celulele stem transplantate. Degenerare neoplazică transplantate ectopic ESC însoțită de apariția unor populații de celule diferențiate prin satelit - prin diferenția parțial este cu siguranță CSE și clone precursoare linii dedicate. Este interesant faptul că hESCs de transplant in celulele musculare scheletice in apropiere de teratokartsinomnymi neuroni formeaza mai des. Cu toate acestea, în PGCs administrarea Mace de ou sau de blastocist însoțită de integrarea deplină în celulele embrionare fără formarea de celule neoplazice. În acest caz, CES sunt construite în aproape toate organele și țesuturile embrionului, inclusiv rudimentul sexual. Astfel de animale allofennye au fost preparate mai întâi prin supunerea celulei teratocarcinomul 129 în stadii incipiente de embrioni de la 8-100 celule. În allofennyh populațiile de șoareci geterogenomnyh derivate din celule PGCs donatori sunt introduse în măduva osoasă, intestin, piele, ficat si organele genitale, care vă permite să creați în experiment chiar interspecies himere de celule. Cu cat timpul de embrion timpuriu, cu atât procentul de himerizare celulei, cel mai înalt grad himerizare observate în sistemul hematopoietic, pielea, sistemul nervos, ficat și intestin subțire allofennogo embrion. În organismul adult tesutul himerizare justificabil protejat de expunerea la sistemul imunitar al barierelor beneficiar gistogematicalkie: transplant primordial celulelor germinale în parenchimul testicul însoțită de introducerea celulelor stem donator în stratul recipient de țesut germenativny. Cu toate acestea, nu se produce transplant ESC într-o formațiune blastocist organele genitale primordia himerice cu celule germinale primordiale donator generație. ESC pluripotența la crearea unor condiții speciale și pot fi folosite pentru clonare: ESC șoareci transplant 8-16-celule de șoarece embrion, mitoza celulară în care tsitokalazinom blocat, contribuie la embriogeneza normale cu dezvoltarea PGCs donator embrion.

Prin urmare, o alternativă este transplantul de alogenic clonare terapeutica ESC bazate pe transplantul de celule somatice nucleare într-un oocit denucleat pentru a crea o masă blastocist de celule interioare din care sunt apoi alocate linie de PGCs donator genetic identic nucleu somatic. Punct de vedere tehnic, această idee este fezabilă, deoarece posibilitatea creării de linii hESC din blastocysts obținute după transplantul de nuclee de celule somatice în ou enucleated dovedit în mod repetat, în cazul experimentelor pe animale de laborator (Nagy, 1990; Munsie, 2000). În special la șoarecii homozigoți pentru mutația RAG2, fibroblastele obținute prin cultivarea celulelor de tesut subepidermale au fost utilizate ca nuclee de donatori sunt transplantate în oocite extirpat. După activare, ovocite „zigot“ cultivate până la formarea blastocist, din masa de celule interior este PGCs izolate și trecerea lor într-o linie pentru celulele mutante genei nullizigotnyh (RAG2 ~ / ~). Prin recombinare omoloagă la astfel de ESC, mutația unei gene alelice a fost corectată. In prima serie de experimente din hESCs genei recombinante recuperate au fost preparate corpurile embryoid, transfectate celule ale acestora cu un retrovirus recombinant (HoxB4i / GFP) și vena RAG2 după propagare la șoarecii injectați ~ / ~. În a doua serie blastomeres tetraploide agregate cu hESCs modificate genetic și le transplantate într-un sex feminin destinatar. Șoarecii imunocompetenți născuți au servit ca donatori ai măduvei osoase pentru transplant la șoareci mutanți rag2 ~ / ~. In ambele serii, rezultatul a fost pozitiv: 3-4 săptămâni, la șoarecii de celule mieloide și limfoide mature normale au fost găsite capabile să producă imunoglobuline. Astfel, transplantul în nucleele ovocitului din celulele somatice pot fi utilizate nu numai pentru a produce linii hESC, dar, de asemenea, pentru tsitogenoterapii - Corectarea anomaliilor ereditare folosind ESC ca un vector pentru transportul de corectare a informației genetice. Dar, în această direcție de transplant de celule, pe lângă problemele bioetice, există limitări. Nu este clar cum sigur transplantarea ar fi celule donate terapeutic cu un genotip identic cu genotipul unui anumit pacient, deoarece astfel de celule pot introduce mutații care creează o predispoziție pentru anumite boli. Ouă umane normale rămân obiect inaccesibile, în timp ce chiar și atunci când transplantare nuclee somatice în ovocit animale extirpat doar 15-25% inginerie „zigot“ la stadiul de blastocist. Nu este determinat cât de mult este necesar blastocistul pentru a obține o singură linie de CES pluripotentă clonată. Trebuie remarcat și un nivel ridicat al costurilor financiare asociate cu complexitatea metodologiei de clonare terapeutică.

In concluzie, in genomul pluripotența ESC hipometilate ADN-ul este combinat cu activitatea telomerazei ridicată și faza ciclului celular ^ C scurt, ceea ce asigură multiplicarea intensivă și potențial infinit, în timpul căreia PGCs păstrează cromozomi diploizi și „juvenile“ set de caracteristici fenotipice. Creșterea clonalå PGCs în cultură nu se opune a le diferenția în orice celulă specializată a organismului la o proliferare linia de oprire și adăugarea de semnale adecvate de reglementare. Diferențierea Restricționarea hESCs în linie în celule somatice din vitro se realizează fără participarea mezenchimului, ocolind Nohteyaov, este organogeneză și fără formarea embrionului. Ectopic in PGCs vivo administrarea în mod inevitabil conduce la formarea teratocarcinom. Transplantul ESC într-un blastocist sau embrion timpuriu însoțită de integrarea lor cu țesuturile embrionului și ale organelor sale himerizare stabile.

Tehnologii regenerativa si din material plastic pe bază de transplant de celule este punctul de intersecție al intereselor membrilor de biologie celulara, biologie de dezvoltare, genetica experimentale, imunologie, neurologie, cardiologie, hematologie, și multe alte domenii ale medicinei experimentale și practice. Cele mai importante rezultate experimentale demonstrează posibilitatea reprogramarea celulelor stem cu direcția de schimbare a proprietăților lor, ceea ce deschide perspective pentru controlul proceselor citodiferentiere cu factori de creștere - pentru regenerarea miocardului, restaurarea leziunilor CNS și normalizarea funcției aparatului insular al pancreasului. Cu toate acestea, pe scară largă derivatele de transplant introducerea ESC în practica medicală este necesară pentru a investiga proprietatile celulelor stem umane mai în detaliu și experimente ulterioare cu PGCs în modele experimentale de boli.

Probleme de bioetică și problema de respingere a transplantului de celule alogene ar putea rezolva plasticitatea observată a genomului celulelor stem adulte regionale. Cu toate acestea, informațiile inițiale este că, atunci când transplantare ficatul celulele hematopoietice autologe izolate și bine caracterizate, din care există noi hepatocite, care încorporează în lobuli hepatice, sunt acum analizate și criticate. Cu toate acestea, datele publicate ca transplantul de celule stem neuronale in timusul este formarea de noi lăstari de donator T și B-limfocite si transplantul de celule stem neuronale din creier, in maduva osoasa duce la formarea hematopoietic germenilor susținut mieloide donator și eritropoieza . În consecință, în organele adulte pot fi conservate celule stem pluripotente capabile de reprogramarea genomului ESC pentru capacitate.

Sursa de CSE pentru uz medical rămâne embrion uman, care predetermină inevitabilitatea unui nou punct de trecere a problemelor morale, etice, morale, juridice și religioase, la originea vieții umane. Descoperirea CES a dat un impuls puternic reluării discuțiilor dure despre locul unde se află linia dintre celulele vii și materie, substanță și personalitate. În același timp, nu există norme, reguli și legi universale privind utilizarea CES în medicină, în ciuda încercărilor repetate de a le crea și accepta. Fiecare stat în cadrul legislației sale rezolvă această problemă singură. La rândul lor, medicii din întreaga lume continuă să încerce să aducă medicina regenerativă, din plastic dincolo de astfel de discuții, în primul rând datorită utilizării non-celule stem embrionare si stem rezerve de celule adulte.

Unele din istoria izolației embrionare a celulelor stem

Terato- celule (embrion) au fost izolate din -kartsinomnye care apar spontan tulpina testicular toamele de șoarece 129 celule / ter-Sv, ovarian linii spontane toamele șoarece Lt / Sv, și din toamele, ektopichno sursă au fost transplantate sau a tesutului embrionare. Printre liniile astfel obținute terato- stabile de șoarece (embrion) -kartsinomnyh unele celule sunt pluripotente, iar altele au fost supuse diferențierii numai în celulele de un anumit tip, iar unele au fost în general incapabile să citodiferentiere.

La momentul respectiv, accentul a fost de cercetare care a arătat o posibilă terato- revenire (embrion) celule -kartsinomnyh la fenotipul normal după introducerea lor în țesutul embrionar în curs de dezvoltare, precum și de lucru pentru a crea in vitro terato- modificat genetic (embrion) -kartsinomnyh celule, cu ajutorul carora s-au obtinut soareci mutanti pentru modelarea biologica a patologiei ereditare umane.

Pentru a izola terato- linii (embrion) a fost utilizat în aer condiționat cultură suspensie celulară -kartsinomnyh. In terato- cultura (embrion) -kartsinomnye celule, cum ar fi CSE, cresc pentru a forma corpuri embryoid și necesită să fie tradus într-o linie de disociere care leagă menținerea pluripotența pe un strat de alimentare de fibroblaste embrionare sau de cultură suspensie în medii condiționate. Terato- celule pluripotente (embrion) - linii de carcinom mari, sferice, au o activitate ridicată a fosfatazei alcaline, agregate de formă și sunt capabile de diferențiere multidirecțională. Când a introdus într-un blastocist sunt agregate cu morulae, rezultând formarea de embrioni himeric, în diferite organe și țesuturi, care sunt derivați de gasit terato- (embrion) celule -kartsinomnyh. Cu toate acestea, marea majoritate a acestor embrioni himeric mor in utero, si in organe supraviețuitoare himere celule străine nou-nascuti si rareori detectate cu o densitate scăzută. În același timp, incidența tumorilor (fibrosarcom, rabdomiosarcom, și alte tipuri de umflare maligne și Pancreas adenomul) crește brusc, și degenerare neoplazică apare adesea chiar in utero embrioni himeric.

Majoritatea celulelor terato-embrio-carcinom din micro-mediu ale celulelor embrionare normale dobândesc aproape în mod natural caracteristici neoplazice maligne. Se crede că malignitatea ireversibilă se datorează activării proto-oncogene în procesul de rearanjări structurale. O excepție sunt liniile de celule embriokartsinomnoy SST3, teratom derivată din testicul murine (linia 129 / Sv-ter), care prezintă o mare capacitate de a se integra în țesuturi și organe ale fătului fără formarea ulterioară a tumorilor la șoarecii himerici. Derivații liniilor celulare terato-embrio-carcinom la șoareci de himeră practic nu participă la formarea gonocitelor primare. Evident, este conectat cu o frecvență mare de aberații cromozomiale comune pentru majoritatea terato- (embrion) Linii -kartsinomnyh in care celulele observate ca aneuploidiei sau anomalie cromozomială.

Mai multe linii de terato- stabile (embrioni) de celule umane -kartsinomnyh a fost preparat în condiții de laborator, caracterizat pluripotency, activitatea proliferativă ridicată și capacitatea de a se diferenția în cultură în timpul creșterii. În special, linia celulelor terato-embrio-carcinom umane NTERA-2 a fost utilizată pentru a studia mecanismele de citodiferențiere neurală. După transplantul celulelor din această linie în regiunea subventriculară a precremenii șobolanilor nou-născuți, sa observat migrația și neuronogeneza lor. Au existat chiar și încercările de transplant terato- neuronale obținute prin cultivarea celulelor (embrion) -kartsinomnoy linia NTERA-2, la pacientii cu accident vascular cerebral, care, potrivit autorilor, care conduc la ameliorarea clinică a bolii. În același timp, în cazul pacienților cu accident vascular cerebral, nu s-au observat cazuri de celule transplantate malign din linia terato-embrio-carcinom NTERA-2.

Evans și Martin au primit primele rânduri de celule stem pluripotent embrionare nediferențiate de la șoareci la începutul anilor 1980, izolându-le de masa internă a celulelor blastocistului, embrioblastul. Liniile ESC izolate pentru o pluripotență conservată de mult timp și capacitatea de a se diferenția în diferite tipuri de celule sub influența factorilor unui mediu de cultură special.

Termenul „celule stem pluripotente embrionare“ aparține Leroy Stevens că investigarea impactului gudron de tutun asupra frecvenței de dezvoltare a tumorii a atras atenția asupra apariției teratocarcinomul spontane testiculare liniare (129 / v) a șoarecilor din grupul de control. Celulele teratocarcinom testiculare au fost caracterizate printr-o rată ridicată de proliferare, și în prezența lichidului rămas în cavitatea abdominală cu formarea diferențierii spontane a neuronilor, keratinocite, condrocite, cardiomiocite, precum și fragmente de păr și oase, dar fără nici o indicație a unei cytoarchitectonics ordonate de țesut corespunzătoare. Atunci când se plantează în culturi celulare teratocarcinomul cultivate neatașate la clonele pluripotente substrat și corpurile embryoid formate au fost apoi stins și supus dezordonat fisiune spontane se diferențiază în neuroni, Glia, celulele musculare si cardiomiocite. Stevens a constatat că teratocarcinom de șoarece 129 / v conține mai puțin de 1% din celule capabile de a diferenția într-o varietate de linii somatice specializate, și ea însăși diferențierea depinde de factorii care le afectează (lichidul peritoneal compoziția, produsele adăugate la cultura de celule sau țesuturi mature). Leroy Stevenson ipoteza cu privire la prezența în rândul celulelor teratocarcinom celulelor germinale sexuale precursoare embrionare a fost confirmată: suspensia embryoblast celulele embrionilor preimplantare in tesuturi de șoarece adult format teratocarcinom, și separat de aceștia linii celulare pure după administrarea intraperitoneală la animale primitoare au diferențiat în neuroni, cardiomiocite și alte kletki somatice derivați de toate cele trei straturi germinale. Experimentele in vivo transplant ESK (obținut din embryoblast dar nu trofoblast) în embrioni de șoarece la diferite linii de stadii 8-32 blastomer naștere încheiat animalului himeric (fără formarea tumorilor) la organe care detecteaza tesutul mugurii donor. Himerismul a fost observată chiar și în linia de celule sexuale.

Celulele germinale precursoare primare izolate de la embrion de șoarece sex germen, morfologie, fenotip imunologic și caracteristici funcționale în concordanță cu hESCs derivate din teratocarcinom Stevenson și embryoblast. La himerele născuți după administrarea hESCs într-un blastocist, allofenny morfogeneza organ donor caracterizat alternativ mozaic și primitor structural și unitățile funcționale ale ficatului, plămân și rinichi. Într-o serie de cazuri, s-a observat formarea de cripte sau lobuli intestinali din ficat, concomitent cu celulele donatoare și donator. Cu toate acestea, întotdeauna realizarea morfogenezei a avut loc în conformitate cu programul genetic al speciei la care a aparținut beneficiarul, iar chimerismul a fost limitat doar la nivelul celular.

Apoi, sa constatat că proliferarea hESCs fără citodiferentiere pe un alimentator de celule mezenchimale derivate din strat (fibroblaste fetale) are loc în prezența legării LIF în medii nutritive selective care furnizează în mod selectiv doar supraviețuirea celulelor stem si a celulelor progenitoare, în timp ce marea majoritate a elementelor celulare specializate moare. Cu ajutorul acestor tehnici în 1998 de James Thomson a fost alocat cinci linii imortalizate de celule stem embrionare din masa de celule interioare a unei persoane blastocist. În același an, John Gerhart a dezvoltat o metodă de izolare a liniilor nemuritoare ESC din puf sexuale de patru-cinci săptămâni embrioni umani. Datorită proprietăților lor unice, în doar doi ani, celulele stem embrionare și celulele stem din țesuturile definitive au început deja să fie utilizate în practica medicinei regenerative și a terapiei genice.