O fiolă, două ținte: Diagnostic portabil al tuberculozei bazat pe CRISPR cu sensibilitate de 100%

O lucrare despre un test portabil pentru tuberculoză, care poate fi efectuat direct din spută, fără echipamente complexe, a fost publicată în Science Advances. Amplificarea izotermă a ADN-ului și citirea CRISPR sunt combinate într-o singură eprubetă; două inserții conservatoare de M. tuberculosis (IS6110 și IS1081) sunt testate simultan, plus o genă umană ca și control intern al probei. Într-un test „orb” de mici dimensiuni pe probe clinice, testul a dat o sensibilitate de 100% (6/6) și o specificitate de 100% (7/7) în comparație cu cultura; limita de detecție este de ~69–81 UFC/ml în spută simulată. Rezultatul poate fi văzut pe o bandă de testare din hârtie, iar reactivii sunt liofilizați (depozitare fără „lanț frigorific”).

Fundal

Conform OMS, tuberculoza va ucide aproximativ 1,25 milioane de oameni în 2023; tuberculoza a devenit din nou principala cauză infecțioasă de deces, cu aproximativ 10,8 milioane de cazuri. Acest lucru face ca diagnosticele accesibile și rapide să fie esențiale, în special în mediile cu resurse limitate.

• Testele actuale reprezintă un compromis între precizie, viteză și preț. Cultura „standardului de aur” este foarte precisă, dar lentă; microscopia este rapidă, dar insensibilă; platformele PCR precum Xpert MTB/RIF Ultra sunt semnificativ mai sensibile (LOD ≈ 15,6 UFC/ml), dar necesită echipamente și cartușe scumpe, ceea ce limitează acoperirea.
• De ce izotermă și CRISPR. Amplificarea izotermă RPA funcționează la 37–42 °C și nu necesită termociclatoare — convenabilă „pe teren”. Citirea CRISPR (Cas12/13) adaugă specificitate speciei și permite fluxul lateral vizual („bandă”) fără optică complexă. În total, aceasta este calea către teste PVR portabile și ieftine.
• De ce două ținte MBT simultan (IS6110 + IS1081). IS6110 este un insert multicopie al complexului M. tuberculosis, dar unele linii au puține copii, iar testele pentru IS6110 singure pot „rata”. Adăugarea unui al doilea insert IS1081 reduce riscul de rezultate fals negative.
• De ce control uman intern. Probele de respirație pot conține inhibitori și probe „rele”. Controlul uman endogen (de exemplu, RNase P/ADN genomic) confirmă că materialul este adecvat și reacția nu este suprimată - altfel rezultatul nu poate fi considerat negativ.
• Formatul cu un singur recipient este important în sine. Reduce etapele, reduce riscul de contaminare și facilitează munca în afara laboratorului. Astfel de abordări pentru tuberculoză și-au demonstrat deja viabilitatea; noua lucrare extinde ideea la un format cu țintă dublă, cu controale interne, plus demonstrează liofilizarea reactivilor și un cititor de stripuri.
• Care este valoarea articolului actual? Autorii au demonstrat detectarea direct din spută după cea mai simplificată preparare a probei, limita de detecție la ~70–80 UFC/ml în spută simulată și o sensibilitate/specificitate de 100% pe un set mic de probe clinice, în orb - o „democrație tehnică” bună pentru validări multicentrice ulterioare.

Cum funcţionează asta

• Oamenii de știință au combinat RPA (amplificarea izotermă rapidă a materialului genetic la 37 °C) cu enzimele „tăietoare” Cas13a/Cas12a. După ce au selectat ARN-urile ghid, au configurat sistemul să vizeze simultan două ținte MBT și în paralel cu ADN-ul uman (verificând dacă există material în probă și dacă reacția nu s-a „oprit”).
• Toate substanțele chimice intră într-o singură eprubetă; după incubare, rezultatul se citește fie cu un fluorimetru, fie pe o bandă cu flux lateral - practic, ca un test expres.
• Prelucrarea sputei a fost simplificată la încălzire și o centrifugă scurtă - fără extractoare de acid nucleic. Pentru cele mai limitate afecțiuni, autorii discută chiar și alternative manuale la centrifugă.

Ce au arătat testele

• Limită de detecție: 69,0 UFC/ml (tulpina H37Rv) și 80,5 UFC/ml (BCG) în sputa „de tip spike”. Nu s-a detectat nicio reactivitate încrucișată cu alte bacterii/ciuperci.
• Cadru clinic (probe orb): pe 13 probe din practica reală - sensibilitate 100% (6/6) și specificitate 100% (7/7) față de însămânțare. Pentru comparație, pe același kit, GeneXpert Ultra a arătat 100%/86%, respectiv.
• Nuanțe tehnice: dintre cele două opțiuni de citire, Cas13a a funcționat mai bine (pentru formatul „one-pot”, este mai sensibilă decât Cas12a). În plus, testarea în paralel a două ținte Mtb reduce riscul unor rezultate false.

De ce este necesar acest lucru?

Testele actuale reprezintă un compromis între acuratețe, viteză și disponibilitate: cultura este foarte precisă, dar lentă; bețișoarele sunt rapide, dar inexacte; sistemele PCR precum GeneXpert sunt precise și rapide, dar necesită instrumente și cartușe scumpe. Noua abordare CRISPR își propune să elimine această diferență: diagnosticarea pe teren care funcționează la 37°C, cu citiri pe benzi de hârtie și potențialul de a depozita reactivi fără refrigerare.

Limitări și ce urmează

Aceasta este o demonstrație timpurie pe un set clinic mic - sunt necesare teste mari, multicentrice (inclusiv coinfecția cu HIV, la copii, cu forme paucibacilare și diferite linii MBT). Autorii notează separat că în versiunea „de teren” în sine, centrifuga de masă va trebui înlocuită cu o soluție complet manuală. Însă arhitectura în sine - „două ținte + control intern” într-o singură eprubetă - și-a dovedit deja operabilitatea și oferă o cale clară către rafinament pentru utilizarea în masă.

Sursa: Alexandra G. Bell și colab. Un test simplificat bazat pe CRISPR pentru detectarea tuberculozei direct din spută, Science Advances, online, 6 august 2025 (vol. 11, numărul 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206