Lucrări experimentale privind transplantul de keratinocite alogene pe cicatrici create artificial de șobolani albi

Dorința de a utiliza potențialul celular și necesitatea de a căuta noi metode eficiente pentru îmbunătățirea aspectului estetic al cicatricilor a condus la ideea de a încerca să studieze posibilitatea transplantului de keratinocite la suprafețele cicatrice.

Pentru a demonstra posibilitatea de a utiliza culturi de keratinocite pentru a îmbunătăți aspectul de cicatrici de lucru experimentale a fost realizat pe șobolani albi de laborator, care au fost create de suprafață cicatrice. Modelul de rumen de șobolani a fost obținut ca rezultat al vindecării rănilor provocate artificial pe spate, de-a lungul coloanei vertebrale. Șobolanii au fost tăiate bucăți de aceeași piele, dimensiunea de 2x3 cm. După 2,5 luni după operație șobolanilor „simulare cicatrici“ a fost efectuat chirurgie dermabraziune (indepartarea straturilor superioare prin rumen ignioperation) și keratinocitele alogeni transplantat, izolate de piele de sobolani tineri 2-4 zile după naștere.

Izolarea și creșterea epidermocitelor de șobolan a fost efectuată în laboratorul de tehnologii celulare al Institutului de Cytologie RAS a următoarelor tehnologii.

Pielea a fost spălat în soluție salină Hank conținând 200 U / ml gentamicină, se taie în bucăți mici, o suprafață de 0,2-0,5 cm ². Cuburile de piele au fost incubate într-o soluție 0,5% de dezaspază într-o soluție salină tamponată cu fosfat salin la 37 ° C timp de o oră. Piesele au fost apoi transferate în soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco și epiderma a fost separată de dermă. Epiderma a fost incubat în soluție de tripsină 0,125% timp de 10-15 minute , sub agitare , la o viteză de 50 rot / min, după care enzima a fost oprită prin adăugarea de ser fetal bovin 5%. O treime din suspensia de celule rezultată a fost utilizată în formă pură pentru una dintre opțiunile pentru transplant de cicatrici, a doua treime crescute pe piața internă de acoperire de film biocompatibil „Polipor“, al treilea - pe un vas Petri , fără substrat. Funcționarea dermabraziunii cicatricelor obținute la șobolani cu transplantarea ulterioară a epidermocitelor de șobolan pe acestea a fost efectuată sub anestezie eterică folosind o căuteră termică.

Primul grup de șobolani după dermabraziune pe lustruit, se spală cu soluție salină și rumen sterile de suprafață uscată suprapuse bucăți de gazon, care a fost depozitat bruiate alogenă de șobolan epidermotsitov suspensie la o concentrație de 1,5 milioane de celule pe 1 ml (conform Institutului de Citologie). Piesele Batistovye se potrivesc pe cicatrice lustruite, astfel încât celulele să se afle pe suprafața cicatricilor. Un bandaj de mai multe straturi de tifon a fost cusut pe partea de sus, care a fost cusut până la marginile cicatricei.

O parte din suspensia de celule rezultată a fost așezată în plăci Petri pe pelicule sterile de Polypore tăiate în formă de pahare, cealaltă parte pe plăcile Petri fără film. Cultivarea a fost efectuată într-un mediu FAD constând dintr-un amestec de DMEM și F12 într-un raport de 3: 1. Cu adăugarea de ser 10% fetal bovin, 5 pg / ml insulină (Sigma), 0,5 pg / ml hemisuccinat de hidrocortizon (Sigma). 10 μg / ml factor de creștere epidermal EGF (Institutul de Citologie RAS, Sankt Petersburg). Al doilea și al treilea grup de șobolani cu 7 indivizi au fost operați la 6 zile după prima. În acest timp s-au format straturi multistrat din suspensia de keratinocite semănate în vase Petri, care au fost transplantate la șobolani. Cel de-al doilea grup a fost transplantat cu epidermocite pe film, al treilea grup - cu un strat multistrat fără substrat. După 7 zile, straturile multistrat de keratinocite alogice (MPALK), însămânțate pe pelicule Polypore, au fost transplantate prin cultură direct pe suprafața plăgii. Deasupra, filmul, pentru a evita ruperea acestuia, a fost fixat cu un pansament cu tifon multistrat si cusut pe pielea sobolanilor.

Înainte de transplantare keratinocitelor treilea grup de șobolani, cultivate fără substrat, producând o separare a PAC din partea de jos a tratamentului antena dispază Petri, având capacitatea de a sparge selectiv comunicarea dermo epidermic. Sub acțiunea unui dispază rezervor multistratificat distruge legătura stratului de celule bazale la fundul vasului Petri și într-o măsură mult mai mică, aceasta afectează comunicarea intercelulară, ceea ce face posibilă „elimina“ întregul strat. Detașarea stratului de celule multistrat de către dispunere a fost efectuată după cum urmează. Din vase Petri amestecate mediu de transport, foile de celule au fost spălate de trei ori cu mediu conținând antibiotice, în particular - gentamicină (0,2 mg / ml). Straturile Multistrat au fost turnate 0,125% soluție dispază ( «Sigma») și plasate într-un incubator unde au fost incubate la t = 37 ° C timp de 20-30 minute. Aspectul corola alb, peeling în jurul periferiei rezervorului - un indicator al începutului procesului de separare-l de marginile și fundul vasului Petri. La câteva minute după începerea procesului de separare, soluția dispază a fost golit de 2-3 ori straturile epiteliale au fost spălate cu mediu. Pe a fost aplicat pe suprafața stratului epidermic, tăiate la dimensiune cupa bucată rana steril pansament „Leith-culoare, care este scindat separat dispază formarea, exfolierii suplimentară a fundului cupei cu ajutorul unei spatule. Folosind o pensetă oftalmică strat împreună cu acoperirea tamponului“ Leith-culoare „(Russian ) sa desprins de pe fundul unui vas Petri și transferată atent la suprafața pregătită de cicatrice. Serviete „Lita-color“ conține în componența sa și eksolin gentamicină (extract de colagen), care, atunci când mediul umed rămâne germina în viitor soluție salină și a devenit umflat Șem de acoperire rana moderne, care asigură o bună protecție împotriva infecției externe și vindecarea rapidă datorită umectării cu structura.

Peliculele din polipropilenă și șervețelele de culoare Lita au fost stratificate cu bandaje de tifon care au fost cusute pe pielea șobolanilor pentru o fixare mai durabilă. Fiecare șobolan a fost plantat într-o cușcă separată, pentru a crea condiții optime pentru întreținerea și înmulțirea keratinocitelor transplantate. Bandaj șobolanii care transplantate suspensie și mai multe straturi de rezervor epidermotsitov împușcat dispază, în fiecare zi, de mai multe ori pe zi, umezite cu soluție salină sterilă pentru a crea cele mai favorabile condiții celulele grefării. Având în vedere că „Polipor“ film a fost impermeabil la apă, șobolanii din a doua pansamente de grup nu sa efectuat umidificare, care a fost unul dintre avantajele filmelor fara transplanturi anterioare. După 10 zile, bandajele au fost îndepărtate. Tabloul clinic de cicatrici în urma transplantului de celule nu diferă mult de la transplant, fara cicatrici, cu excepția unui roz de colorat le (prin dermabraziune) si mai peeling. Acest fapt sugerează acest lucru. Că imediat după dispariția acoperirilor ranilor cu IPC, nu s-au produs modificări în rumen.

Luarea materialului de biopsie la șobolani.

După 1, 2, 5 și 9 luni după transferarea keratinocitelor alogice de șobolan la cicatricele solului de șobolani albi, materialul a fost luat pentru examinare microscopică histologică, citomorfologică și electronică. Ca probe de control ale pielii și cicatricii normale de șobolan au fost luate fără transplant de celule. Anestezia la șobolani a fost efectuată cu anestezie eterică.

După anestezie, din zonele marcate, în care s-au transplantat keratinocite, un perforator de biopsie cu un diametru de 2 mm. Bucățile de țesut cicatricic au fost luate și plasate într-o soluție de glutaraldehidă 2,5% pentru a prepara materialul pentru microscopie electronică. Bucăți de țesut prelevate pentru examinarea histologică au fost plasate într-o soluție neutră de formalină 10%, urmat de alcooli prin cabluri și umplute în parafină, urmată de tăierea secțiunilor ultrasubțiri și vizualizarea acestora la microscop optic de lumină.

Control I. Piele normală de șobolan.

Pentru a vedea diferența dintre imaginea microscopică a pielii normale a cicatricilor modificate la cicatrice de șobolani și cicatrici în anumite momente după transplantul de IPC, se demonstrează fotografii și descrieri în toate etapele acestui studiu.

Epiderma pielii normale este formată din 7-9 straturi de celule. Strat de grosime moderată. În locurile sale se compune din 6-8 straturi de scale exotice. Stratul bazal este reprezentat de celule de formă cilindrică cu lumină mare, nuclee regulate și mai multe nucleoli. Legăturile desmosomale dintre celule și membrana bazală sunt exprimate în mod clar. Sub membranei bazale bine definită, care are protuberante fine în strat subepidermice sunt paralele fasciculele blânde ale fibrelor de colagen și elastină, inclusiv fibroblaști alungite, vase mici. În straturi mai profunde, fasciculele de fibre de colagen și elastină se află în direcții diferite. Printre acestea există numeroase vase cu pereți subțiri de același calibru, elemente celulare (fibroblaste, mastocite, leucocite). Într-un număr mare de foliculi de păr, glandele sebacee.

Control 2. Cicatricea unui șobolan de 2 luni.

Imagine clinică. Cicatluri de culoare roz, cu peeling, în locuri rămase cruste. Suprafața lor este scăzut ca urmare a contracției fibrelor de colagen și a devenit de aproximativ 3,0-3,5 cm ^:. Nu există atașamente ale pielii.

Imagine microscopică. Epiderma este format din 3-5 straturi de celule, plisate, reprezentate de celule bazale rotunjite, subulate un rând, 1-2 rânduri keratohyalin granule cu boabe în stratul superior, există porțiuni de edem intracelular. Stratul cornean este schimbat în mod eterogen, de la foarte subțire la îngroșat. Există o îndoire a rumenului datorită (contracției) țesutului cicatrician. Pliurile pătrund în stratul papilar și dau impresia de papile. Limita dintre epidermă și dermă este o linie dreaptă. Membrana bazală nu poate fi urmărită peste tot. În partea inferioară a straturilor subepidermale și mai adânci - vasele cu un perete gros, slăbit, multe părăsite, cu fenomene de stază. În jurul vaselor - un grup de macrofage, fibroblaste. Macrofagele înconjoară eritrocitele care ies din capilare și le fagocotizează. În straturile mai superficiale - capilare mici. Sub epidermă, fibrele de colagen sunt libere. În stratul mai profund al măduvei - mănunchiuri grosiere de fibre de colagen, printre care există multe fibroblaste.

Scarring de șobolan la o lună după transplantul de keratinocite de șobolan MPAl de șobolan.

Imagine clinică. Cicatricele roz, suprafața acestora este redusă, în special în diametru, cu o medie de 2,5-3 cm ². Părul și glandele sebacee sunt absente.

Aceste examenul microscopic al materialului obținut de la șobolani cu MPAlK de transfer MPAlK pe film și substratul fără substanțial identică. Cu toate acestea, punct de vedere tehnic, lucru cu MPAlK neacceptată mult mai dificilă și laborioasă decât atunci când cultivate MPAlK pe substrat, astfel încât studiul în continuare a problemei privind transplantul kertainotsitov cicatrici am folosit ca bază pentru cultivarea ( „substrat“) de gazon stratificat.

Imagine microscopică. Există o îngroșare a epidermei la 15-20 de straturi, aproape la mijlocul cărora keratinocitele au o formă verticală îngustă, alungită și un aranjament compact. Celulele bazale sunt aranjate într-o linie neuniformă. Nucleul lor are o formă ușoară, mare, rotundă, cu unul sau două nucleoli, ceea ce indică activitatea lor sintetică și proliferativă ridicată. Limita dintre epidermă și dermă este o linie dreaptă. Stratul spinoios este bine dezvoltat, constă din 3-5 straturi de celule cu formă rotundă, există 2 celule nucleu.

Imediat sub membrana bazală - fasciculele subțiri de fibre de colagen situate dens, în paralel cu ele un număr mare de vase goale, fibrele de colagen mai profunde sunt mai groase, colectate în mănunchiuri dense. Multe fibroblaste mari, celule mastocitare (2-3 în câmpul vizual), macrofage, leucocite și vase goale, ale căror pereți sunt slăbiți, în jurul lor sunt fibrele de colagen localizate slab. În unele nave - stază, diapedesis de elemente uniforme. În jurul vaselor - fibroblaste, limfocite unice. Nu există atașamente ale pielii.

Când o suspensie de keratinocite este transplantată la o cicatrice șlefuită, imaginea microscopică diferă de cea anterioară. În cele mai multe animale - epiderma este subțire, constă în 5-6 straturi de celule. Stratul inferior constă din celule de formă neregulată, poligonală, cu nuclei rotunjite în formă neregulată. Starea stratului subepidermic este similară cu cea din grupul de animale fără transplant.

În acest caz, se poate vorbi fie despre întârzierea proceselor care însoțesc transplantul celular, fie despre o pierdere mare de celule transplantate sub formă de suspensie. De aceea, sa ajuns la concluzia că corectarea cicatricilor prin transplantul de keratinocite sub formă de suspensie este inadecvată.

Cicatrurea șobolanului la 2 luni după transplantul de keratinocite de șobolan MPAl de șobolan.

Imagine clinică. Cicatala pare subțire, delicată. În locuri există o ecdiza, cântare.

Imagini microscopice. Stratul corneum este îngroșat, în locuri - hiperkeratoză. Epiderma este îngroșată, constă în 12-20 de rânduri de celule. Limita dintre epidermă și dermă este o linie dreaptă. Fibrele de colagen delicate sub epidermă se află destul de strâns. În straturile mai profunde ale rumenii sunt colectate în mănunchiuri grosiere mari. În stratul subepidermic apare o nouă formare de nave. În straturile inferioare ale țesutului cicatricial - multe vase goale, situate paralel cu suprafața epidermei. Fibroblastele mari sunt distribuite uniform în grosimea rumenului, există macrofage uriase, multifate, multe macrofage.

Cicatrizarea șobolanului la 5 luni după transplantul de MP de spermatozoizi de șobolan.

Imagine clinică. Scar arata neted, neted, fără peeling, există păr unic de densitate mai mare a acestora la periferia cicatricii, care indică margine foliculii de par incarnate în rumen și neoplasmul a foliculilor de par. Zona cicatricilor continuă să scadă.

Imagine microscopică. Epiderma este încă groasă (15-20 straturi, uneori până la 30) în straturile superioare este umplută cu boabe de keratogialină. Membrana bazală este vizibilă. Sub fibrele sale de colagen se află liber. În straturile inferioare - colagenul este mai puternic și mai bine ambalat. Printre grinzile de colagen există multe capilare. În straturile superioare numărul vaselor goale a scăzut. Epiderma și derma sunt ușor ondulate. Există proliferări epidermice profunde în țesutul cicatrician. Printre fibrele de colagen se găsesc vase nou formate. Se prezintă foliculi de păr individual și glande sebacee.

Cicatrizarea șobolanului la 9 luni după transplantul de epidermocite de șobolan IPA de șobolan.

Imagine clinică. Cicatricile sunt mult mai mici în comparație cu perioadele anterioare, iar media lor suprafata de aproximativ 1,5-2,0 cm ². Cicatricile sunt acoperite inegal de părul subțire, în special în jurul periferiei. Se păstrează scalarea mică a plăcilor mici.

Imagine microscopică.

Epidermul a devenit mai subțire, reprezentând 6-8 rânduri de celule, care amintesc de structura epidermică a pielii normale a șobolanilor, numai densitatea celulelor cu 1 mm. Mai mari și sunt mai mici. Stratul bazal constă din mici celule cu formă rotundă cilindrică. Membrana bazală este bine definită, hemizmosomii sunt clar vizibili. Se remarcă prezența excrementelor epidermice în stratul subepidermic. Stratul papilar este exprimat pe toată lungimea cicatricilor. Aceste fapte indică faptul că, pentru această perioadă de timp, adeziunea keratinocitelor transplantate a devenit mult mai durabilă cu țesuturile subiacente ale rumenului. În consecință, îngrijirea cicatricilor persoanelor cu transplant MALC la 9 luni după transplantul de IPC poate fi tradițională. Sub epidermă sunt fibrele de colagen mai delicate decât în straturile adânci. Au fost multe nave, în special situate superficial. În vasele mai mari, zidurile sunt îngroșate. Foliculii foliari și glandele sebacee în cantități mari. Modelul microscopic seamănă cu un țesut dermic.

Rezultatele muncii experimentale și discuția acestora.

Pe parcursul acestei lucrări pe cicatrici artificiale ale pielii șobolanilor după operație dermabraziune, keratinocitele transplantate în diverse formah- pe suprafețe plăgilor, ca o suspensie în batist și formarea de straturi fără substrat. Lucrarea a fost efectuată în scopul de a obține date morfologice cu privire la efectul de keratinocite alogene transplantate pe cicatrici, precum și determinarea celei mai bune opțiuni de transplant.

Sa constatat că toate cele trei metode de transplantare sunt reale, dar transplantul de IPAA fără substrat este o procedură foarte laborioasă, în timpul căreia IPAC poate fi rănit, ceea ce afectează rezultatele transplantului. Mai mult, această metodă de transplantare exclude munca pe suprafețe mari.

Suspensie de keratinocite Transplant - este semnificativ metoda mai economica nu are nevoie de un celule lung și simplu cultivarea în prezentul exemplu de realizare, contactul folosind preforme batist sterile, ale căror dimensiuni corespund valorii cicatrizare. Lipsa efectului terapeutic în timpul transplantului de suspensie celulară timp de aproximativ o lună în comparație cu MIC asupra acoperirii plăgii nu este un moment semnificativ cu durata tratamentului, calculată în mai multe luni. Se știe că în timpul transplantului IPC la arderea pacienților, transformarea stării structurii pielii a avut loc treptat și pentru câțiva ani. Transplantarea culturii de keratinocite pe acoperirile ranilor este metoda cea mai convenabilă și promițătoare, dar este și mult mai scumpă. În plus, cerând astăzi căutarea unor acoperiri mai sofisticate, care trebuie să fie din material plastic, higroscopic, să aibă proprietăți bacteriostatice sau bactericide și să fie neutru din punct de vedere biologic pentru celule. Filmul „Polipor“ - o versiune intermediară a interne de acoperire rana de film, în ciuda unor neajunsuri, ne-a permis să studieze șobolani transplant experimental keratinocite pe cicatricile și pentru a trage concluzii cu privire la eficacitatea acestei cicatrici direcție atracție.

Autorii care au efectuat transplantul asupra rănilor IPC arse, a remarcat că în timpul primei săptămâni după transplant keratinocitelor rezervor multistratificat la rana igienizate, epiderma se ingroasa si stratificat. Toate straturile epidermei au fost bine definite. Este interesant faptul că numărul de straturi de celule din transplanturi este cu 10-30% mai mare decât în cazul probelor de biopsie cutanată. Autorii au notat apariția granulelor de keratogialină în a 5-a zi după transplantul de MPA, membrana bazală și hemizmosomii - deja în a treia zi.

J. Rives și colab. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov și colab. (1998), a constatat că în timpul primelor perioade următoare de transplant pacientii DMO cu defecte ale pielii polnosloynymi dupa arsuri, comunicarea între derm și epiderma este foarte slabă și este o linie dreaptă, strat papilar este absent. Până la sfârșitul lunii a 2-a începe formarea de papile puțin adânci și fanere pielii, dermul de comunicare epidermicǎ devine mai puternic. Datele din literatură cu transplant alogen govoryato keratinocite pentru rana ars pacienti ca o metodă promițătoare. În ciuda faptului că respingerea keratinocite alogen are loc transmise de diverși autori, în perioada de la 10 zile la 3 luni, cu toate acestea, ele au un rol în vindecarea suprafeței plăgii, eliberând factori de creștere și de închidere mecanică a defectului. Se crede că MPAlK au redus activitatea antigenică, ca atunci când sunt cultivate in vitro pierde in celule Langerhans, care le permite să existe pentru o lungă perioadă de timp în corpul destinatarului. În plus, cultura alogen derivată din piele de oameni tineri sănătoși au un potențial biologic mult mai mare decât cultura autolog a pacienților după traumatisme.

Scopul principal al studiului nostru a fost să aflăm dacă keratinocitele alogene vor supraviețui pe cicatrici și care vor fi schimbările în țesutul cicatricial sub influența unei astfel de "acoperiri a rănilor" din punct de vedere biologic. În cazul unui rezultat pozitiv, elaborați cea mai eficientă tehnologie și cea mai puțin intensivă forță de muncă în acest domeniu de medicină de reabilitare.

Datele obținute de noi în multe privințe s-au dovedit a fi similare datelor din literatura de specialitate cu privire la modificările morfologice care apar în epiderma umană după transferul keratinocitelor alogene pentru arderea rănilor. Dar există diferențe semnificative, atât în ceea ce privește substratul morfologic, care este transplantat, cât și din punct de vedere tehnologic. Deci formarea legăturilor cu membrană și dermice epidermic bazale (poludesmosom, papile) are loc la un moment ulterior, în comparație cu transferul de keratinocite la suprafețele înfășurate fără cicatrice. Aceasta se pare că se datorează alimentării necorespunzătoare a țesuturilor de rumen în comparație cu derma sau fascia musculară. Cicatricul, în special cel vechi, este un țesut conjunctiv dens, cu un număr foarte mic de vase, în partea de jos a plăgii de ars este un țesut de granulație bogat în vase de sânge. Astfel, este evident că condițiile în care au loc transplantul și încorporarea keratinocitelor sunt complet diferite. Cu cât este mai vascularizată zona transplantului de celule, cu atât este mai ușor să le procesăm. Din acest postulate există o concluzie cu privire la preferința de a lucra cu cicatrici tinere, în care țesutul conjunctiv este încă suficient de slab și bogat în vase de sânge.

Ca urmare a acestei lucrări experimentale, se demonstrează că:

1. Este posibil un transplant de MALK la cicatrici. 
2. Metoda optimă de transplant este transplantul de keratinocite pe capacul plăgii.
3. Suprafața cicatricilor trebuie să fie măcinată folosind o dermabraziune operativă utilizând laserul lui Schumann sau un cutter.
4. Sub influența MPALK, are loc epitelizarea rapidă a suprafeței solului de rumen.
5. Cel mai bun țesut cicatrizat vascularizat, adică, cu cât cicatricea este mai mică, cu atât sunt mai bune rezultatele transplantului de keratinocite.
6. Țesutul cicatrician sub influența keratinocitelor transplantate se transformă treptat și se transformă într-un țesut cicatricial (mai friabil, cu înveliș al pielii).
7. Descărcarea graduală a țesutului cicatrician începe cu stratul subepidermic. Îmbunătățește vascularizarea, fasciculele de fibre de colagen din partea superioară și inferioară a rumenii au o locație mai friabilă decât în țesutul cicatrician fără transplant de celule. Există foliculi de păr și glande sebacee. Epidermul în structura sa, după trecerea fazei de hipertrofie, se apropie de epiderma pielii normale.
8. Modificările observate sunt legate de keratinocitele secretate factori de creștere, citokine care imbunatatirea trophism de tesut cicatricial contribuie la transformarea acesteia dintr-un țesut fibros rigid într-o mai laxe, ceea ce conduce la o îmbunătățire a cicatricei.

Astfel, pe baza acestui studiu, se poate concluziona că efectul benefic al keratinocitelor transplantate asupra țesutului cicatricei, care poate fi de importanță practică pentru reabilitarea pacienților cu diferite tipuri de cicatrici.

Această activitate pe șobolani a permis, de asemenea, formularea unor cerințe. La acoperirea plăgilor, pe care se cultivă keratinocitele.

Plăcile pentru răni trebuie să fie:

• biocompatibil cu celulele,
• respirabil,
• au o bază elastică, care formează forma,
• să fie hidrofil,
• deoarece aditivii medicinali conțin medicamente antibacteriene și antioxidanții nu sunt toxici pentru celulele cultivate.

Rezultatele clinice ale tratamentului biotehnologic al cicatricilor.

Anterior, N. Carver și colab. (1993) a constatat că pansamentele ocluzive sunt cele mai bune pentru atașarea la rană și supraviețuirea keratinocitelor, dar nu permit formarea unei epiderme stratificate (mature). Pentru a forma epiderma stratificată, este necesar un mediu aerian. Prin urmare, după atașarea stratului multistrat, s-a sugerat o acoperire ocluzivă după 7-10 pentru a îndepărta și a efectua răni sub bandaje uscate sau unguente solubile în apă. Putem spune că calitatea și proprietățile "substratului" pe care sunt cultivate celulele sunt foarte importante pentru eficacitatea transplantului materialului celular și, în consecință, pentru rezultatele muncii medicilor. Dar nu există nici o rană ideală care să acopere astăzi, în ciuda abundenței opțiunilor propuse (piele artificială, țesătură nețesută de carboximetilceluloză, acoperiri de fibrină, filme semiprepură din poliuretan). Nu este lipsit de importanță în această chestiune costul "substraturilor" (acoperiri speciale ale plăgilor), deoarece costul lor ridicat crește costul total al tratamentului biotehnologic.

Eficacitatea tehnologiilor celulare a fost dovedită până în prezent, însă, din păcate, aceste tehnologii sunt foarte scumpe, în special în țările în care producția industrială de compoziții celulare nu este stabilită. Cu toate acestea, țări precum Statele Unite au stabilit de mult timp o industrie pentru producerea de materiale celulare pentru transplantul de arsuri. În special, compania BioSurface Technology Inc, din 1989, a ridicat 37.000 straturi laminate de keratinocite, care au fost folosite pentru tratamentul 240 de pacienti in 79 de tari din intreaga lume (R.Odessey, 1992) cu 1 cm ² cultura de celule costă circa 7-8 $ SUA.

Tehnologia de tratare a diferitelor boli și probleme de piele are o serie de diferențe, dar în centrul oricărui tratament cu celule este producerea de material celular de calitate și transplantul său.

Acest proces constă în următoarele etape:

• selecție a pielii de la persoanele afectate (sau de la donatori);
• transportul flapsurilor pielii la centrul de biotehnologie,
• izolarea celulelor stratului bazal și multiplicarea acestora,
• acumularea de straturi multiple de keratinocite (IPC).
• transplantul de culturi celulare.

Principala problemă în tratamentul cu transplantul de straturi de keratinocite multistrat este nevoia de celule viabile în toate etapele de transplant de celule. Piesele de piele pentru izolarea celulelor autologe sau alogene trebuie să fie cât mai subțiri, deoarece în acest caz ele sunt mai ușor de separat folosind metode mecanice și enzimatice și pentru a obține o suspensie de celule vii pentru creștere. Acestea pot fi obținute prin tăierea dermatomei sau prin utilizarea pielii pleoapelor, a preputului, a suprafeței interioare a umărului. Dat fiind faptul că celulele sunt sensibile la halogeni (clor, iod), peroxidul de hidrogen, ele nu pot fi folosite în tratamentul pielii la momentul preluării materialului.

Producția cantitativă și calitativă a celulelor din grefe de piele și eficiența cultivării lor depind și de starea de sănătate și de vârsta donatorului. În plus, probele de biopsie cutanată trebuie transmise la laborator cât mai curând posibil și în condiții adecvate (mediu, temperatură) livrate unui laborator certificat și acreditat.

Eagle mediu sau mediu 199 cu adaos de ser de bovine 10%, mediu DMEM suplimentat cu ser fetal de bovine 5% și antibiotice pot fi utilizate pentru a stoca și transporta clapele pielii.

În laboratorul citologic, biopsia cutanată este mai întâi mecanic împărțită în bucăți mici, apoi prelucrarea fragmentelor pielii se efectuează cu ajutorul enzimelor: tripsină, colagenază, dispază etc.

Sub acțiunea enzimelor are loc distrugerea de către desmosomi, iar keratinocitele sunt eliberate în mediu ca celule separate sau agregate compuse din numere diferite de celule. Pentru cultură se utilizează numai keratinocite bazale care sunt cultivate pe medii speciale în incubatoare care conțin 5% CO, în vase Petri sau în flacoane la t = 37 ° C. În 48 de ore, se observă formarea de colonii de keratinocite, care treptat converg într-un monostrat. După obținerea unui număr suficient de celule, suspensia rezultată se întinde pe capacele plăgilor pregătite pentru acest scop și se plasează în vase Petri. Din suspensie, se formează mai întâi un monostrat și apoi un strat multiplu de keratinocite. Schematic, etapele procesului de cultivare a keratinocitelor sunt prezentate în Fig. 12 (33,43,54,65).

Formarea unei formări de keratinocite multistrat adecvată pentru transplant durează de obicei 7-10 zile. Uneori această perioadă este mai lungă, ceea ce depinde de calitatea materialului sursă (vârsta, sănătatea donatorului, corectitudinea materialului, calitatea suportului media utilizat etc.). În cazul în care stratul multistrat supraaglomerate, atunci pe suprafața sa pot exista celule cu fenomene de apoptoză neadecvate pentru transplant. Plăcile Petri, cu culori crescute pe straturi de plăci cu straturi multiple de keratinocite (IPC), sunt livrate clinicii în recipiente speciale la o temperatură de cel puțin + 15 ° C.

Modul modificat al Green pentru creșterea IPC

În lucrarea noastră de acoperire a rănilor am folosit o cambrică cu mai multe straturi, abandonând filmele de polipor cu care am început să lucrăm într-un experiment cu șobolani. Astfel, straturile de keratinocite multistrat au fost cultivate de noi pe batiste prefat și sterile, deși nu este de asemenea acoperirea optimă a plăgii.

Studiile clinice au fost efectuate pe voluntari, cu respectarea normelor etice necesare: semnarea unui tratat și consimțământul în cunoștință de cauză.

1. A fost aplicată cultura proprie (autologă) și preluată din celulele banale (alogenice) keratinocite.
2. Cercinocitele proprii au fost obținute dintr-o bucată de piele tăiată din interiorul umărului pacienților.
3. Funcționarea dermabraziunii cicatricilor a fost efectuată cu ajutorul termocuplurilor, discurilor rotative și a laserului cu erbium.
4. Au fost luate grupuri de pacienți cu cicatrici normotrofice, hipotrofice și hipertrofice.

Procesul tehnologic de aplicare a tehnologiei celulare pentru îmbunătățirea tipului de cicatrici cutanate a constat în următoarele etape:

1. Selectarea pacienților.
2. Explicați esența tratamentului, momentul obținerii rezultatelor așteptate, semnarea unui tratat și consimțământul informat.
3. Numirea pacienților timp de 2 - 3 săptămâni înainte de intervenția chirurgicală se efectuează cu 1 t. De 3 ori pe zi, zinkteral pe 1 t. De 3 ori pe zi.
4. Luând o bucată de piele de 2.0 cm lungime și 0.7-1.0 cm lățime de la suprafața interioară a umărului, ridicată, aproape la baza regiunii axilare, pentru a obține keratinocite autologe.
5. În caz de eșec al pacienților la propria selecție de keratinocite, datorită posibilității de a obține o cicatrice liniară pe suprafața interioară a umărului, materialul celular a fost luat de la banca de celule (keratinocite alogene).
6. Keratinocitele au fost izolate și cultivate în condițiile unui laborator certificat pentru acest tip de muncă.
7. După ce a primit un IPC suficient pentru transplant, a fost administrată o zi de intervenție chirurgicală la cicatricile din clinică, unde materialul a fost adus în recipiente speciale în vase Petri.
8. operație Dermabrazia efectuată de rumen suprafață hemostază sol a fost spălată cu soluție salină sterilă, se usucă, după care se transplantat în steril chembrică IPC „celule în jos.“ Adică celulele care erau superioare în MIC au fost mai mici, adiacente suprafeței lustruite.
9. Un film steril a fost suprapus pe partea superioară, care a fost fixată pe piele cu un bandaj elastic sau cu o bandă elastică Omnifix. În loc de film, pot fi de asemenea utilizate acoperiri indiferente ale plăgii care conțin silicon, de exemplu, plăci Mepitel, Mepiform, gel de silicon.

După 5-7 zile, filmul sau stratul de silicon este îndepărtat. În acest moment, toate keratinocitele trebuie să se târască pe cicatrice lustruite și să se atașeze la suprafața sa.

10. Mediul umed creat sub stratul de film și stratul de silicon contribuie activ la acest lucru. Baptistul care rămâne pe cicatrice din acest punct poate fi impregnat cu gel de tip curios sau chitosan. Ca urmare, în a doua zi, se creează o crustă densă, care, pentru confortul pacientului, este mai bine să se fixeze cu un tencuială elastică, permeabilă la aer, de exemplu Omnifix. Crusta respirabilă permite epidermului nou format să se diferențieze și să devină unul matur.

În funcție de tipul de cicatrice și de adâncimea de măcinare, pansamentul este respins după 8-10 zile. Epiderma în acest moment are 30-40% mai multe straturi celulare decât în pielea normală. Membrana bazală nu este formată. Keratinocitele epidermei îngroșate eliberează o masă de molecule biologic active în țesutul cicatrician.

Succesul tratamentului biotehnologic al cicatricilor depinde în mare măsură de modul în care sunt tratate în perioada postoperatorie. Culturile celulare sunt un tip de "plăcere" de acoperire a plăgii și în primele perioade de după transplant, BMD poate fi ușor de desprins de țesuturile subiacente. Prin urmare, pacienții sunt sfătuiți să aibă grijă de cicatrice după operație. Pentru 8-9 luni, nu frecați și nu uitați să lucrați cu apă fiartă rece pentru a evita ruperea unei epiderme subțiri, nou create, care nu are o strângere strânsă cu țesuturile subiacente.

Notă.

Inainte de operatie si in timpul utilizarii dermabraziunea de oxidanți halogenate și conservanți (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, clorhexidina, peroxid de hidrogen) este permisă înainte de transplantare kletok- absolut contraindicată datorită efectelor citotoxice. Toxic pentru celule sunt, de asemenea, albastru de metilen. Verde strălucitor.

Pentru a evita infecțiile, în special atunci când lucrați cu cicatrici hipertrofice, este posibilă tratarea câmpului de operare cu sulfat de neomicină, polimixină sau gentamicină. Ei nu exercită un efect citotoxic asupra keratinocitelor.

Ca urmare a acestui tratament, se obține un efect triplu.

1. Alinierea suprafeței rumenului.
2. Creați un strat deasupra acestuia a unei noi epiderme, cu o grosime normală.
3. Conversia de tesut cicatricial in dermopodobnuyu prin actiunea de citokine, factori de creștere și alte molecule bioactive secretate de celulele transplantate si keratinocitelor stimulate de acestea, fibroblaste și macrofage.

Cicatala devine mai puțin vizibilă, mai elastică, porii apar în ea, părul de păr, pigmentarea poate fi restabilită datorită prezenței melanocitelor în MPC.

Cu toate acestea, toate aceste momente pozitive din cicatrice nu vin imediat. În acest sens, este necesar să se avertizeze pacienții. Că procesul de transformare a țesutului cicatrizat în dermă este lent și rezultatul optim al unui astfel de tratament nu poate fi așteptat mai devreme de 10-14 luni. Imediat după ce pansamentul este respins, suprafețele lustruite au un policrom pronunțat, cu atât este mai luminos procesul de măcinare. Cea mai mică deteriorare a pielii se produce atunci când se mănâncă cicatricile normotrofice cu un laser cu erbium. Culoarea cicatricilor și a pielii înconjurătoare a fost restaurată în perioada de la 3 la 8 săptămâni. În ciuda unor astfel de precauții, uneori există hiperpigmentare postoperatorie, care poate continua independent timp de câteva luni.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]