Terapia genică nevirală oferă speranță pentru durerea lombară cronică

Într-un studiu recent publicat în journal Biomaterials, cercetătorii au dezvoltat o nouă terapie genică non-virală pentru a trata durerea de spate discogenică (DBP) prin administrarea factorului de transcripție Forkhead Caseta F1 (FOXF1) folosind vezicule extracelulare modificate (eEV) în discuri intervertebrale degenerative (IVD) in vivo.

durerea cronică de spate (LBP) este o problemă globală în creștere din cauza îmbătrânirii populației și a agravării problemelor cu opioide. Tratamentele actuale includ ameliorarea pe termen scurt sau intervențiile chirurgicale costisitoare, subliniind nevoia de terapii care nu creează dependență și mai puțin invazive.

Terapiile biologice actuale, inclusiv administrarea factorului de creștere, terapia celulară și terapiile genetice virale, pot reduce degenerarea la modelele animale și umane. Cu toate acestea, preocupări precum efectele pe termen scurt, eficacitatea slabă pe termen lung și imunogenitatea și tumorigenitatea inutile pot împiedica aplicarea directă a acestor metode.

În acest studiu, cercetătorii au stabilit o terapie genetică non-virală pentru degenerarea discului intervertebral (IVD) folosind FOXF1-eEV.

Cercetătorii au transfectat fibroblaste embrionare primare de șoarece (PMEF) cu o plasmidă care conține FOXF1 sau pCMV6 ca martor și au caracterizat probe eEV utilizând testul de urmărire a nanoparticulelor (NTA).

Ei au evaluat încărcarea eficientă a încărcăturii moleculare în eEV-uri folosind reacția cantitativă în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (qRT-PCR) și PCR convențională. Analiza Western blot a identificat FOXF1 și proteinele EV specifice în formațiunile eEV. Echipa a folosit plasmide care îmbunătățesc regiunile polilinker în amonte și în aval pentru a determina prezența ADN-ului plasmid FOXF1 în celulele donatoare și a generat eEV-uri.

Ei au examinat ARNm de lungime completă produs din ADN-ul plasmidic în eEV-uri și celule donatoare.

Cercetătorii au creat vezicule extracelulare cu factori de transcripție pentru a restabili funcția țesuturilor și a modifica răspunsurile la durere într-un model animal de DBP.

Ei au identificat EV-uri pentru a transporta și distribui FOXF1 pe discurile intervertebrale deteriorate într-un model de șoarece de durere de spate discogenă pentru a determina inhibarea FOXF1 eEV a degenerării discului intervertebral.

Echipa a combinat testele biomecanice ale discurilor intervertebrale de șoarece cu imagini, modificări ale matricei extracelulare (ECM) și răspunsuri la durere evaluate după 12 săptămâni pentru a confirma modificările structurii și funcției, precum și durerea indusă de intervenția terapeutică.

Evaluările durerii preoperatorii și post-tratament au inclus microtomografie computerizată (micro-CT), imagistică prin rezonanță magnetică (RMN), teste mecanice, colorare cu albastru Alcian (AB) și roșu picrosirius (PSR), test cu albastru de dimetilmetilen și imunohistochimie (IHC). ) ).

Studiul a implicat o tehnică chirurgicală în care cercetătorii au injectat Buprenorfină ER subcutanat la șoareci pentru a controla durerea postoperatorie.

Echipa a efectuat evaluări comportamentale înainte de operație și la fiecare două săptămâni, de la patru până la douăsprezece săptămâni după operație, folosind o varietate de tehnici, cum ar fi testul în câmp deschis, placa rece, suspensia de coadă și suspensia de sârmă.

Testul în câmp deschis a evaluat activitatea spontană a șoarecilor; testele pe placă rece au măsurat hiperalgezia termică; Testele de suspensie a cozii au măsurat durerea axială; iar testele de suspensie de sârmă au măsurat rezistența.

La douăsprezece săptămâni după operație, echipa a disecat coloanele lombare ale animalelor, folosind trasarea nervului femural și a arterelor pentru a identifica discurile intervertebrale între L4 și L5, L5 și L6 și L6 și S1 IVD. Ei au folosit L5/L6 IVD pentru a evalua histologia și a determina conținutul de glicozaminoglican (GAG).

EEV-urile FOXF1 au redus în mod semnificativ răspunsurile la durere în timp ce au restabilit structura și funcția IVD, inclusiv îmbunătățirea înălțimii discului, hidratarea țesuturilor, conținutul de proteoglicani și proprietățile mecanice.

Studiul s-a concentrat pe eliberarea de eEV încărcate cu FOXF1 din fibroblastele primare transfectate cu factorul de transcripție FOXF1. PCR cantitativ RT a arătat o creștere semnificativă a nivelurilor de transcript ARNm FOXF1 și a nivelurilor de ARNm FOXF1 transcris pe lungime în comparație cu celulele transfectate cu pCMV6.

Terapia FOXF1 eEV poate reduce răspunsurile la durere într-un model de șoarece cu puncție de disc lombar timp de până la 12 săptămâni. Șoarecii femele au prezentat timpi de achiziție mai lungi în grupul tratat cu FOXF1 decât în grupul cu leziuni, care au durat cel puțin 12 săptămâni după tratament.

Terapia FOXF1 eEV a îmbunătățit hidratarea și înălțimea țesuturilor IVD la animalele rănite și degenerative in vivo, menținând în același timp nivelurile de hidratare și intensitatea imaginii IVD ponderată T2.

Cu toate acestea, echipa a observat o scădere a înălțimii discului la animalele rănite și la animalele tratate cu pCMV6 eEV. Șoarecii tratați cu FOXF1 eEV nu au avut nicio reducere a înălțimii discului la 12 săptămâni după tratament. Sexul nu a influențat rezultatele funcționale.

EEV-urile FOXF1 au restabilit funcția mecanică a IVD-urilor deteriorate și degenerate in vivo. Sub stres axial, IVD-urile tratate cu FOXF1 eEV au prezentat o rigiditate NZ normalizată mai mare în comparație cu IVD-urile deteriorate.

În condiții de fluaj, IVD-urile deteriorate au prezentat deplasări de fluaj normalizate crescute, indicând o scădere a rigidității elastice la fluaj normalizat.

Rezultatele arată că reducerea conținutului de GAG în IVD deteriorate crește flexibilitatea mecanică, dar terapia cu eEV previne pierderea glicozaminoglicanilor și modificările ulterioare ale funcției mecanice.

EEV-urile FOXF1 au provocat modificări structurale și funcționale în IVD prin creșterea nivelurilor de proteoglicani și GAG.

Rezultatele studiului au arătat că eEV încărcate cu factori de transcripție de dezvoltare pot trata bolile articulare dureroase, cum ar fi DBP, prin administrarea acestor factori de transcripție la articulațiile IVD degenerative și dureroase.

Această strategie poate ajuta la reducerea anomaliilor structurale și funcționale cauzate de boală, precum și la reglarea răspunsurilor la durere specifice sexului.

Cercetătorii au recomandat, de asemenea, utilizarea factorilor de transcripție de dezvoltare, cum ar fi FOXF1, pentru a converti celulele NP degenerative într-o stare pro-anabolică in vivo. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a determina eficacitatea sa terapeutică.